艾滋病感染实验室检测.ppt

艾滋病感染实验室检测 HIV相关检测目的 l1.临床诊断 l2.安全输血 l3.流行病学调查、高危人群监测 l4.自愿咨询检测VCT l5.抗病毒治疗后效果检测 l6.抗病毒治疗耐药性检测 l7.免疫功能测定 HIV感染的实验室检测方法 常用HIV病原学检测方法: 1. 核酸检测（ cDNA测定-PCR、 RNA测定-病毒载量） 2. 病毒培养分离 3. P24抗原检测 常用HIV抗体检测方法: 初筛：1.酶联免疫吸附法 ELISA：第三代、第四代 2.快速检测 RT：金标、硒标 3.简单法 PA: 明胶颗粒凝集 确证：免疫印迹法 WB:（Western Blot）、RIBA 其他相关检测方法: 免疫功能测定：CD4/CD8检测 （一）HIV核酸检测 l1. HIV核酸定性检测：通常使用PCR或 RT-PCR技术，用于HIV感染的辅助诊断。 l2. HIV核酸定量检测：使用RT-PCR, NASBA, bDNA等技术，常用于监测HIV感染者 的病程进展和抗病毒治疗效果。 核酸检测特点： 能够用于常规不能培养和分离的病毒的检测（如HBV、 HCV、HIV等）； 仅需少量标本或标本中仅含少量病毒也能检测； 在病毒感染的急性期抗体尚未出现之前，病毒感染的诊断 主要依靠NAT，适用于早期诊断； 可对病毒进行定量检测，有助于疗效监测； 可对病毒基因进行基因分型，比血清分型更有价值； 通过对病毒耐药基因的检测，可预测或发现病毒的耐药性 ； 可用于先天性或围产期获得性病毒感染的诊断； 灵敏度高（可达ng甚至fg水平，理论上能检出单个病毒基 因），特异性好、快速、简捷。 定量NASBA技术： 是由一对引物引导的，连续均一的体外特异核苷酸 序列的等温扩增的酶促反应过程。 优点：操作十分简单，只需将制备好的模板直接加到 反应体系中，恒温41培育1.52小时，即可将模板 扩增109倍。 NASBA反应体系包括AMV反转录酶、RNA酶H、 T7RNA聚合酶、核糖核苷三磷酸、脱氧核糖核苷三磷 酸、两个特异的引物及适宜的缓冲液。 NASBA的反应分为两相：循环相和非循环相。 NASBA图解 引物1 逆转录酶 RNA酶H 逆转录酶 引物 2 T7 RNA多聚酶 引物 2 逆转录酶 逆转录酶 RNA酶 H 引物1 liniar phase amplification phase PCR反应图解 bDNA信号扩增技术 主要包括分枝DNA检测（branched DNA assays）和杂交捕获检测（hybrid capture assays）。 检测时病原模板并不扩增，而是通过 对检测信号的放大来实现对病毒核酸的检 测和定量。 bDNA HIV 核酸检测的反应原理 核酸检测主要应用： 1） 早期诊断围产期HIV感染的辅助诊断： 宫内感染（检测定义）： 新生儿出生48小时内，检测到病毒核 酸，或病毒培养阳性，则提示孕期（宫内）感染。 对围产期感染儿童在18月龄前的早期诊断，目前以2次核酸检测 结果作为辅助诊断的依据。2次不同时间的样本核酸检测均为阳性提 示为HIV感染，均为阴性提示未感染。同时18个月时做抗体检测， 当18个月HIV抗体确证阳性方可诊断 HIV感染。 核酸检测主要应用： l2）对18个月婴儿HIV抗体WB试验的不确定（ 或可疑）结果进一步做辅助诊断； l3）在HIV抗体未产生之前（窗口期）辅助诊断 急性原发感染； l4）HIV亚型分析；确定人群中HIV的变异； l5）监测临床抗病毒药物治疗效果； l6）检测病毒的耐药性突变。 （二）HIV病毒分离培养 l 将病人淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同培 养，适当周期培养后测定培养液HIV p24抗原 /RT，从而判断病人的淋巴细胞是否受到HIV感 染。 l 细胞培养与血清学方法相比，专一性很强， 不会出现假阳性。但其敏感性不如血清学或 PCR。 l 必须在P3级生物安全实验室进行。 HIV病毒分离培养的应用 l1.能得到最原始的临床毒种，其重要意义在于确认对 WB不确定的可疑感染者及母婴传播、婴幼儿HIV感染 者。对法律纠纷或职业暴露明确毒主株亲缘关系。 l2.毒株可用于抗病毒药物筛选，耐药性及其生物学特 性等研究。 l3.用定量细胞培养法可测定细胞的半数感染单位（ TCID50）和半数抑制药物浓度（IC50）用于抗病毒 药物测定。或消毒杀菌药品的效果评价。 l 本法一般不用于常规诊断。 （三）HIV p24抗原测定及适用范围 ： l 是一种血清学夹心法EIA。 l （1） HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断。 l （2）HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助诊断。 l （3）第四代HIV抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反 应，但HIV-1抗体确认试验呈阴性者的辅助诊断。 l （4）监测病程进展和抗病毒治疗效果。 HIV-1 P24抗原检测结果报告和解释 ： l（1）HIV-1 P24抗原的阳性结果必须经过中 和试验确认，若阳性标本的OD值比中和反 应前减少50%以上，才确定为HIV P24抗原 结果阳性。 l（2）HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染的 辅助诊断依据，不能据此确诊。 l（3）HIV-1P24抗原阴性结果只表示在本试 验中无反应，不能排除HIV感染。 （四）HIV抗体检测 l 检测抗-HIV抗体是HIV/AIDS诊断的一项重 要指标，抗-HIV抗体测定作为血清学诊断要求 准确、可靠，必须经初筛、复检试验和确认实 验三个步骤。 l 初筛实验方法主要有：酶联免疫试验（ ELISA）、明胶颗粒凝集试验（PA）、快速免 疫（层析或渗滤）试验（RT）。 l 确认试验主要用免疫印迹试验（ WB）。 抗体检测的目的 l1.输血和移植安全（为了接受者的安全） l2.监测(为了知晓人群流行状况) l3.临床HIV疾病的诊断和VCT检测 (为了知晓 个体感染状况） l 为了达到以上的某个目的的HIV 检测可能不适 合其他目的，比如输血服务的检测不适合临床诊 断HIV感染 固相血清标本酶标记物 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 1、酶联免疫吸附法ELISA原理 第一、二代 第三代 第四代 4th 代3rd 代 = = 1st-2nd 代 HIV 抗原IgM 抗体IgG 抗体 检测线 = 窗口期 HIV感染窗口期 2、快速检测试验（RT） l快速HIV试剂的原理* l颗粒凝集 （Particle Agglutination, PA) l免疫渗漏 （Immunoconcentration, Flow through, FT) l免疫层析 （Immunochromatograpy, lateral flow, IF) l目前在国内批准注册的国外进口试剂有： Determine HIV1/2（ABBOTT，雅培）、Instant CHEK-HIV1+2（EY）、麦美华、中新科炬 l一般10-30min内出结果。 l2003年国内已有产品被SFDA批准。有金豪、万泰 、艾康、科华 l* 用最新快速HIV试剂检测HIV抗体比第三代EIA 晚28天 快速检测试剂的应用 快速检测的优点 1.操作更快 2.不需要成批实验 3.不需要使用特殊仪器 4.检测的当天就给出结果 5.只能采用经过WHO推荐的快速HIV 抗体检测，以确保质量 快速检测的影响因素 检测的目的 实验的敏感性和特异性 受检测人群的HIV的流行率 3、明胶颗粒凝集试验（PA） l PA是一种简便的HIV血清抗体检测方法。 先将样品稀释，然后分别加入经抗原致敏的和 未致敏的明胶颗粒，混匀后保温（一般为室温 ）。 l 操作简便，无需特殊仪器设备，适合对少 量标本的检测。血清中有HIV抗体存在时，经 抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应 ，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。 （二）HIV抗体确认试验 l免疫印迹式验（WB）原理： l WB是将HIV病毒蛋白用SDS-PAGE电泳， 把分子量大小不等的蛋白带分离开来，然后再 把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤 维素膜上。在受检血清中检测能够和一系 列病毒蛋白发生反应的不同的抗体。原理 类似与ELISA试验。 HIV抗体检测策略 l经典程序 初筛+确认 ( ELISA+WB ) l替代程序 策略I 一次ELISA 应用于筛查献血员 策略II 二次ELISA 应用于流行病学监测 策略III 三次ELISA 应用于高流行区临床诊断 HIV检测策略 检测顺序: 首先应选择最敏感的实验 第二次实验应该采用更特异的实验 队列检测与平行检测 队列检测 (最普遍) : l 第一个实验应用高敏感性实验以减少假阴性结果 l 除非第一个实验结果为阳性，否则就不需要做第二 个实验了 平行检测: l 对于每一个样本总是作两种HIV抗体实验 l 这两种实验的抗原靶和方法不同 l 一种实验为高敏感性，另一种为高特异性 HIV抗体筛查试验: ELISA、PA、RT 第1种筛查试剂（高敏感性） 第2种筛查试剂（高特异性） 阳性 阴性 阳性 阴性 第3种筛查试剂（高特异性） 提供疑似阳性咨询建议 进一步做确认试验 确认试验 阳性 阴性 阳性 阴性不确定 提供咨询随访，建议3个月 后再次做确认试验 出具“HIV抗体阳性”报告提 供咨询、指导、随访 出具“HIV抗体阴性”报告提 供咨询、指导常规孕期保健 知情同意选择妊娠结局 检测前咨询，知情同意 对VCT、孕妇进行HIV检测策略（常规） 同时用两种不同的快速检测试剂进行HIV 抗体筛查试验 若产妇已临产，且只能用一种快速试 剂检测，结果阳性。 两个均阴性一阴一阳或两个均阳性 检测后咨询，解释结果 正常分娩 检测后咨询，知情同意选择干预措施 孕妇临产后/分娩前服用NVP200mg 产后进行HIV确认试验产后暂时无法进行确认试验时 阳性 检测前咨询，知情同意 对临产产妇和急诊病人进行HIV检测策略 婴儿12个月进行HIV抗体筛查试验 阴性阳性 用另一种筛查 试剂再次检测 阴性阳性 排除儿童感染常规儿童保健18个月时再进行HIV抗体筛查试验 对父母检测前咨询，知情同意 对HIV感染的产妇分娩的婴儿HIV检测策略 排除儿童感染常规儿童保健 阴性阳性 用另一种筛查试 剂再次检测 确认试验 阴性 阴性 阳性 纳入当地艾滋病综合防治系统 18个月时再进行HIV抗体筛查试验 检测结果的报告和处理1 l1、HIV抗体筛查 l筛查试验呈阴性反应出具HIV抗体阴性报告。 l筛查试验呈阳性反应，可出具“HIV抗体待复查”报告，不能出阳性报告。同时 应尽快进行以下处理： l（1）认真核对病人身份，填写HIV抗体复查送检单，检测人和审核人签字。 l（2）尽可能重新采集受检者的血样。 l（3）将二份血样（或仅原血样）连同HIV抗体复查送检单一并送当地艾滋病 l 筛查中心实验室或直接送确认实验室确认。 l（4）筛查中心实验室应尽快用两种试剂进行复测，如结果均阳性或一阴一 l 阳，则应将送检标本和HIV抗体复查送检单一并送艾滋病确认实验室确 l 认。如复检结果均为阴性，在送检单上盖上“HIV抗体阴性（一）”字样 l 图章，并及时将结果反馈送检单位，不必再送确认实验室。 l（5）做好检测后咨询。 检测结果的报告和处理2 l2、HIV抗体确证 l确证试验呈阴性反应出具HIV抗体阴性报告。 l确证试验呈阳性反应，认真核对身份后可出具HIV 抗体阳性报告。做好检测后咨询和阳性告知工作 ，同时应尽快按照传染病法要求向有关部门报告 疫情。 l确证试验结果不确定，做好检测后咨询，要求定 期随访。 检测前咨询要点 l建立咨询关系，强调保密，了解求询者的要求。 l评估求询者的感染危险性。 l评估求询者有关艾滋病知识的水平和应付危机的能力。 l提供必要的知识和信息。 l解释检测方法，解释“窗口期”，说明检测过程。 l讨论检测可能带来的利弊，阳性或阴性结果的意义和潜在 的后果，获得知情同意。 l进行预防知识教育：如何改变行为可以减少感染的危险或 减少把感染传给他人的危险。 l预约检测后咨询时间。 危险因素评估 1.性行为：具体的性活动方式、性伴数量、性活动频度 、使用安全套的情况和性伴感染的可能性。特别要注意 某些高危行为，如多性伴关系，无保护性交或肛交，性 病史。 2.吸毒行为：吸毒方式、注射器具消毒、共用注射器等 。 3.其他接触血液的行为： 输血或血制品史，有无采供血（浆）史、器官移植史或 者被血液污染器具刺伤、纹身、穿耳等等； HIV检测阴性结果咨询 q核实求询者的身份、血液标本标签和记录，提供HIV阴性检测结果； q核实在窗口期内的可能暴露