现代生物技术_09.生物技术与人类健康.ppt

9生物技术与人类健康 学习目的 认识医学领域是现代生物技术应用最广泛、 成绩最显著、发展最迅速的领域。了解生物技术对 疫苗生产、疾病诊断、生物制药等领域的影响；了 解生物技术对人类健康、延长人类寿命、提高生活 质量所具有的不可估量的作用。 医药卫生领域是现代生物技术应用最广泛、 成绩最显著、发展最迅速、潜力也最大的一 个领域。 生产常规方法不能生产的药品或制剂。 生产灵敏度高、反应专一、实用性强的临床 诊断新试剂。 提供安全性能好、免疫能力强的新一代疫苗 。 生物技术与人类健康 9 9 生物技术与人类健康生物技术与人类健康 引言 广义的疫苗是指将病原微生物（如细菌、立克次 氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、 灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染 病的自动免疫制剂。其中，由细菌制成的称为菌 苗；由病毒、立克次体、螺旋体等制成的称为疫 苗。 9.1 9.1 生物技术与疫苗生物技术与疫苗 9.1.1 9.1.1 疫苗概说疫苗概说 生物技术与人类健康 9 9 生物技术与人类健康生物技术与人类健康 公元10世纪，在宋朝的真宗时代，我国 就有了接种人痘预防天花的记载。 1796年英国医生Jenner发现用牛痘代替 人痘接种同样可预防天花。 特点：直接用未减毒的病原体作为疫苗。 生物技术与人类健康 9.1.1 疫苗概说 疫苗的发展历史疫苗的发展历史 早期疫苗 第一代疫苗 19世纪中叶，法国科学家Parsteur首先 发明了减毒疫苗的制备技术。用病原体减毒 或弱化制成疫苗，称之为第一代疫苗。 特点：以减毒、弱化或灭活的病原体做 疫苗。 生物技术与人类健康 9.1.1 疫苗概说 第二代疫苗 (基因工程疫苗 ) 将病原体的抗原（某种蛋白质）基因 克隆在细菌或真核细胞内，利用其生产的 病原体抗原作为疫苗。 特点：利用病原体的 某些抗原成分作为疫苗。 生物技术与人类健康 9.1.1 疫苗概说 第三代疫苗 (核酸疫苗 ) 将含有编码病原体抗原基因序列的质 粒载体直接作为疫苗，经肌肉注射或微弹 轰击等方法导入体内，通过宿主细胞表达 系统表达抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗 原蛋白的免疫应答。 特点：用含有病原体抗原基因序列的 质粒载体直接作为疫苗。 生物技术与人类健康 9.1.1 疫苗概说 DNA Vaccines plasmid Muscle cell Gene for antigen Muscle cell expresses protein - antibody made CTL response DNA Vaccines Plasmids are easily manufactured in large amounts DNA is very stable DNA resists temperature extremes so storage and transport are straight forward DNA sequence can be changed easily in the laboratory. This means that we can respond to changes in the infectious agent By using the plasmid in the vaccinee to code for antigen synthesis, the antigenic protein(s) that are produced are processed (post-translationally modified) in the same way as the proteins of the virus against which protection is to be produced. This makes a far better antigen than purifying that protein and using it as an immunogen. DNA Vaccines Mixtures of plasmids could be used that encode many protein fragments from a virus/viruses so that a broad spectrum vaccine could be produced The plasmid does not replicate and encodes only the proteins of interest No protein component so there will be no immune response against the vector itself Because of the way the antigen is presented, there is a CTL response that may be directed against any antigen in the pathogen. A CTL response also offers protection against diseases caused by certain obligate intracellular pathogens (e.g. Mycobacterium tuberculosis) DNA Vaccines Possible Problems Potential integration of plasmid into host genome leading to insertional mutagenesis Induction of autoimmune responses (e.g. pathogenic anti-DNA antibodies) Induction of immunologic tolerance (e.g. where the expression of the antigen in the host may lead to specific non-responsiveness to that antigen) Ab Ag 静止B 细胞 辅佐细胞 ( 巨噬细胞） 静止T 细胞 病原微生物 激活 记忆B 细胞 浆细胞 活化的T细胞 激活 9.1.2 9.1.2 免疫系统及疫苗的作用机理免疫系统及疫苗的作用机理 生物技术与人类健康 9.1 生物技术与疫苗 艾滋病 ：人类和灵长类动物免疫缺陷型严 重疾 病。1999年，全世界已有3400万人 感染了艾滋病病毒，其中1600万人死于艾 滋病。每天估计有1.6万人受到感染。 乙型肝炎：乙型肝炎患者及健康带毒者在 我国大约有1.3亿人，每10个人就有一个 。 流感病毒：人类的常见病和多发病。 生物技术与人类健康 9.1 生物技术与疫苗 9.1.3 9.1.3 病毒性疾病的疫苗病毒性疾病的疫苗 19811981年年EdmanEdman等克等克 隆了该抗原基因并大隆了该抗原基因并大 量表达。量表达。 美国、日本采用酵母 表达系统生产表面抗 原而制成 疫苗。 以色列等国采用仓鼠 细胞生产疫苗。 我国可采用以上两种 表达系统生产疫苗。 9.1.3.1 9.1.3.1 肝炎病毒疫苗肝炎病毒疫苗 乙型肝炎病毒（HBsAg） 生物技术与人类健康 9.1.3 病毒性疾病的疫苗 New Methods Recombinant DNA Single gene (subunit) S-antigen mRNA cDNA Express plasmid S-antigen mRNA protein Hepatitis B vaccine raised in yeast 国外已有甲型肝炎病毒灭活疫苗面市 。 我国使用的减毒疫苗也取 得了很好的效果。国内基 因工程空壳甲肝病毒及痘 苗活病毒疫苗也显示了很 好的免疫原性。 生物技术与人类健康 9.1.3.1 肝炎病毒疫苗 甲型肝炎病毒 戊型肝炎是乙肝和甲肝之外的又一种重要的病 毒性肝炎。在临床症状上与甲肝相似, 患者有明 显的乏力、食欲减退、恶心、呕吐，部分患者 可出现黄疸。 接种疫苗是预防戊肝的最好办法。不过，迄今 为止世界上仍未有疫苗获批上市。厦门大学国 家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心科 研人员经过艰苦的联合攻关，首次成功地利用 大肠杆菌表达系统获得了戊型肝炎类病毒颗粒 ，目前正准备进入III期临床试验。如果获得成 功，该疫苗将成为继乙肝疫苗之后,世界上第二 个基因工程病毒疫苗。 生物技术与人类健康 9.1.3.1 肝炎病毒疫苗 戊型肝炎病毒 丙型肝炎是由丙肝病毒（HCV）所引起，是通 过输血或血制品、破损的皮肤和黏膜、静脉注 射毒品、性传播、母婴传播等传染引起的。丙 型肝炎病毒感染后，大部分患者转为慢性肝炎 ，其中部分患者可发展为肝硬化甚至肝癌。对 感染者的危害远大于乙肝病毒感染。 由于丙型肝炎病毒目前尚未能培养成功。而且 丙肝病毒还存在着高突变率，尤其是包膜区的 多变性，目前已知至少存在6种不同基因型的病 毒，各型之间的异源性高达25%30%，给丙 肝疫苗的研究带来了重重困难。这也是为什么 至今仍未见有丙肝疫苗上市的原因之一。 生物技术与人类健康 9.1.3.1 肝炎病毒疫苗 丙型肝炎病毒 生物技术与人类健康 9.1.3 病毒性疾病的疫苗 9.1.3.2 艾滋病病毒疫苗 HIV模式图 艾滋病疫苗的研究主要是通过克隆病毒外 膜蛋白和gp160及gp120基因后在不同的 表达系统中表达，以获得基因工程疫苗 。 目前该疫苗大多处于临床试验阶段,尚未大 规模使用。 生物技术与人类健康 9.1.3.2 艾滋病病毒疫苗 电子显微镜 下的HIV 小儿麻痹症疫苗 小儿麻痹症是由脊髓灰质炎病毒引起 的中枢神经系统疾病。通过基因工程方法 改变脊髓灰质炎病毒的基因结构，获得弱 化了的脊髓灰质炎病毒，用它研制成了小 儿麻痹口服疫苗。通过基因工程方法制得 脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白VP1、VP2和 VP3作为注射疫苗。 生物技术与人类健康 9.1.3 病毒性疾病的疫苗 9.1.3.3 9.1.3.3 其他病毒性疾病疫苗其他病毒性疾病疫苗 10000 1000 100 1 0 1 0 Reported cases 195 0 19551960196 5 197 0 1975 Killed (Salk) vaccine Total cases Sweden and Finland 流感疫苗 流感病毒极易发生变 异, 能逃避抗体的作用。 所以长期未有有效的疫 苗面市。1993年Ulmer 首先将流感病毒高度保 守的NP基因插入质粒中 制成核酸疫苗免疫小鼠 ，并取得了令人满意的 效果。 生物技术与人类健康 9.1.3.3 其他病毒性疾病的疫苗 流感病毒 狂犬病疫苗 狂犬病疫苗是继天花之后，人类最早应 用的第二个疫苗。狂犬病疫苗经历了脑组 织细胞培养、基因工程、合成肽及抗独特 型抗体疫苗等几个发展阶 段。最近又发展了动物实验效 果较好且更为安全的金丝雀痘 病毒活疫苗。 生物技术与人类健康 9.1.3.3 其他病毒性疾病的疫苗 狂犬病毒 疱疹病毒疫苗 EB（Epstein-Barr）病毒是5种疱疹病 毒之一。在非洲，这种病毒主要侵染B淋巴 细胞引起波克梯氏淋巴瘤，在地中海地区 及包括我国在内的亚洲地区则主要浸染口 、咽上皮细胞引起鼻咽癌。现在已成功地 构建EB病毒膜抗原的重组痘苗病毒，以及 中国仓鼠表达系统，并完成了成人、儿童 和幼儿的免疫观察。 生物技术与人类健康 9.1.3.3 其他病毒性疾病的疫苗 Smallpox天花 Mummies China/India Crusaders W Europe: fatality rate 25% History changed: Cortes Louis XIV Smallpox Variolation 1% v. 25% mortality Life-long immunity: No drift or shift (proof reading) UK: 1700s China 1950 Pakistan/Afghanistan/Ethiopi a 1970 Smallpox Vaccination Jenner 1796 : Cowpox/Swinepox 1800s Compulsory childhood vaccination 1930s Last natural UK case 1940s last natural US case 1958 WHO program October 1977: Last case (Somalia) 将多种病原体的相关抗原融合在一起，产 生一种带有多种病原体抗原的融合蛋白。 将多种病原体相关抗原克隆在同一个载体 （多价表达载体）上。 美国于1986年10月首先研制了一种含有 疱疹病毒、肝炎病毒和流感病毒的疫苗。 生物技术与人类健康 9.1.3 病毒性疾病的疫苗 9.1.3.4 9.1.3.4 基因工程多价疫苗基因工程多价疫苗 霍乱疫苗接种已有 100多年的历史，传 统疫苗是采用肌肉注 射的灭活或减毒霍乱 弧菌菌体苗。效果不 佳，副作用大，已被 WHO宣布不再推荐 此疫苗的应用。 9.1.4.1 9.1.4.1 霍乱弧菌疫苗霍乱弧菌疫苗 生物技术与人类健康 9.1 生物技术与疫苗 9.1.4 细菌性疾病的疫苗 根据霍乱弧菌的致病机理，科学家们利用 基因工程技术研制了重组B亚单位疫苗， 是已被WHO推荐应用的疫苗。 我国军事医学科学院生物工程研究所经过 十多年的研究研制出了国家一类新药rBS- WC口服霍乱疫苗，并已上市。 生物技术与人类健康 9.1.4.1 霍乱弧菌疫苗霍乱弧菌疫苗 Identification Vibrios are highly motile, gram- negative, curved or comma-shaped rods with a single polar flagellum, whose natural habitat is usually salt or fresh water. Caused by miasma Misguided Notions Prevented by alcohol Could be spread by contact with patient or patients clothes Misguided Notions V. Cholerae Afflicted Areas (2000) Transmission Contaminated food or water Inadequate sewage treatment Lack of water treatment Improperly cooked shellfish Transmission by casual contact unlikely Epidemics Fecal-oral transmission Feces of infected person contaminates water supply Resulting diarrhea makes it easy for bacteria to spread in unsanitary conditions Symptoms Occur 2-3 days after consumption of contaminated food/water Usually mild, or no symptoms at all 75% asymptomatic 20% mild disease 2-5% severe Vomiting Cramps Watery diarrhea (1L/hour) Without treatment, death in 18 hours- several days Vaccines Need localized mucosal immune response Oral Vaccine Not recommended Travelers have very low risk of contracting disease: 1-2 cases per million international trips Not cost-effective to administer vaccines in endemic regions Brief and incomplete immunity Two types approved for humans: Killed whole-cell Live-attenuated Vaccines: Killed Whole-cell Vaccines Provides antigens to evoke protective antitoxic and antibacterial immunity Contains: 1 x 1011 heat inactivated bacteria Mixture of V. cholerae O1 El Tor and classical strains 1 mg of B subunit of cholera toxin 1976年起利用犰狳研制麻风疫苗。 美国Young和Whitehead生物医学研究所和麻省 理工学院生物学系等单位合作，将麻风杆菌的 DNA片段重组到大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因 上，将这种融合基因再重组到gt11载体中，由 此获得了-半乳糖苷酶和麻风杆菌基因编码的蛋 白质的融合蛋白。Bloom等人则将麻风杆菌的基 因克隆到活的卡介苗中制备成多价疫苗。 生物技术与人类健康 9.1.4 细菌性疾病疫苗细菌性疾病疫苗 9.1.4.2 9.1.4.2 麻风杆菌疫苗麻风杆菌疫苗 Lepromatous vs. Tuberculoid Leprosy Lepromatous Leprosy (Early/Late Stages) Lepromatous Leprosy Pre- and Post-Treatment 幽门螺杆菌的灭活全细胞 或经超声波破碎后的无细 胞提取物均具有一定的免 疫原性。 1995年Lee等人报道用HP 的尿素酶及大肠杆菌不耐 热肠毒素为佐剂免疫小鼠 ，可产生保护性抗体。 9.1.4.4 9.1.4.4 幽门螺杆菌疫苗幽门螺杆菌疫苗 生物技术与人类健康 9.1.4 细菌性疾病疫苗细菌性疾病疫苗 目前疟原虫的基 因工程疫苗有抗子孢 子疫苗，如CSP蛋白 质；抗裂殖子疫苗； 抗配子母细胞疫苗等 。 生物技术与人类健康 9.1 生物技术与疫苗 9.1.5 9.1.5 寄生虫病疫苗寄生虫病疫苗 9.1.5.1 9.1.5.1 疟原虫疫苗疟原虫疫苗 9.1.5.2 血吸虫疫苗 血吸虫基因工程疫苗主要有两 大类：一类是虫体蛋白质，如28 kDa蛋白和25kDa蛋白的基因工程 疫苗就具有良好的抗原性；另一类 是酶性抗原，如谷胱甘肽S-巯基转 移酶（GST）、3-磷酸甘油醛脱氢 酶（GAPDH）、超氧化物歧化酶（ SOD）、磷酸葡萄糖同分异构酶（ TPI）等候选抗原。 生物技术与人类健康 9.1.5 寄生虫病疫苗 DNA疫苗是利用克隆于载体上的抗原基因直接 注射机体（包括皮下、皮内或肌肉等）、口服 、鼻内滴注、鼻腔喷雾及阴道接种等方式，被 细胞摄取并在细胞内表达相应的抗原，通过不 同途径诱导机体的特异免疫应答。 DNA疫苗的最大优点易于制备、便于保存、基 因在细胞的持续表达可达到持续免疫的效果并 且易于制成多联多价疫苗。 缺点是DNA是否会整合到染色体上而引起严重 的后果，是否会引起免疫病理作用，如诱发自 身抗核抗体，是否会产生免疫耐受等问题仍有 待研究与观察。 生物技术与人类健康 9.1 生物技术与疫苗 9.1.6 DNA9.1.6 DNA疫苗疫苗 9.1.7.1 精子避孕疫苗 主要有乳酸脱氢酶C- 4、SP-10、顶体蛋白 、FA-1、AH-20和PH -20等几种。同时，利 用基因工程技术已成 功地克隆了多个蛋白 质基因。 头 尾 线粒体 顶体 （顶体蛋白） 鞭毛 核 生物技术与人类健康 9.1 生物技术与疫苗 9.1.7 9.1.7 避孕疫苗避孕疫苗 9.1.7.2 激素类避孕疫苗 精子和卵子的产生过程、受精过程以及 妊娠过程需要多种激素的参与。人们设想以 这些激素作为抗原, 免疫男性或女性以产生相 应的中和抗体，降低机体内相应的激素水平 使得精子或卵子不能产生或不能受精或不能 怀孕，同样可以达到避孕的目的。目前进入 临床试验的已有人绒毛膜促性腺激素（HCG ）、促性腺激素释放激素（GnRH）和绵羊 促卵泡激素（oFSH）等。 生物技术与人类健康 9.1.7 避孕疫苗 所谓治疗性疫苗是指有别于传统的对传染病有预 防作用的疫苗，而是指具有积极治疗意义的一类 新型疫苗。 预防性疫苗主要针对健康的人群，目的是预防， 所以其普遍性、安全性和有效性是非常重要的， 因此靶抗原主要以病原体或其自身的组成成分为 主；而治疗性疫苗则是针对少数感染或患病个体 ，目的是治疗，因此它注重的是个体的病理学特 殊性，针对性较强，靶位的选择趋于特殊性。 9.1.8 9.1.8 治疗性疫苗治疗性疫苗 生物技术与人类健康 9.1 生物技术与疫苗 非特异性疫苗是指具有增强肌体免疫系统 的活性的疫苗。如病毒性疾病（如丙型肝 炎、乙型肝炎、艾滋病等）的治疗性疫苗 以及肿瘤疫苗。 特异性疫苗则是指用于治疗某一特定疾病 的疫苗。如自身免疫性疾病疫苗，如多角 性硬化病、系统性红斑狼疮等；心血管疾 病疫苗，如动脉粥样硬化和高血压；认知 性疾病，如朊病毒疾病、亨廷顿舞蹈病、 阿尔茨海默病等。 生物技术与人类健康 9.1.8 治疗性疫苗 ELISA：酶联免疫吸附检测技术 (enzyme linked immunosorbent assay) 9.2.1.1 ELISA9.2.1.1 ELISA技术的原理技术的原理 生物技术与人类健康 9 生物技术与人类健康 9.2.1 ELISA9.2.1 ELISA技术与单克隆抗体技术与单克隆抗体 9.2 生物技术与疾病诊断 测定抗体的 测定抗原的 间接ELISA法 双抗体夹心法 底物 显色产物 酶 Ab Ab Ag 9.2.1.2 9.2.1.2 常用常用ELISA ELISA 诊断技术诊断技术 生物技术与人类健康 9.2.1 ELISA技术与单克隆抗体 ELISA检验必须首先制备大量的抗原 传统的抗原制备方法本身存在很大的危险， 因为制造抗原时，要大量培养病原体，如果这 些病原体逸出，将会造成很大危害；其次，产 品的质量难以控制，难以标准化，从而导致各 批次产品质量的差异；再次，生产费用高，特 别是那些体外不能培养的病原体更是如此。 基因工程抗原可以克服上述的不足。 9.2.1.3 9.2.1.3 基因工程抗原基因工程抗原 生物技术与人类健康 9.2.1 ELISA技术与单克隆抗体 多克隆抗体 由于一个抗原往往会有多个抗原决定 簇，直接免疫动物后，从被免疫的动物的 血清制备的抗体是一种含有可分别与多个 抗原决定簇结合的多种抗体的混合物，这 种混合物称之为多克隆抗体。 9.2.1.4 9.2.1.4 多克隆抗体与单克隆抗体多克隆抗体与单克隆抗体 生物技术与人类健康 9.2.1 ELISA技术与单克隆抗体 单克隆抗体 利用细胞融合技术，在体外大量培养 融合细胞，由融合细胞产生大量的抗体。 单克隆抗体只识别某一特定的抗原决定簇 ，所以它具有特异性强、成分均一、灵敏 度高、产量大、容易标准化生产等优点而 明显优于多克隆抗体。 生物技术与人类健康 9.2.1.4 多克隆抗体与单克隆抗体多克隆抗体与单克隆抗体 1978年Kan和Dozy首先应用羊水细胞 DNA限制性片段长度多态性（RFLP）做 镰状细胞贫血症的产前诊断，从而开创了 DNA诊断的新技术。20多年来，DNA诊断 技术取得了飞速的发展，建立了多种多样 的检测方法，这些检测方法可以用于遗传 性疾病、肿瘤、传染性疾病等多种疾病的 诊断。 生物技术与人类健康 9.2 生物技术与疾病诊断 9.2.2 DNA9.2.2 DNA诊断技术诊断技术 生物技术与人类健康 9.2.2 DNA诊断技术 9.2.2.1 DNA探针杂交技术 PCR: polymerase chain reaction ， 即聚合酶链式反应技术是一项体外 扩增特异DNA片段的技术。 特点：灵敏度极高，可以检测极微 量的病原体。但如果操作不当很容易产 生假阳性反应。 生物技术与人类健康 9.2.2 DNA诊断技术 9.2.2.2 PCR9.2.2.2 PCR技术技术 生物技术与人类健康 9.2.2.2 PCR技术 生物技术与人类健康 9.2.2.2 PCR技术 利用利用PCRPCR诊断遗传病 遗传病的诊断包括： 临症诊断（symptomatic diagnosis）：是指遗传病出 现临床症状后所做的诊断。 症状前诊断（presymptomatic diagnosis）：是指临床 症状出现前所做的诊断。 产前诊断：胎儿出生前所做的诊断。由于目前大多数遗 传病无有效的治疗方法，因此产前诊断对于降低遗传病 的发病率，提高人口素质具有重要的意义。 生物技术与人类健康 9.2.2.2 PCR技术 夫妇之一有染色体畸变。 35岁以上的高龄产妇。 夫妇之一有开放性神经管畸形。 夫妇之一有先天性代谢缺陷。 X-连锁遗传病基因携带者孕妇。 有原因不明的习惯性流产的孕妇。 羊水过多的孕妇。 夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇。 具有遗传病家族史，又系近亲结婚的孕妇 。 需要进行产前诊断的对象需要进行产前诊断的对象 生物技术与人类健康 9.2.2.2 PCR技术 生物技术与人类健康 9.2.2.2 PCR技术 可利用PCR技术诊断的部分传染因子 病毒 细菌 寄生虫 单纯性疱疹病毒 大肠杆菌 衣原体 肝炎病毒 沙门氏菌 锥虫 巨细胞病毒 耶尔森氏菌 丝虫 腺病毒 分支杆菌 疟原虫 风疹病毒 弯曲菌 血吸虫 Epstein-Barr病毒 军团菌 利什曼原虫 轮状病毒 博代氏杆菌 旋毛虫 乳头状瘤病毒 弧菌 小泰氏梨浆虫 人免疫缺陷病毒 链球菌 弓形虫 细小病毒 葡萄球菌 鼻病毒 淋病奈瑟氏菌 立克次氏体 支原菌 生物技术与人类健康 9.2.2.2 PCR技术 利用PCR诊断传染病 限制性片段长度多态性（RFLP）是指由于 碱基的改变导致DNA上的某一限制性内切核酸 酶水解位点增加或减少。当这种DNA用内切酶 水解时，产生的DNA片段数将相应的增加或减 少，并且其DNA片段的分子质量也发生相应的 改变，这种DNA片段的变化就称为限制性片段 长度多态性。 生物技术与人类健康 9.2.2 DNA诊断技术 9.2.2.3 PCR-RFLP9.2.2.3 PCR-RFLP技术技术 生物技术与人类健康 9.2.2.3 PCRRFLP技术 RFLP： restriction fragment length poly- morphism,限 制性片段长 度多态性。 许多遗传性疾病就是由于DNA上碱基 的改变引起的。如果这种改变正好增加或 减少了DNA限制性内切核酸酶的水解位点 ,那么就可以用PCR技术先扩增包括这一 突变位置在内的DNA片段，获得大量的 DNA片段后通过RFLP方法进行分析。 生物技术与人类健康 9.2.2.3 PCRRFLP技术 生物技术与人类健康 9.2.2.3 PCRRFLP技术 ASO称为等位基因寡核苷酸。PCR-ASO的 检测方法是将待测的样品先经PCR扩增获 得大量的待分析的DNA片段，然后将这些 片段分别点样在固相支持膜（如尼龙膜） 上。另一方面，人工合成包括突变热点在 内的1730个核苷酸的正常的和突变的寡 核苷酸，并分别进行放射性同位素标记成 为寡核苷酸探针。利用这两种探针分别与 膜上的PCR产物进行杂交。 生物技术与人类健康 9.2.2 DNA诊断技术 9.2.2.4 9.2.2.4 PCR-ASOPCR-ASO技术技术 目前发现的遗传病中，许多疾病并不 是基因的缺失或与限制性内切核酸酶水解 位点有关联的点突变。绝大部分只是一些 单纯的碱基突变，每一种遗传性疾病都有 一些经常发生突变的位点，称为突变的热 点。 生物技术与人类健康 9.2.2.4 PCRASO技术 该方法是PCR技术和ELISA技术 的结合，所以它是一种两级放大系统 ，即PCR放大和ELISA放大，故而它 的灵敏度更高。同时这种方法避免了 PCR产物分析时的电泳及染色过程， 所以更为快速简便。 9.2.2.5 9.2.2.5 PCR-ELISAPCR-ELISA技术技术 生物技术与人类健康 9.2.2 DNA诊断技术 该方法称为聚合酶链反应-DNA单 链构型多态性，原理是利用正常的和 突变的DNA单链在三维空间构型上的 差异，这种差异在电泳时将会有不同 的电泳格局。 9.2.2.6 PCR-SSCP9.2.2.6 PCR-SSCP技术技术 生物技术与人类健康 9.2.2 DNA诊断技术 该方法称为聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳 技术，是将正常基因和突变基因分别进行PCR扩 增，然后将扩增后的两种PCR产物混合后变性再 复性。此时，可形成两种同源双链DNA，即正常 的双链DNA和突变的双链DNA，及两种异源双链 DNA，即正反两种由正常单链DNA和突变单链 DNA形成的双链DNA。将此复性后的混合物在变 性剂递增梯度凝胶中电泳。混合物中的异源双链 DNA在泳动过程中由于变性剂的递增其错配部位 将逐步解离而形成局部单链，使其泳动速度变慢 ，从而与正常的同源双链DNA分开。必要时同样 可以对其DNA序列进行分析以确定其突变类型。 9.2.2.7 PCR-DGGE9.2.2.7 PCR-DGGE技术技术 生物技术与人类健康 9.2.2 DNA诊断技术 LCR的基本原理为利用DNA连接酶，特异地将双链DNA 片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使 靶基因序列大量扩增。其程序为:在模板DNA、DNA连接 酶、寡核苷酸引物以及相应的反应条件下，首先加热至 一定温度下(9495)，使DNA变性，双链打开，然后 降温退火(65)，引物与之互补的模板DNA结合并留下 一缺口，如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶 序列完全互补，DNA连接酶即可连接封闭这一缺口，则 LCR反应的三步骤(变性-退火-连接)就能反复进行，每 次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模板，使更多 的寡核苷酸被连接与扩增。若连接处的靶序列有点突变 ，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间 结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接 产物。 生物技术与人类健康 9.2.2 DNA诊断技术 9.2.2.8 LCR9.2.2.8 LCR技术技术 LCR：ligase chain reaction， 连接酶链式反 应。 生物技术与人类健康 9.2.2.8 LCR技术 利用RFLP技术检测基因突变，除了上 述的PCR-RFLP技术以外，还可以利用探 针分子来进行检测。 9.2.2.9 RFLP-9.2.2.9 RFLP-探针杂交技术探针杂交技术 生物技术与人类健康 9.2.2 DNA诊断技术 生物芯片主要指通 过平面微细加工技术 在固体芯片表面构建 的微流体分析单元和 系统,以实现对细胞、 蛋白质、核酸以及其 他生物组分的准确、 快速、大信息量的检 测技术。 生物技术与人类健康 9.2.2 DNA诊断技术 9.2.2.10 9.2.2.10 生物芯片技术生物芯片技术 生物芯片的主要优点 采用了平面微细加工技术,可实现大批量生产。通 过提高集成度, 可降低成本。 可组装大量的 (104106种)生物分子探针, 获取 信息量大,效率高。 结合微机械技术,可把生物样品的预处理,基因物 质的提取、扩增,以及杂交后的信息检测集成为芯 片实验室,制备成微型、全自动化、可用于微量试 样检测的高度集成的智能化生物芯片。 生物技术与人类健康 9.2.2.10 生物芯片技术 生物技术与人类健康 9.2.2.10 生物芯片技术 诊断肿瘤 检查肿瘤组织基因表达谱、寻找肿瘤相关 基因、肿瘤基因突变的研究 。 检测病原体 将许多代表每种微生物的特殊基因制成一 张芯片，判断患者感染病原体的种类。 遗传性疾病的诊断 生物芯片在诊断上的应用生物芯片在诊断上的应用 生物技术与人类健康 9.2.2.10 生物芯片技术 NanoChipNanoChip 400 System400 System 生物技术与人类健康 9.2.2.10 生物芯片技术 v1928年A.Fleming发现一种被称为点青霉（ Penicillium notatum）的真菌能产生青霉素 。 v迄今人们已经找到了6000多种不同来源、 不同结构、不同作用机制的抗生素 ，广泛 应用的约有100种。 9.3.1 9.3.1 抗生素及其他天然药物抗生素及其他天然药物 9.3.1.1 9.3.1.1 抗生素抗生素 9.3 9.3 生物技术与生物制药生物技术与生物制药 生物技术与人类健康 9 生物技术与人类健康 v全世界每年抗生素的产量超过10万吨 ，产值超过50亿美元。 v抗生素使许多疾病特别是细菌引起的 传染性疾病得到了有效的控制。 v抗生素的滥用，已使许多细菌产生了 抗药性 。 生物技术与人类健康 9.3.1.1 抗生素 v人参组织培养生产人参皂甙 v组织培养方法生产紫草的有效成分紫草宁。 v紫杉细胞培养法及真菌发酵法生产紫杉醇。 （尚处于研究阶段） 9.3.1.2 9.3.1.2 其他天然药物其他天然药物 生物技术与人类健康 9.3.1 抗生素及其他天然产物 紫杉醇紫杉醇 紫杉紫杉 将有治疗意义的蛋白质基因克 隆后，导入细菌、酵母等生长旺盛 的表达系统中，使这个基因接受表 达系统中强的表达元件的控制而大 量表达，从而得到可供临床使用的 大量药物。 9.3.2 9.3.2 基因工程药物基因工程药物 生物技术与人类健康 9.3 生物技术与生物制药 v安全，不易被病原体污染。 v成本低、产量高。 用传统技术提取5mg的生长激素释放抑制因子 需要50万头的绵羊脑，而用基因工程技术生产只需 9L细菌发酵液。 v生产的蛋白质药物的性质更加稳定、 活性更高、副作用更低。 可以通过基因工程的方法对蛋白质基因的结构 加以改造以改变蛋白质结构，使其更稳定。 优点多优点多 生物技术与人类健康 9.3.2 基因工程药物 v美国十分重视基础研究，立足于创新，因此美 国的基因制药一直处于领先水平。美国现有各 类生物技术公司2000多家，其中1300多家从 事医药产品的开发研究， 300多家为上市公司 。1997年美国基因工程药物的销售额为60亿 美元，到2001年的产值已达200多亿美元。 v日本基因工程药物的年销售额也高达几千亿日 元。 v我国基因工程药物数量少、市场规模仍然十分 有限。 生物技术与人类健康 9.3.2 基因工程药物 效益高 用基因工程技术生产的部分人类蛋白质药物 蛋白质名称 用途 促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone） 治疗风湿（rheumatic disease） B细胞生长因子（B-cell growth factor） 治疗免疫系统功能失调 降钙素(calcitonin) 治疗软骨病(osteomalacia) 集落刺激因子(colony stimulating factor) 治疗血液病、肿瘤辅助治疗 绒毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin) 治疗不排卵症 内啡肽和脑啡肽(endorphine and enkephalin) 镇痛剂(analgesic agent) 上皮生长因子(epidermal growth factor) 促进伤口愈合 红细胞生成素(erythropoietin) 治疗贫血(anemia) 凝血因子(factor ) 治疗血友病(hemophilia) 凝血因子(factor ) 治疗血友病 生长激素(growth hormone) 促进生长 生长激素释放因子(growth hormone releasing factor) 促进生长 胰岛素(insulin) 治疗糖尿病(diabetes) 干扰素(interferon) 抗病毒抗肿瘤 白细胞介素(interleukin) 治疗癌症 生物技术与人类健康 9.3.2 基因工程药物 蛋白质名称 用途 淋巴细胞毒素(lymphotoxin) 抗肿瘤 巨噬细胞激活因子(macrophage activating factor) 抗肿瘤 神经生长因子(nerve growth factor) 促进神经系统损伤的修复 血小板衍生因子(platelet-derived growth factor) 治疗动脉粥样硬化 松弛素(relaxin) 助产剂 血清白蛋白(serum albumin) 血浆补充物 生长调节素(somatomedin C) 促进生长 组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator) 溶栓剂 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor) 抗肿瘤 尿抑胃素(urogastrone) 抗溃疡药物 尿激酶(urokinase) 溶栓剂 生物技术与人类健康 9.3.2 基因工程药物 用基因工程技术生产的部分人类蛋白质药物（续表） 我国已经批准上市的基因工程药物 药品名 开发生产公司 批准时间 适应证 重组人干扰素1b（外用）长春生研所 1989年试生产 病毒性角膜炎 重组人干扰素1b 上海生研所 1996年正式生产 乙肝，丙肝等 深圳科兴 1996年正式生产 乙肝，丙肝 重组人干扰素2a 长春生研所 1996年正式生产 尖锐湿疣，疱疹 长生药业 1997年正式生产 乙肝，丙肝 三生药生 1997年正式生产 乙肝，丙肝 大洲药业 1997年正式生产 乙肝，丙肝 重组人干扰素2b 里亚哈尔 1996年正式生产 乙肝，丙肝 华立达 1997年正式生产 乙肝，丙肝 安科 1997年试生产 乙肝，丙肝 华新 1997年试生产 乙肝，丙肝 重组干扰素- 上海生研所 1994年试生产 类风湿 克隆 1995年试生产 类风湿 丽珠生物工程 1995年试生产 类风湿 生物技术与人类健康 9.3.2 基因工程药物 药品名 开发生产公司 批准时间 适应证 重组人白细胞介素-2 长春生研所 1997年正式生产 癌症辅助治疗 长生药业 1997年正式生产 癌症辅助治疗 四环制药 1997年正式生产 癌症辅助治疗 华新 1997年正式生产 癌症辅助治疗 三生药业 1997年正式生产 癌症辅助治疗 深圳科兴 1997年正式生产 癌症辅助治疗 中化合通 1995年试生产 癌症辅助治疗 金丝利 1995年试生产 癌症辅助治疗 康利制药 1995年试生产 癌症辅助治疗 重组人粒细胞集落刺激因子 九源 1997年试生产 化疗生白细胞 重组人粒细胞、巨细胞集落 特宝 1997年试生产 化疗生白细胞 刺激因子 我国已经批准上市的基因工程药物（续表我国已经批准上市的基因工程药物（续表1 1） 生物技术与人类健康 9.3.2