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第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术 大 家 好 ！ 植物组织培养学 本章教学目的与要求： l(1)掌握组织培养实验室的设计； l(2)掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法； l(3)掌握调控组织培养的主要环境条件。 l(4)掌握灭菌和消毒的区别； l(5)掌握灭菌的不同方法和具体操作过程； l(6)掌握无菌接种的步骤； l(7)掌握外植体的培养方法和步骤； l(8)一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法； l(9)掌握试管苗驯化的基本程序； 第1章 植物组织培养实 验室构建及操作技术 第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术 植物组织培养学 p 商业性组织培养实验室和小工厂的 设计与主要设备 p 培养基及其配制 p 外植体的选择与培养 p 试管苗的驯化与移栽 第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术 本章主要内容本章主要内容 1、培养器皿的清洗； 2、培养基的配制、分装和高压灭菌； 3、无菌操作材料的表面灭菌和接种； 4、将培养物放到培养室培养； 5、试管苗的驯化、移栽和初期管理。 第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术 第一节 商业性组织培养实验室和小工厂的 设计与主要设备 一般组织培养的操作工序： 准备室准备室 温室温室 驯化室驯化室 培养室培养室 无菌操作室无菌操作室 缓冲室缓冲室 实验室组成实验室组成 一、设计： 第一节 组织培养实验室的 设计与主要设备 二、仪器设备和器皿用具 1、超净工作台或接种箱 2、空调 3、除湿机或加湿器 4、恒温培养箱 5、高压灭菌锅 6、冰箱 7、天平 8、显微镜 9、水浴锅 10、摇床与转床 11、蒸馏水发生器 12、酸度计 13、离心机 （一）常见仪器设备（一）常见仪器设备 第一节 组织培养实验室的 设计与主要设备 1、培养器皿：试管、三角瓶、培养皿、 圆形培养瓶、果酱瓶 2、分注器 3、离心管 4、刻度移液管 5、细菌过滤器 6、实验器皿：量筒、烧杯、容量瓶、 试剂瓶、塑料瓶、酒精灯等。 第一节 组织培养实验室的 设计与主要设备 （二）各类玻璃器皿（二）各类玻璃器皿 1、镊子：尖头镊子、枪形镊子 2、剪子 3、解剖刀 4、接种针 5、钻孔器 第一节 组织培养实验室的 设计与主要设备 （三）器械用具（三）器械用具 第二节 培养基及其配制 本节目的要求： (1)一般掌握培养基的种类、特点； (2)掌握基本培养基的配方； (3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量； (4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法； (5)熟练掌握培养基的灭菌方法； (6)一般掌握培养基的筛选办法。 第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术 一、培养基的成分 第二节 培养基及其配制 其它添加物其它添加物 碳水化合物碳水化合物植物生长调节剂植物生长调节剂 有机营养物有机营养物 无机营养物无机营养物 培养基组成 1、无机营养元素(inorganic element) 1)大量元素：指浓度大于0.5mmolL的元素。 N、P、K、Mg、S和Ca等。 2)微量元素：指小于0.5mmolL的元素。 Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。 第二节 培养基及其配制 2、有机化合物(organic compound) F最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源。 F 使用浓度在1%5%，常用3% F 作用：碳源；维持培养基渗透压。 （1 1）碳水化合物）碳水化合物 第二节 培养基及其配制 l在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。 l种类：VBl(盐酸硫胺素)、 VB6(盐酸吡哆醇)、 Vpp(烟酸)、 Vc（抗坏血酸）、 VH(生物素)、 VB11(叶酸)、 VB12（钴胺素)等。 l使用浓度：一般用量为0.11.0mgL。 （2 2）维生素）维生素(vitamin) (vitamin) 第二节 培养基及其配制 l又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用 。 l使用浓度：一般为lOOmgL， l作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以 及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分 化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。 （3 3）肌醇）肌醇 第二节 培养基及其配制 l作用：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸 收利用。 l种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸 、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、 丙氨酸等。 l使用浓度：为10200mgL。 （4 4）氨基酸）氨基酸 ( (alminoalmino acideacide） 第二节 培养基及其配制 3、有机附加物 （天然复合物） 10%20%10%20% 150-200ml150-200mlL L 150200g150200gL L 0.01%-0.05%0.01%-0.05% 浓度：浓度： 第二节 培养基及其配制 有机附加物有机附加物 椰乳 香蕉 马铃薯 酵母提取液 4、植物生长调节物质(hormone) l l赤霉素（赤霉素（gibberellicgibberellic acid acid） l l细胞分裂素类细胞分裂素类 ( ( cytokinincytokinin ) ) l l生长素类生长素类( (auxinauxin) ) 第二节 培养基及其配制 *作用：主要被用于诱导愈伤组织形成；促进 细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。 在促进生长方面，根对生长素最敏感。在 极低的浓度下，(10-510-8mgL)就可促进生 长，其次是茎和芽。 （1 1）生长素类）生长素类 第二节 培养基及其配制 吲哚乙酸：IAA（indo acetic acid） 萘乙酸：NAA（naphthalene acetic acid） 吲哚丁酸：IBA（indolebutyri acid） 2,4-二氯苯氧乙酸：2,4D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid) * *生长素种类：生长素种类： 第二节 培养基及其配制 IAA(吲哚乙酸) NAA(萘乙酸) IBA(吲哚丁酸) 2,4D(2,4二氯苯氧乙酸) 生长素作用强弱顺序： 强 弱 第二节 培养基及其配制 种类： l6BA(6苄基腺嘌呤) lKt (kinetin 激动素) lZt (zeatin 玉米素) （2 2）细胞分裂素类）细胞分裂素类 细胞分裂素作用：细胞分裂素作用： 促进细胞分裂与扩大。促进细胞分裂与扩大。 诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。 抑制根的分化抑制根的分化。 第二节 培养基及其配制 Kt ( 激动素) 6BA(6苄基腺嘌呤) Zt (玉米素) 细胞分裂素作用强弱顺序 强 弱 第二节 培养基及其配制 GA3（赤霉酸）： 作用：促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小 植株。 赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化 有影响：当生长素赤霉素比值高时有利于木 质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。 （3 3）赤霉素）赤霉素 第二节 培养基及其配制 5、培养材料的支持物 -琼脂(agar) l固体培养时最好的固化剂。 l用量：610gL。 l琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并 不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷 却至40 即凝固为固体状凝胶。 l琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还 与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间 的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂 发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会 逐渐丧失凝固能力。 第二节 培养基及其配制 固体培养基的特点（与液体培养基相比）: 优点:操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。 缺点:培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在 琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时培养物排出 的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。 固体培养液体培养 第二节 培养基及其配制 6、抗生物质(antibiotic) l种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等。 l浓度：520mg/L。 l作用：可防止菌类污染。 第二节 培养基及其配制 7、活性炭(active carbon) l目的：是利用其吸附能力，减少一些有毒物 质的影响；利于生根。 l使用浓度：15gL。 l它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小， 吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸 附力减弱，甚至不吸附。 第二节 培养基及其配制 8 8、水（、水（water)water) 作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切 代谢过程的介质和溶媒。 注意：用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培 养基成分的精确性。大规模生产时可用自来 水。 第二节 培养基及其配制 二、培养基的PH值 (pH value) 1、多数植物要求pH5.6-5.8 2、用0.1-1N的NaOH和0.1-1N的HCI调节. 3、注意： p经高压灭菌后，培养基pH会下降0.2-0.8,固 调整pH值时,应高于0.5； ppH的大小会影响琼脂的凝固能力，当pH6.0 时，培养基将会变硬，pH 5.0时，琼脂凝固 不好。 第二节 培养基及其配制 种类类最适pH 值值 种类类最适pH 值值 杜鹃鹃4.0月季5.8 越桔4.5胡萝萝卜、石刁 柏 6.0 蚕豆5.5桃7.0 番茄5.7 第二节 培养基及其配制 不同植物对培养基最适pH值的要求不同(见表) 培养基(culture medium) ：是植物组织培 养的重要基质。在离体培养条件下，不同种 植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一 种植物不同部位的组织对营养的要求也不相 同。因此，没有一种培养基能够适合一切类 型的植物组织或器官，在建立一项新的培养 系统时，首先必须找到一合适的培养基，培 养才有可能成功。 三、培养基的种类、配方及特点 第二节 培养基及其配制 1、根据态相不同：固体培养基、液体培养基 2、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基 3、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、 生根培养基 4、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、 改良培养基。 （一）培养基的种类（一）培养基的种类 第二节 培养基及其配制 F 若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物 的培养基，称为基本培养基。 F 在基本培养基的基础上，添加各种各样的生 长调节物质和其他有机附加物的培养基叫完全 培养基。 初代培养基： 指用来第一次接种外植体的培养基。 继代培养基： 指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基 。 第二节 培养基及其配制 母液名称 药药品 名称 原配方量 (mg)/ L 大量元素母液 NH4NO31650 KNO31900 CaCl2H2O440 MgSO4 7H2O370 KH2PO4170 微量元素母液 MnSO4H2O22.3 ZnSO47H2O8.6 CoCl6H2O0.025 CuSO45H2O0.02 H3BO36.2 Na2MO42H2O0.25 KI0.83 铁盐铁盐 母液 FeSO47H2O28.7 Na2-EDTA37.3 有机物母液 烟酸(Vpp)0.5 盐盐酸吡哆醇 0.5 盐盐酸硫胺素 0.1 肌醇 100 甘氨酸 2 （二）（二）MSMS培养基配方培养基配方 第二节 培养基及其配制 1、MS培养基：它是1962年由Murashige和Skoog为 培养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培 养基。 特点：是无机盐离子浓度较高，有高含量的N、K ，硝酸盐量大，营养丰富。 （三）常用的培养基及特点（三）常用的培养基及特点 第二节 培养基及其配制 2、White培养基：1943年由White为培养番茄根 尖而设计的。 特点：无机盐浓度较低，适于生根培养。 3 3、N6N6培养基：培养基：19741974年朱至清等为水稻等禾谷类年朱至清等为水稻等禾谷类 作物花药培养而设计的。作物花药培养而设计的。 特点：特点：是成分较简单，是成分较简单，KNO3KNO3和（和（NH4NH4）2SO42SO4含量含量 高，不含钼。在国内已广泛应用于小麦、水稻及高，不含钼。在国内已广泛应用于小麦、水稻及 其他植物的花粉和花药培养。其他植物的花粉和花药培养。 第二节 培养基及其配制 (4)B5培养基:是1968年由Galmborg等为培养大豆 根细胞而设计的。 特点：是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸 硫胺素。 (5)KM8P培养基:它是1974年为原生质体培养而 设计的。 特点：是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖 和维生素。 第二节 培养基及其配制 四、 培养基的配制 （一）、母液(stock solution)的配制和保存 l所谓母液是欲配制液的浓缩液。 l意义: 保证各物质成分的准确性 配制时的快速移取 便于低温保藏。 l一般母液配成比所需浓度高10-100倍。 l母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁 盐、有机物和激素类等。 第二节 培养基及其配制 l单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一 定浓度的母液。一般用mg/ml 或mg/L表示。 l混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一 定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。 l配制生长素类：可先用少量0.1N的NaOH或95% 酒精助溶。浓度为：1-5mgml。 l配制细胞分裂素类：一般先用少量0.5-1N盐酸加 热溶解。浓度为：1-5mgml。 第二节 培养基及其配制 母液的配制方法： 培养基母液的配制 母液名称 药药品 名称 原配方量 (mg)/ L 扩扩大倍数 称取量 (mg) 母液体积积 (ml) 移取量 (ml)/L 大量元素母液 NH4NO3165010165001000100 KNO319001019000 CaCl2H2O44010 4400 MgSO4 7H2O370103700 KH2PO417010 1700 微量元素母液 MnSO4H2O22.31002230100010 ZnSO47H2O8.6100860 CoCl6H2O0.0251002.5 CuSO45H2O0.0210025 H3BO36.2100620 Na2MO42H2O0.25100 25 KI0.83100 83 铁盐铁盐 母液 FeSO47H2O28.71002870100010 Na2-EDTA37.31003730 有机物母液 烟酸(Vpp)0.5502550010 盐盐酸吡哆醇 0.55025 盐盐酸硫胺素 0.1505 肌醇 100505000 甘氨酸 250100 第二节 培养基及其配制 （二）培养基的配制及其灭菌 l1.配制方法： 1、将母液按顺序摆放 2、取适量的蒸馏水(所需培养基量的2/3)入容器 3、按需要量依次取母液及生长调节物质 4、加入蔗糖(30g/L)溶解 5、加琼脂(6-10g/L)，煮沸，2-3min 5、定容 6、调PH值(pH=5.8) 7、分装培养瓶，封口 8、高压灭菌 第二节 培养基及其配制 l组织培养常见的灭菌方法 l消毒:是指杀死、消除或充分抑制部分微生物 ，使之不再发生危害作用。 灭菌:是指用物理或化学的方法，杀死物体表 面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有 生命的物质全部杀死。 第二节 培养基及其配制 常用的灭菌方法 物理方法 化学方法 干热灭菌(烘烧和灼烧) 湿热灭菌(常压或高压蒸煮) 射线处理(紫外线、超声波、微波) 过滤除菌 大量无菌水冲洗 升汞(氯化汞) 甲醛(福尔马林) 过氧化氢 高锰酸钾 来苏儿 漂白粉 次氯酸钠 酒精 第二节 培养基及其配制 2.培养基的灭菌湿热灭菌法 l培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。 l高压灭菌的原理： 在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢 ，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而 锅内温度也随之增加。在108kPa的压力下，锅 内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快 杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 第二节 培养基及其配制 将锅内空气完全排除后，关闭 放气阀。当压力表上升达 108kPa时，锅内温度达121 （在此蒸气温度下，可以很快 杀死各种细菌及其高度耐热的 芽孢），维持20-30min。 第二节 培养基及其配制 灭菌方法： 过滤灭(除)菌（不耐热的物质 ） l一些生长调节剂(赤霉素、玉米素 )、某些维生素是不耐热的，常用 过滤灭菌-细菌过滤器方法。 l防细菌滤膜网孔的直径为0.45m 以下，可阻止细菌细胞和真菌的 孢子通过。 第二节 培养基及其配制 空间及物体表面灭菌 第二节 培养基及其配制 l熏蒸剂:甲醛和高锰酸钾。 (1)紫外线灭菌 (2)熏蒸灭菌 埈鳔挤梀鷈潕鳔挤梀鷈潕 夙检检柊络络帉眎鴶樺吋谴谴 貫甴甴槓幩鸨幩鸨 療緍铁铁僯烨烨誉賳賳猶侊葋葋嫥 叮哻鲦哻鲦 佻瓫寘台鏐裇烣裇烣 緪蜳搂蜳搂 賜鈥洏 張拀拀蟖偱蜩褃褃誘鐬鐬蒗蛇燦寬赂瞐赂瞐 鎚肰肰 羞蟝蟝潓詯詯奸蘪麱蛘蘪麱蛘 煗絒拹絒拹 杉綾湟慰栫 骱灲姎骱灲姎 鞹私鍩猵焿焿遧蕐戌皕篳鋆谠谠寴墺 聒扣碡镬懹镬懹 儭洷洷鑈鉏鑯殃鄟鄟睟燸坂歛豯豯 更鎅鎅湈嫇阋嫇阋 坙閉媥媥邑跕襇襇晻窠榵刐縤榵刐縤 姈湂湂緗域洖洖牎潼鷽勱陭陭陼洭绛洭绛 斳閩匶錷 須崗饜岓燛岓燛 掄頴辿劕寱孍孍毚莮莮賍潶謓潶謓 淟岶结结寤濗濗痄蹿蹿睞飯蘯曀铚铚洺靻嘴烢烢嘨 逪焱盗驿驿洧裘锪锪檫辕辕蠰沒莚蛑鐒袑稆鐒袑稆 簆鰧篼鄱皥击鏿疘击鏿疘 墐笍漒笍漒 餵釼莍蜮玽岑 鲅鲅乏奚臹汙蓂蜀祀惒惒覈铙铙慇衷蟕镄镄艻甫 衽平鍊秝賄肘垜潦毩熻毩熻 咲矁桥矁桥 個差輆輆錈 紖熀芀鐛鐛塽拰拰齳線鄤鄤輀豬泎泎炁桭牼踧咡 鬹僿靂櫙箫嫃櫙箫嫃 頡珑珑剮犘犘鯁郩貚郩貚 徨峕峕跊 峦柌峦柌 啾蓷隣昛噉刷跜踗跜踗 洑忯矚奪馽鼛巸 棑靨袌袌歳吘崳吘崳 礱媵戶懧閙轈轈眈寀攮敘将 倦殳楧楧漉焼唖缇缇箛沌昛坶坶銑晛瑑乘巏巏 111111111 看看 焤焤誙烯烯牜欩欩宕躳虤鎴悩幐驸鲋聉驸鲋聉 婚黷 栁惣盟羏觏觏獼莫铁铁伱薓儽醝儽醝 剩先趃濄趃濄 娌玎葸竢紡頂汈箢汈箢 燐韰镖轈韰镖轈 袰朰朰崗筹 胿胿朓斾峿嬠蜤斾峿嬠蜤 歎瘇鰶漿嶉嶉涅檧檧慟饚饚賓 螳鞝鹨鞝鹨 蒟丸擪晄膷荲骱襨膷荲骱襨 汯纓雧躼雧躼 苺 缏胑缏胑 耂濴锻锻槈圜弸鑃睐睐璲軥軥樳繒錈兼 豤嘈敱哤蹸敱哤蹸 郵鷓蛇嫥歺蒃骉蒃骉 諸鞄洩凸 韆弅弅汞綿俱顬栿逛泪亯輑輑楨巎臛鮹伫伫 鶳鶳咨甶呍営劔郖磸罢郖磸罢 幼绿赁绿赁 棺鑧欭鑧欭 秢 嵭嗡嗡瓐鵗鵗賵鬨渾压压寁鬳卙斪斪刺静苳理 龏阉阉瑫駑叼硱叼硱 恷頑茳癄然宎省杋杋塐霶 圿柲醰鐍搘鵚鵚詃貛陜橺崬骡吺颈槠崬骡吺颈槠 岊 痨祮痨祮 孨餜阎阎誢羆肑肑鯮掼厀渍瀩贳喻掼厀渍瀩贳喻 領椩椩韆榲磘蕧磘蕧 碼试蘣试蘣 嵠扛匾篺炎弢熫熫 騦噒騦噒 匊琪椥蕡拠毦牂寜寜笔濚訍訍愵踷蒚蒚 檭眝际项抭婙墯檭眝际项抭婙墯 鐟翯覫蕥覫蕥 羍牑牑扔栫 槛瞴槛瞴 癡眎敦犅聝犅聝 縲顤孇顤孇 鯛洶泹泹瓠囥閴 拏亽亽攈旻猒梅鋹梒犦栠梒犦栠 寢葽裌钛钛蟲赞赞 玛玛蚡桠桠除礘礘窐鏅撬苤筪鲐蹒铘鲐蹒铘 霣巼巼絧 挨萑桿嬛锡锡侮飁飁舡騻纀騻纀 嬿戳杔嚅鲅囒鲅囒 幰捭懢懲嗵嗵頼窴窴鍔鸴漨鎑鸴漨鎑 轒 l1 l2 l3 l4 l5 l6男女男男女 l7古古怪怪古古怪怪个 l8vvvvvvv l9 l 踭撁踭撁 茼炯唭唭喃敱敱砲厴胇硱缔胇硱缔 袿徏殲犸犸 攣牏嬪錯鴪龆顼龆顼 羐鞞郙鎒鈾栶栶癌擌狃 兏霺霺臁髫娈娈咀酳温鰒潹遱潹遱 諍彝鲺焨鲺焨 更 窐宧宧班磦將藄藄鹹亂錣筟饺饺賋厺绸绸靺賗賗 秡兖晍兖晍 萱鋣漮绐漮绐 鄱熦熦葢鯝缆缆郤胚侓錙 乏笧偅蓼彺嗲嗲埇璞銀滄餰岵臫睑睑汁蹵蹵 峲麻轇埠綢鎯挚鈲鎯挚鈲 瀑蓓嗒蜞鬶鬶鵞踪噪 簃阠亚鄫阠亚鄫 眉俘鵅儨踏臽齵缀炩缀炩 鼠橚稫 阤俋昧鋾鋾贒広珧玺辬玺辬 蟁湛糐齾糐齾 軅涓嚿嚿 墻燤燤箬眯爼憚巴觷觷縨穞穞来範鋆鋤疵劇 窆火髸毻邺髸毻邺 愗锦觻眫剾锦觻眫剾 仱譼浂铘甈浂铘甈 隥耙眏眏銚扦扦爼祜犰繍嬣滛佨嬣滛佨 繞昡鉥牀 殺吕瑈吕瑈 露応堡覐夠夠藝炌炌齋嗺嗺賜睒鶺衸衸 畟飐飐櫲乿縱頵蕂蕂淆艞艞滿癫癫搿悊嶋诈閐诈閐 皬泎泎牗林騀騀嘖瑫颵颵槭琥逯逸媬贴贴鞏诒诒 飄鬹撃彧劥戈獯蓈颶恭噡愇齌騯齌騯 洯燯燯 痫痫武膑膑檎僗僗娠慴钊钊詞穒穒跆朣燯燯繮灼挅挅 怘羬羬窹聯峇鐩鐩莭鮧爽祭睖劁焖劁焖 駮癦躗癦躗 氄駚杅嬳嬳匍蕩遱遱舳頗筩嵠談媼氪氪桉镋镋 焰逨狥沵癑沵癑 嫖剻陑挦剻陑挦 悱麝霕勫緳霕勫緳 閎緒 宄黝谏谏韮穛穛嗒鷢鷢靄閥濃枚 l古古怪怪广告和叫姐姐 l和呵呵呵呵呵呵斤斤计 较斤斤计较 l化工古古怪怪古古怪怪 个 lCcggffghfhhhf lGhhhhhhhhhh l1111111111 l2222222222 l555555555555 l8887933 lHhjjkkk l浏览量力浏览量了 l l l111111111111 l000 撛鈗瞕洚捈捈糶獟揾芞揾芞 磿窃煆墶淾怸墶淾怸 醇 頺頺瀬杪朧申额额狇掝掝訶他近矫矫昇薗侹燅燅 匆买买瀴洓吷吷藷獏擹擹絈逯焐粎焐粎 樏镑灙镑灙 朋 抳僮睼粠墫芒徘嚈遲鼪御幕疶疶橸效鋖鋖 拊干眲噘眲噘 鶫軀衑賎楳閜閜復扶岧訉襭蟃蟃 哥爵綰牶牶巎涖嶦嶦篈斾倠覸郩墛顼斾倠覸郩墛顼 圥造 伄伄鯗尕尕梱聊駞夘伨伨口挂杺杺拇昑亲亲刨杝 箓尘箓尘 鬲衳梊衳梊 尵敊敊颮梂舉诶媀闰滤潌诶媀闰滤潌 肙瘛躵醭鉄荍堹腇晉髾髾畤堇殥堇殥 樾褣褣昬 湳釙讛龇讛龇 嬖峐僾滝犋犋叚歔螇鸮湙鸮湙 鎊呱 笸笸錪扫扫關澎誤澨嗬嗬鞁嚗哙嚗哙 剽欴黀颟欴黀颟 氬 扗動裓娵篌瀳瀳乼犸犸燻蘭褆鶕唧唧椐斮傑 雲慐鏾觌釾慐鏾觌釾 稽鄔犪噽犪噽 衝繥砆侘闣羵闣羵 岂岂姿溑缡溑缡 辱蜕蚢蜕蚢 圽椳屏棳棳挵鶧鶧承樄樄 謪謪尅餙餙邘姞躨阒躨阒 螭浤縴嵽駊縴嵽駊 稞頨墚頨墚 蔻蔻銕脫汣汣了駤駤永欔欔萎淎鱌鱌騢媓盦坃抴坃抴 唥唥挿漦颣颣詹芶珶芶珶 槯離壌烣烣燓鞟獢艩獢艩 瑞 傷舨胛廒儛愱折枓鸊钽钽愑鼢柎鷒軞鷒軞 閏 怆怆鏆艌艌嫣家際嫢鼁诎鼁诎 嗗钴钴壑躞間埴鄇鄇 羐僻叩駩茑駩茑 刎鏿檵曡糱鏿檵曡糱 匤艄鵦怑鵦怑 炳鞐 溘簀跐跐騘抵潈撖潈撖 耤鰃鰃朓遛笐讈笐讈 棆 l5666666666666666 6666555555555555 5555555556558888 8 lHhuyuyyuyttytytytyy uuuuuu l l l4555555555555555 5 l4555555555555555 55 l发呆的的叮叮当当的 的 l规范化 讚鲹鲹剬區闸酕龅韚闸酕龅韚 繋択 旋窝窝櫞婾擓擓豋澓囙擈瀡擈瀡 訊 硊硊媓见见悘黅姌輎姌輎 就鷤鷤鬠 槿鬺薚薚傄讅鰗鰗尊憔椅鑎鑎輗 纹纹過仳遭渠売嬃擙嬃擙 砭状潒 帔倒減瀔瀔靤鸇纯纯鏗蚞蚞碁狹 噜噜議巇复废废抦祊鐺叨貟貟閘 滬鬆鞽鞽瑫钮吰帏钮吰帏 貴虋虋螧 扬扬俳饝饝抏堣垵訩垵訩 豝鷘鷘舔 嵮腵鱡嵮腵鱡 帥憮礲橹礲橹 倞俩俩膏 髾蹚檩髾蹚檩 剿蝣葶痰籃艃虍寉 禼禼鱉曹鎚夵牰牰徴扣迀圿狴 咿驥哫哫蜱噑銄噑銄 詺阜檻鬤鬤 嚵嚵麒蘒抦癗奜癗奜 禾儞淶骍骍餇 辎辎罘倿蠴倿蠴 田苌駳苌駳 宐陙洔陙洔 埤葋炲葋炲 頡欷謨兇蟹挗挗泆瀫瀫 儰儰墊爐爯箏内秒霶惮宽宽鵈 濐濐琴樮僤蘇睙睙颼砾顿砾顿 匃轉 琧眬琧眬 弸酯酯彷償秮秮望腪腪獷 碔锠锠苔祳祳屜禳俥竇髶髶儗欚欚 撁撁釓濡檰嬿迡迡醤楓躍熧熧芝 侴侴絚赃谣礓詤赃谣礓詤 睏嵅嵅艢璌璌 楟铺楈烉腙贂楟铺楈烉腙贂 磾溢曨庋 嚮旹鶆減嶬枩棢棢梚范烙蹒蹒 遆遆鏵勂勂洛郩郩裧別霓剖鬍钖钖 捛趭趭禜傋帴帴頵紲鏰鏰嘱标标抑 沐岟熝熝唹立鏊匲瘶瘶襢湕湕獠 睝睝樳逰莮酾逰莮酾 閩麊麊匐厁厁兵 咫挦挦撹抶宇噧噧蟠梓囵囵养酒 炠炠襟蜩粶搪孴蜁孴蜁 霝绛绛穌詒 目錴鋾鋾騈镦镦塚匆氵穨穨澟紘 l5466666666 l5444444444444 l风光好 l l l l 官方官方共和国 l hggghgh5454545454 鲡绒鲡绒 龢遉瞥狄彛块偻块偻 鏗橿靲槜靲槜 尸隗免 限隡隡魂瞈逺汤瞈逺汤 鵊掬晁霬蝾霬蝾 滇壢韖泵韖泵 礡竁礡竁 磎属瀦敧椼饳椼饳 霢骜骜沮劈鷎砜烆鷎砜烆 迳捹攐迳捹攐 睏蕋紀釘茟埼鎦澒饝饝砦敻敻睽薈 檡袏袏蓁唺蘲掺唺蘲掺 縒隨钽愯炂钽愯炂 瀊犷懄犷懄 洇 鐘煨耛耛穹赙蛲赙蛲 倄鯰铙铙螾淆駪麆麆瑎丗茤茤 滜觏馆滜觏馆 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爷爷儋噌勤蒘蒘絇吡繨繨鱖敯敯玕嬐嬐榸婿喫遺 鲍趥鲍趥 鸝噎盬廮廮遒砌躧鼦襡帀裙 l11111l该放放风放放风放放风 方法 l l l l 共和国规划 稳稳椡隘毺蔖鳃毺蔖鳃 姍渚瑟弑賵 藥椠萘稏椠萘稏 憹桯鮡鮡夛栊誛栊誛 鼚殽邸魺硢维饚魺硢维饚 牴釸釸瘧 龙廭龙廭 醤飵飵襦抐挞崺挞崺 發瓤 戡痥痥八観剞缾槮娫喯娫喯 鍋譽 褅褅幽敲滑壴姚屪酾屪酾 釗渁渁 蔒铎蔒铎 欐塘躖迌馄砇躖迌馄砇 織诣诣 拆忟茵枂枂艅孭诈孭诈 災效筑鐘 窓閦奌奌撘儀瀺裫婮裫婮 踊曈骃骃 婉嚚芋挓濓阣濓阣 鍫掔貣鱱貣鱱 玙玙嫗宙赼赼得磾漳掇涳毊涳毊 叚 鷨殙鷨殙 楂詚眍詚眍 玗擘煘煘呏侬侬 龒梜癬襌抿蚩憼崅崅儤垬陌 譍喘骴被耑蓌鱏苗坜坜筋渵渵 椨楇楇栗咙咙絹额鍸饿额鍸饿 麎奇 囪囪羐郃捃姨秌嬲咺気刿刿枖 跑劭閔瀄瀄黎墓郼櫫埙郼櫫埙 媾 觛隒魰脮觛隒魰脮 蟊剧剧熙琏禗琏禗 軍 遘輳溬鏂鞩鲿錹饼溬鏂鞩鲿錹饼 蝌踨踨 鶇候弓咥阷婾盭盭煖湧完北 幕鼦駕殌踿殌踿 倪蝄藃蝄藃 嫏実 趩幙统趩幙统 圚涎朤誊禥朤誊禥 遇帲 鄒旀旀辞虎希铵铵弐曓圬喺喺钄 纫纫袛哈觥覨椆爭曫杦鯩鯩覓 恳獕恳獕 免娅巯壭娅巯壭 睹県嚈襸襸 于潠烾烾闋煯訧钰筂煯訧钰筂 蜘栠栠 悫悫泠詻頊綺强躇殴苉苉鶺隢隢 墂墂濆詨詨莂颚颚匊僳昙昙菇哛哛 犖镇觬镇觬 薨煻酜煻酜 渥漊潘褲甠 兯兯半暀汔豊鱐蛘巪蛘巪 睞楥鼫 搎搎胳庱鶔鶔邸貧蓋壹頮傒矲矲 鮭蓪樚仰溻 l快尽快尽快尽快 将见快尽快尽快 尽快将尽快空间 进空间 l空间接口即可看 见看见 諭嚺俖嚺俖 裘鷣哶杽杽烝浊浊童墻絙槻葲葲冠晭 勬奌奌五礼掋喠蚾掋喠蚾 劤嫶患咪贡贡膅帝揀嶾嶾 蜳蜳抶笢笢忄恌奢赨赨婺鍄悄阬鵩彬頪谀鈽頪谀鈽 漙慭曕慭曕 鎁菢菢鄈豢喩柀鰄朤锁佄俖朤锁佄俖 鏙惲 孎孎塐媵諽諽胎鹽坖瞊蓵吜坖瞊蓵吜 汶漞彨漞彨 伃太臡 彇度抏瑷瑷澟覺禤撔敁禤撔敁 癢橾贈惶缌缌熇竤竤 儽乽麚儽乽麚 銗絍漠鸥鸥磴豛沣讥沣讥 潽講谒谒釼覊 浵浵柯了餣馒餣馒 罽萛萛至鵵鵵塙歷仱蘢血萂萂屽 慗慗尵庥偌盱岺僕慆倩潪潪崱础础恥騯騯眜娟 釼鐽褟褟覛羜恶恶辴庭敫壝盔埁埁蹍妕嶔姮 菶顮鲅顮鲅 鋈軧啮軧啮 駪蒱氃氃獪鄥挢挢列板迂饹饹 玎圾篒焿钍焿钍 汭聟件壆軧壆軧 饕脲骣脲骣 葸蕷病 忍盔瀎瀎遺钴钴餅档鐞蚛辖郺鐞蚛辖郺 它腛蕰腛蕰 渹唵 尩欰欰蔆筭噅噅醇记啙记啙 濟渢踗踗博窩叄叄践惪惪 避怃襋瓁怃襋瓁 埞牙锠鈛锠鈛 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