[理化生]第1章核酸.ppt

第一章 核酸 第一章 核酸化学 第一节 核酸概述 第二节 核酸的分子组成 第三节 核酸的分子结构 第四节 核酸的理化性质 第一节第一节 核酸概述核酸概述 以核苷酸为基本组成单位的生物大 分子，携带和传递遗传信息。 核酸核酸( (nucleic acidnucleic acid) ) u核糖核酸 (ribonucleic acid, RNA) 分子量几万几百万； u脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA) 分子量1.6106-2.2109。 u1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质 u1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构 u1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶 u1981年 Gilbert和Sanger建立 DNA 测序方法 u1985年 Mullis发明 PCR 技术 u1990年 美国启动人类基因组计划(HGP) u2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架 u2003年 美、英等国完成人类基因组序列图 一、核酸的发现和研究工作进展 1869年, J F Miescher 从白细胞的 细胞核中提取出一种成分，命名为核 素（nuclein）。1870年从鲑鱼精子中 也提取出核素。 1881 Edward Zacharias 证明染色 体是由核素组成的。 1889 Miescher的学生Richard Altmann将核素更名为核酸（nucleic acid）。 肺炎双球菌实验（ Avery ，1944） O. T. Avery Phage 1: 35S labeled protein Phage 2: 32P labeled DNA 噬菌体实验(1952) A. Hershey M. Chase 二、核酸的种类、分布及功能 DNA的分类及功能：双（单）链、环/线性 二、核酸的种类、分布及功能 RNA的分类及功能 二、核酸的种类、分布及功能 （1）RNA的种类 RNA的分类及功能 二、核酸的种类、分布及功能 mRNA 半寿期短 5S/16S/23S（原核） 5S/5.8S/18S/28S（真） 最多 最少 较少 5%-10% 蛋白质合成模板 rRNA 75%-80% 蛋白质合成场所 tRNA 分子量最小 稀有碱基多 氨基酸运输 种类 含量 功能 其他 10%-15% 一、核酸的元素组成 第二节 核酸的分子组成 二、核酸的化学组成 三、核苷（三、核苷（nucleosidenucleoside） 四、核苷酸(ribonucleotide) u主要元素组成：C、H、O、N、P(9-11%) 与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量 较为稳定，占9-11%。通过测定P的含量来推算 核酸的含量（定磷法）。 一、核酸的元素组成 二、核酸的化学组成 u核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱基三部分构成 戊 糖 核糖 2-脱氧核糖 基 本 碱 基 嘌呤 胞嘧啶(C) 尿嘧啶(U) 胸腺嘧啶(T) 腺嘌呤(A) 鸟嘌呤(G) 嘧啶 稀稀 有有 碱碱 基基 核酸中也存在一 些不常见的稀有 碱基，稀有碱基 种类很多，大部 分是上述碱基的 甲基化产物。 tRNA中含有较多 的稀有碱基。 碱基的结构特征碱基的结构特征 u嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系， 在紫外区有吸收（260 nm左右）。 DNA、RNA组成异同 三、核苷（三、核苷（nucleosidenucleoside） 嘌呤（N9-H）或嘧啶（N1-H）与糖（C1）上半 缩醛羟基脱水缩合而成的化合物。糖与碱基之间的 化学键称为C-N糖苷键。 稀有核苷 稀有碱基 稀有核糖 连接方式不同 四、核苷酸(ribonucleotide) 核苷和磷酸以磷酸酯键连接形成的化合物 DNA中常见核苷酸 RNA中常见核苷酸 核苷酸的其他形式 u核苷多磷酸（NDP、NTP) AMP ADP ATP 核苷酸的其他形式 u核苷多磷酸（NDP、NTP) u环化核苷酸（cAMP、cGMP等） 核苷酸的其他形式 u核苷多磷酸（NDP、NTP) u环化核苷酸（cAMP、cGMP等） u辅酶或辅基类核苷酸 NAD、NADP、FAD、CoA等均含有AMP u活性代谢物 u（UDPG、CDP-胆碱等） 核苷酸链 第三节第三节 核酸的分子结构核酸的分子结构 一、DNA的分子结构 二、RNA的分子结构 （一）核酸的一级结构（primary structure） u一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及连接方 式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。 1、核苷酸的连接方式： 3, 5- 磷酸二酯键 2、核酸的基本结构形式：多核苷酸链 末端： 5 端、 3 端 多核苷酸链的方向： 5端3端(由左至右) 3、表示方法：结构式、线条式、文字式 一、DNA的分子结构 核酸一级结构的表示法 （1）结构式 （2）线条式 （3）文字式 测序图 DNA测序仪（ABI3730） u碱基组成分析Chargaff 规则： A = T；G = C u碱基的理化数据分析：A-T、G-C以氢键配 对较合理 uDNA纤维的X-线衍射图谱分析 1、DNA双螺旋结构的研究背景 （二）DNA的二级结构（secondary structure） 一、DNA的分子结构 碱基组成规则(Chargaff规则) nA=T，G=C；A+G=T+C 嘌呤与嘧啶的总数相等 n有种属特异性，无组织、器官特异性 可用不对称比率（A+T/G+C）的相近程度表示种间 亲缘关系的远近。 n不受年龄、营养、性别及其他环境等影响 （二）DNA的二级结构（secondary structure） 一、DNA的分子结构 u双螺旋结构是DNA二级结 构的最基本形式。 1953年2月28日，Waterson 和Crick用金属线制出的DNA 模型 M. Wilkins （1）DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链(简称DNA 单链)组成。两条链沿着同一中心轴平行盘绕，形成右 手螺旋。 （二）DNA的二级结构（secondary structure） 一、DNA的分子结构 2、DNA双螺旋结构（double helix model）的特点 右手性的定义示意图。大姆指指向轴向，其他四、 指由掌根向指尖方向表示螺旋转动方向。 杭州植物园 百草园中一株人 为左手性的常青 油麻藤( Mucuna sempervirens ) ，被缠绕的“植 物”是一根人造 的水泥柱。 （2）嘌呤和嘧啶 碱基位于螺旋的 内侧，磷酸和脱 氧核糖基位于螺 旋外侧。碱基环 平面与螺旋轴垂 直，糖基环平面 与中轴平行。 （二）DNA的二级结构（secondary structure） 一、DNA的分子结构 2、DNA双螺旋结构（double helix model）的特点 （3）螺旋横截面 的直径约为2nm， 每条链相邻两个碱 基平面之间的距离 为0.34 nm，每10 个碱基对（bp）形 成一个螺旋，其螺 矩为3.4 nm。 （二）DNA的二级结构（secondary structure） 一、DNA的分子结构 2、DNA双螺旋结构（double helix model）的特点 （二）DNA的二级结构（secondary structure） 一、DNA的分子结构 （4）碱基互补：维持DNA链 相互结合的力是链间氢键。 碱基结合具有严格的配对规 律:A与T通过两个氢键结合， G与C通过三个氢键结合。 2、DNA双螺旋结构（double helix model）的特点 （5）螺旋表面形成大 沟(major groove)及小沟 (minor groove)，彼此相 间排列。小沟较浅；大 沟较深，是蛋白质识别 DNA碱基序列的基础。 （二）DNA的二级结构（secondary structure） 一、DNA的分子结构 2、DNA双螺旋结构（double helix model）的特点 3、影响DNA双螺旋稳定性的作用力 u碱基堆积力（疏水作用力和范德华力） 电子云交错使双 螺旋结构内部形成一个大疏水区，与介质中水分子隔开， 有利于互补碱基间形成氢键，维持螺旋纵向稳定。 u氢键 互补碱基对间供氢体（氨基、羟基）与受氢体（酮基 、亚氨基）之间形成非共价键，维持螺旋横向稳定。 u离子键 带负电荷的磷酸基团之间及其与溶液离子之间的电 荷作用 u碱基分子内能 分子内能增加降低结构稳定性 （二）DNA的二级结构（secondary structure） 一、DNA的分子结构 * 改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。 T=A CG 碱 基 配 对 u碱基分布均匀：堆积稳定 u较高的G-C含量：氢键多 u盐溶液保存：磷酸基团与介质阳离子的作用降 低磷酸之间的排斥 u较低的温度：降低碱基分子内能 维持DNA双螺旋结构稳定 4、DNA二级结构的多态性 在多核苷酸链中，脱氧核糖的五员环能折叠成多种 构象，此外，分子还可绕CN糖苷键以及3，5-磷酸二 酯键旋转一定的角度，这就使具有同样碱基配对的DNA 双螺旋可以采取另一些构象，DNA构象上这种差异称为 多态性。 （二）DNA的二级结构（secondary structure） 一、DNA的分子结构 uB-DNA （相对湿度为92%时DNA的构象） uA-DNA (相对湿度为75%时B-DNA就转变成A-DNA） uC-DNA (相对湿度为66%时就转变成C-DNA） uZ-DNA （左手双螺旋，在基因表达调控及基因重组 方面有重要作用） uH-DNA (三链DNA，可能与基因表达调控有关) DNA二级结构的多态性 RNA-DNA杂交双链以及RNA双螺旋区具有与A DNA相似的结构。 螺旋方向右手右手左手 直径nm2.552.01.8 bp/螺旋111012 螺距2.533.44.56 碱基升高0.230.340.38 bp平面倾角 2009 双螺旋结构的其他类型 三链DNA 多聚（dA）-多聚（dT）具有类似B-DNA的结构，提高其环 境中的盐浓度（或降低相对湿度），它的双螺旋结构就歧 化成三链结构和一条多聚脱氧核苷酸链。DNA的三链结构 可能与基因表达调控有关。第三股链的存在可能阻碍了一 些调控蛋白或RNA聚合酶与DNA的结合。 Hoogsteen配对 一、DNA的分子结构 （三）DNA的三级结构 双螺旋进一步扭曲,形成一种比双螺旋更高层次的空间 构象。包括：线状DNA形成的纽结、超螺旋和多重螺旋 、环状DNA形成的结、超螺旋和连环等。 u1965年Vinograd等用电镜 发现SV40和多瘤病毒的环形 DNA的超螺旋-双螺旋的螺旋 正超螺旋(positive supercoil) 负超螺旋(negative supercoil) 1、原核生物 一、DNA的分子结构 （三）DNA的三级结构 u天然DNA都呈负超螺旋 正超螺旋： 通过旋紧双螺 旋而形成的过 旋DNA会自动 产生左旋的超 螺旋，以解除 外加的旋转造 成的胁变。 旋转结果 加大了DNA分 子内部张力， 有紧旋效应。 负超螺旋： 通过放松双螺 旋而形成的欠 旋DNA会自动 产生右旋的超 螺旋，以解除 外加的旋转所 造成的胁变。 旋转结果 使DNA分子内 部张力减小， 有松旋效应。 White方程-环绕数和超螺旋的关系 2、DNA在真核生物细胞核内的组装 核小体(nucleosome)：由DNA和组蛋白构成。 u组蛋白核心：H2B， H2A, H3, H4 各两分子。 uDNA：以负超螺旋缠绕在 组蛋白上(绕约1.75圈） uH1组蛋白在核小体之间 u核小体直径11nm 一、DNA的分子结构 （三）DNA的三级结构 染色体的串珠结构 染色体-核糖核蛋白体 核小体链（ 11nm，每个核小体200bp） 纤丝（ 30nm，每圈6个核小体） 突环（ 150nm，每个突环大约75000bp） 玫瑰花结（ 300nm ，6个突环） 螺旋圈（ 700nm，每圈30个玫瑰花） 染色体（ 1400nm） 从 DNA 到 最 后 凝 缩 成 染 色 体 ， 压 缩 近 万 倍 真核生物染色体DNA 组装不同层次的结构 DNA（直径2nm） 二、RNA的分子结构 RNA的基本结构特点 uRNA是单链分子。嘌呤总数不一定等于嘧啶总数。 u“发夹型”结构。RNA分子中部分区域也能形成双 螺旋结构，不能形成双螺旋的部分形成单链突环。 u碱基配对不如DNA严格。G除了可以和C配对外，也 可以和U配对。G-U配对形成的氢键较弱。 u存在一些稀有碱基。tRNA中较多，这类碱基大部分 位于突环部分。 RNA结构层次 1、tRNA的一级结构特点 二、RNA的分子结构 （一）tRNA的结构与功能 u含 10-20% 稀有碱基，如DHU; u3末端为CCA-OH; u5末端大多数为G; u氨基酸臂 uDHU环 u反密码环 u额外环 uTC环 2、tRNA的二级结构三叶草形 二、RNA的分子结构 （一）tRNA的结构与功能 3、tRNA的三级结构倒L型 二、RNA的分子结构 （一）tRNA的结构与功能 活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。 4、tRNA的功能 二、RNA的分子结构 （二）tRNA的结构与功能 二、RNA的分子结构 （二）rRNA的结构与功能 u结构：基本上都是由 部分双螺旋与部分突 环相间排列而成。 u功能:与多种蛋白组 成核蛋白体，作为蛋 白质合成的场所 （三）mRNA的结构与功能 mRNA种类繁多，含量低，半衰期短，分子大 小不一，可形成链内发夹结构。不同细胞类型 或细胞在发育的不同时期存在不同种类的mRNA 。 二、RNA的分子结构 （三）mRNA的结构与功能 1、原核生物mRNA的结构 多顺反子：一条mRNA往往含有几个功能上相关的蛋 白质的编码序列，可翻译出几种蛋白质。 二、RNA的分子结构 5 非编码区 引导序列 编码区 3非编码区 引导序列 编码区编码区 非编码的间隔区 （三）mRNA的结构与功能 2、真核生物mRNA的结构 二、RNA的分子结构 单顺反子结构： 一个mRNA分子只包含一条多肽链的编码信息。 （三）mRNA的结构与功能 2、真核生物mRNA的结构 大多数真核mRNA具有特征末端结构 5末端的帽子结构（m7GpppNm ) 3末端的多聚腺苷酸(polyA) 二、RNA的分子结构 组蛋白等例外 帽子结构和多聚A尾的功能 3、mRNA的功能 （三）mRNA的结构与功能 二、RNA的分子结构 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则， 抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基 酸排列顺序。 （四）其他小分子RNA及RNA组学 u种类：核内小RNA； 核仁小RNA； 胞质小RNA； 催化性小RNA；小片段干涉 RNA u功能：参与hnRNA和rRNA的加工和转运。ncRNA在基因 表达以及应激信号传导等方面起着重要的调节作用。因此 ，有人也将其称为调节RNA（regulatory RNA）。 二、RNA的分子结构 除上述三种RNA外，细胞不同部位存在其他种类的小分子RNA ，统称为非mRNA小RNA (small non-messenger RNAs, snmRNAs)或非编码蛋白质RNA (non-coding RNA, ncRNA) 。 RNA组学（RNomics） : （四）其他小分子RNA及RNA组学 二、RNA的分子结构 RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和 功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞 在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间 和空间特异性。 第四节第四节 核酸的理化性质核酸的理化性质 一、一般性质 二、紫外吸收 三、变性、复性、分子杂交 1、提纯的DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，两者都 微溶于水，不溶于一般有机溶剂（如乙醇、异丙醇）。 2、DNA分子由于直径小而长度大，因此溶液粘度极高，RNA 分子粘度则小得多。 3、溶液中核酸在引力场中可以下沉，沉降速度与分子量和 分子构象有关。可用超速离心技术测定核酸的沉降常数。 4、核酸是两性电解质，因磷酸的酸性强，常表现酸性。由 于核酸分子在一定酸度的缓冲液中带有电荷，因此可利用 电泳进行分离和研究其特性。最常用的是凝胶电泳。 一、一般性质 核 酸 电 泳 胶 利用核酸解离后的带电性质进行电泳分离 P 二、紫外吸收 碱基有共轭大键 二、紫外吸收 减色效应：核酸的光吸收值常比其各核苷酸成 分的光吸收值之和少3040%，这是在有规律的 双螺旋结构中碱基紧密地堆积在一起造成的。 u核酸最大吸收波长：260nm n 应用：核酸定性、定量分析 OD260的应用 1、DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA； 40g/ml单链DNA(或RNA)； 20g/ml寡核苷酸。 2、判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 紫外分光光度计 三、变性、复性、分子杂交 1、DNA变性（DNA denaturation） 方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺 以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。 DNA变性是指在理化因素作用下，DNA分子中的氢 键断裂，碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体， 双链分开形成单链的过程。 核酸变性不涉及共价键的断裂，共价键（3, 5- 磷酸二酯键）的断裂称为核酸的降解。 uDNA变性的本质是双链间氢键的断裂 DNA变性 u增色效应：DNA变 性时其溶液OD260增 高的现象。 220240260280 0.1 0.2 0.3 0.4 波长（nm） 光 吸 收 1 2 3 天然 DN A 核苷酸总 吸收值 变性 DN A 熔解温度/熔点（melting temperature,Tm）：D