《凝胶渗透色谱》PPT课件.ppt

第5章 凝胶渗透色谱法 色谱原理 流动相:载气 固定相:固体吸附剂等 图 气相色谱对样品分离过程示意图 色谱谱图解析 一 谱图表示方法: 横坐标 时间 纵坐标 检测器响应信号的大小 色谱图 色谱图的解析: 色谱峰的位置 色谱峰的大小和形状 色谱峰的分离 保留值: 保留时间 死时间 调整保留时间 与固定液用量有 关 比保留体积 相对保留值 保留指数 色谱过程方程: VR=VM+VR VR=VM+KVS 色谱的保留值与热力学系数联系起来 色谱流出曲线方程：研究色谱峰形 塔板理论：高斯分布曲线 标准偏差： 描述色谱峰大小的参数： 峰高h 峰宽 分离度：描述峰分离情况 分离因素：保留值 峰窄 色谱定性分析依据保留值 与已知组分的保留值相比 与其它分析方法连用 如 色谱定量分析峰高或峰面积判断分析 物 的含量 色谱优缺点： 高效快速分离技术 难以鉴别分离组分 1.GPC的基本机理 凝胶渗透色谱是一种液相色谱，原理是利 用高分子溶液通过一根装填有凝胶的柱子， 在柱中按分子大小进行分离。 柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度 很高的球形凝胶。其中的凝胶类型有很多， 都是根据具体的要求而确定（常用的有聚苯 乙烯凝胶）。然而无论哪一种填料，他们都 有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多 按一定分布的大小不同的孔洞。 尺寸不同的高聚物分子，按其分子大小能自由 地渗透进和渗透出这些凝胶孔洞。 凝胶孔洞与分子尺寸是相适应的，超过这个尺 寸的大分子就不能渗透进去，它们只能随溶剂的 流动而在凝胶粒子之间的空间中流动。因此，大 分子比起小分子来说，在柱中的行程就短得多。 根据大小分子不同的行程就可以把混在一起的 高聚物分子逐级分离开来，先分离出来的是大分 子，较小的聚合物分子受到溶剂分子的排斥也随 后分离出来，然后再用一定的方法检知每级中溶 质的浓度和分子量。 根据这一经典原理，用于测定高聚物的分子量 是很适宜的，因为它易于实现自动化，而且分析的 重复性好。 2.凝胶色谱仪 依照凝胶色谱的特点，在测定聚合物分 子量分布曲线时，需要同时测定每个级分 的浓度和分子量，因此除了和一般HPLC中 所用到的浓度检测器如示差折射、紫外等 检测器外，还配有分子量检测器。分子量 的检测方法主要有两大类：一类采用间接 测定法，另一类采用直接测定法，如粘度 法和光散射法。 2.1间接测定法 这是通过测定淋洗体积推测相应的分子 量。如用虹吸法或计滴法来测定淋洗体积 。随着凝胶色谱的不断发展，仪器流动相 速度的稳定性不断提高，也可以直接测定 保留时间作为分子量标记。 间接法测定分子量的优点是仪器设备简 单，但不能直接得出分子量的数值，需采 用标准进行校正，数据处理较为复杂。 2.2粘度法 用自动粘度检测器测定柱后流出液的特性粘度 。依照Mark-Houwink方程： 即可换算得出聚合物的分子量M。上式中，K和 为常数，与聚合物类型、溶剂和溶液温度有关。 已知K，值,可以算出绝对分子量，否则，只能推 测出相对分子量。 自动粘度检测器有两种型式：一种是间隙式， 测定一定体积的淋出液流经毛细管粘度计的流出 时间；另一种是连续式，测定柱后淋出液流经毛 细管粘度计时在毛细管两端所产生的压差。 2.3光散射法 用此法可以直接测出淋出液中聚合物的重均分 子量，是一种测定绝对分子量的方法。 该法所使用的仪器为小角激光光散检测器（ low angle laser light scattering, LALLS），其工 作原理如下：当光通过高分子溶液时，会产生瑞 利散射，散射光强度及其对散射角（即入射光与 散射光测量方向的夹角）和溶液浓度C的依赖性 与聚合物的分子量、分子尺寸、分子形态有关， 因此可用光散射的方法研究高分子溶液的分子量 等参数。 采用瑞利比R来描述散光： 式中Io和I分别代表入射光和散射光强度；r 代表观测点与散射中心的距离。 LALLS与一般光散射方法相比，其特点是 可以在0和C0的条件下测定，使计算 大大简化， R 和溶质的重均分子量Mw的关 系为 式中，A2为第二维利系数，需事先测定，K 为仪器常数： 式中，N为阿佛加德罗常数；使入射光波 长；n是溶液的折光指数。当测定溶液的浓 度C0时，该项可忽略。这样式子可以化 简为： 式中的C为流出液中样品的浓度。因此在 GPC中，只要有浓度型检测器和LALLS联 用，就可以直接测出液中样品的重均分子 量。 实验部分 GPC仪的组成： 泵系统、（自动）进样系统、凝胶 色谱柱、检测系统和数据采集与处 理系统。 泵系统： 包括一个溶剂储存器、一套脱气装置和 一个高压泵。它的工作是使流动相（溶 剂）以恒定的流速流入色谱柱。泵的工 作状况好坏直接影响着最终数据的准确 性。越是精密的仪器，要求泵的工作状 态越稳定。要求流量的误差应该低于 0.01mL/min。 色谱柱： GPC仪分离的核心部件。是在一根不锈钢空心 细管中加入孔径不同的微粒作为填料。 填料（根据所使用的溶剂选择填料，对填料最基本的 要求是填料不能被溶剂溶解）：交联聚苯乙烯凝胶（ 适用于有机溶剂，可耐高温）、交联聚乙酸乙烯酯凝 胶（最高100，适用于乙醇、丙酮一类极性溶剂）多 孔硅球（适用于水和有机溶剂）、多孔玻璃、多孔氧 化铝（适用于水和有机溶剂） 柱子：玻璃、不锈钢 检测系统： 通用型检测器：适用于所有高聚物和有机化合物的检 测。有示差折光仪检测器、紫外吸收检测器、粘度检 测器。 示差折光仪检测器：溶剂的折光指数与被测样品的折光指数有尽 可能大的区别 紫外吸收检测器：在溶质的特征吸波长附近溶剂没有强烈的吸收 。 选择型检测器：适用于对该检测器有特殊响应的高聚 物和有机化合物。有紫外、红外、荧光、电导检测器 等。 实验部分 影响因素： 色谱柱、溶剂的选择 色谱柱： 每根色谱柱都有一定的相对分子质量分离范围和 渗透极限，色谱柱有使用的上限和下限。色谱柱的使 用上限是当聚合物最小的分子的尺寸比色谱柱中最大 的凝胶的尺寸还大，这时高聚物进入不了凝胶颗粒孔 径，全部从凝胶颗粒外部流过，这就没有达到分离不 同相对分子质量的高聚物的目的。而且还有堵塞凝胶 孔的可能，影响色谱柱的分离效果，降低其使用寿命 。色谱柱的使用下限就是当聚合物中最大尺寸的分子 链比凝胶孔的最小孔径还要小，这时也没有达到分离 不同相对分子质量的目的。所以在使用凝胶色谱仪测 定相对分子质量时，必须首先选择好与聚合物相对分 子质量范围相配的色谱柱。 实验部分 溶剂的选择： 能溶解多种聚合物 不能腐蚀仪器部件 与检测器相匹配 实验部分 色谱柱对于多分散聚合物的分离作用是基 于体积排除机理，与分子量没有直接联系 。 把激光光散射与凝胶色谱仪联用，在得到 浓度谱图的同时，还可得到散射光强对淋 出体积的谱图，从而计算出分子量分布曲 线和整个试样的各种平均分子量。 实验部分 把GPC仪与光散射仪连用，由光散 射仪连续测定聚合物样品中各个级分的 相对分子质量，由GPC仪中的浓度示差 检测器检测各个级分的浓度，就可以得 到聚合物的各种平均相对分子质量。 实验部分 激光光散射实验中必须对样品严格除尘，溶 液中的灰尘会产生强烈的光散射，严重干扰聚合 物溶液光散射的测量。溶液除尘是光散射成败的 关键。首先是溶剂除尘，配置测试样品的溶剂应 进行精馏，并经过0.2m超滤膜过滤后方可使用 。配好的溶液也要用0.2m的超滤膜过滤。另外 ，测试中所用的器械，如：注射器等，使用前要 用洗液浸泡，清水强力冲洗。 3.凝胶色谱分离机理 3.1凝胶色谱的色谱过程方程 凝胶色谱柱是用多孔材料填充的，其分离 能力与填料孔径无关。 GPC柱的总体积有3部分组成，即填料骨架 体积、填料孔体积及填料颗粒间体积。其 中填料骨架体积对分离不起作用，柱空间 体积主要由后两部分组成。 因此当把色谱方程VRVM+KVS用于凝胶色 谱时，VM代表填料颗粒间体积，VS代表填 料孔体积，VR也称为淋洗体积。样品在分 离过程中，大分子的保留体积为VM，小分 子的保留体积为VM+VS。分配系数K在0到1 之间。 3.2分离机理简介 在现在，虽然GPC已经得到了广泛的应用 ，但是就连基本的分理机理都处在百花争 鸣的阶段。目前模型机理可分为4大类： 3.2.1平衡排除理论 依据色谱方程，认为分离处于平衡时，即溶质在 胶体孔洞内的停滞时间大于它扩散入与扩散出孔 洞所需的时间，分离的过程就既不受扩散控制也 不受扩散影响。 胶体的孔洞具有一定的孔径分布，大分子可以渗 透进去的孔洞数目比小分子少，即排除体积大。 同时，大分子渗透进孔洞的深度也比小分子浅， 容易被淋洗液冲出来。所以在色谱柱内，大分子 经过的路程比小分子短，先流出来，而小分子后 出来。当溶质分子相当大时，以致全部都被排斥 在胶体孔洞之外，K=0，即VRVM。而当溶质分 子相当小时，K1，VRVM+VS。 3.2.2限制扩散理论 该理论认为分离不处于平衡态，即溶质分 子扩散入与扩散出孔洞的时间近乎它的停 滞时间。胶体孔洞内部的流体摩擦效应使 溶质的扩散速度降低，溶质分子越大则摩 擦效应就越大。因此，大分子难于向孔洞 内扩散渗透，先被淋洗出来。 3.2.3流动分离理论 流动分离理论的模型把填料的孔洞假设成细长 管子。当溶液在细长管子中高速流动时，就存在 流速场，即管子中间的液体比靠近管壁的液体流 动快，就形成一个抛物线的流速场。 由于半径大，大分子的溶质在流动时不能靠壁 而被集中到管子的中心区域，故靠近管壁的是小 分子。在抛物线形流速场的影响下，中心区域大 分子的流速较快，从而先从柱子中流出来；小分 子靠近管壁流速慢，经过足够长的距离后就可以 到达分离的目的。 4.数据处理 4.1凝胶色谱谱图 凝胶色谱谱图与一般的色谱谱图是一样的，横 坐标代表色谱保留值，纵坐标代表流出液体的浓 度。 横坐标的值表示了样品的淋洗体积或级分，这 个值是与分子量的对数值成比例的，表示了样品 的分子量； 纵坐标的值是与该级分的样品量有关，表征了 样品在某一级分下的质量分数。 因此凝胶色谱谱图可看作是以分子量的对数值 为变量的微分质量分布曲线。 对于单分散相的高聚物样品，其色谱的保 留值（在凝胶色谱中称为峰位值）即表征 了样品的分子量。一般这种单分散性的色 谱曲线可以用高斯分布函数表示： 式中，V为淋洗体积；Vp为色谱峰的峰位淋 洗体积；W(V)为样品的质量函数；W0为样 品质量；为标准偏差。 对于多分散性样品，其凝胶色谱曲线是许 多单分散性样品分布曲线的叠加，如下图 所示。曲线下面的面积正比与样品量，是 各单分散性样品量的总和。这种曲线的形 状不一定与高斯分布函数一致，而是和样 品的分子量分布状态有关，因此色谱峰的 峰位不直接表示样品的平均分子量。在这 种情况下，需通过数据处理来获得平均分 子量。 4.2分子量校正曲线 由凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是 把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V转化为分子量M， 这种分子量的对数值与淋洗体积之间关系曲线（ lgMV曲线）称为分子量校正曲线。该曲线测量 的精度直接影响到凝胶色谱测定的分子量分布精 度，因此分子量校正曲线的确定成为凝胶色谱中 关键的一环。 校正曲线的测定方法很多，大致可分为两大类 即直接校正法和间接校正法。 4.2.1单分散性标样校正法 选用一系列与被测样品同类型的不同分子 量的窄分散性（d0。 如果校正曲线是非线性的，则可用曲线方 程或多段折线方程表示。 这种测定校正曲线的方法简便，准确性高 ，但获得于被测样品相同类型的窄分布高 分子样品比较困难，限制了它在实际中的 应用。 4.2.2渐近试差法 在实际工作中，有时不易获得窄分布的标 样，可选用23个不同分子量的聚合物标 样（平均分子量需精测量，为已知的）采 用一种数学处理方法即渐近试差法。可计 算出校正曲线，由于这种方法不需要窄分 布样品，因此也可称为宽分布样品测定校 正曲线法。 先对已知样品进行GPC分析，得到GPC谱图，然 后依照线性校正曲线任意规定一组A和B的值，得 到一条校正曲线，依照此方程计算已知标样平均 分子量，把所得到的数据与原始数据进行比较， 如不符合再修正A、B值，再重新计算，这样反复 试差，直至计算出的结果与已知标样相差在允许 的误差范围内（一般小于510），即可确 定校正曲线。这种方法用手算是比较麻烦的，目 前已能编制成程序由计算机来完成。 渐近试差法的优点是不需要窄分布标样，实验操 作方便，其缺点是不能凝胶柱的排斥和渗透极限 ，只能适用与线性的校正曲线，得到的校正曲线 也只是近似的。 4.2.3普适校正法 GPC反映的是淋洗体积与高聚物流体力学体积之 间的关系。各种高聚物的柔顺性是不同的，分子 量相同而结构不同的高聚物在溶液中的流体力学 体积也是不同的。因此由上述方法介绍的两种方 法所确定的校正曲线只能用于测定与标样同类的 高聚物，当更换高聚物类型时，就需要重新标定 。如果校正曲线能用高聚物的流体力学体积来标 定，这类校正曲线就具有普适性。 如果用lgMV作校 正曲线应该比lgMV 的校正曲线更具普适 性，也就是说，不同 的高聚物，在相同的 GPC实验条件下，当 其淋洗体积相同时， 下式成立： 把MarkHouwink方程：代入上式再经过 一些公式的化简可得： 因此只要知道两种聚合物样品在实验条件 下的参数K1，1和K2，2的值，就可由一 种高聚物的校正曲线以上式换算成第二高 聚物的校正曲线。 此方法的优点是主要一种高聚物（一般采 用窄分布聚苯乙烯）作校正曲线就可以测 定其他类型的聚合物，但先决条件式两种 聚合物的K和必须是已知的，否则无法进 行定量计算。 4.3分子量分布的计算 单分散性样品只有测出GPC谱图就可以从 图中求出保留值，然后直接从校正曲线查 出对应的分子量。 计算多分散性样品分子量分布由两种方法 ：一种是函数法，另一种是条法。 4.3.1函数法 这种方法是先选择一种能描述测得的GPC 曲线的函数，然后在依据此函数和分子量 定义求出样品的平均分子量。在实际中由 于许多聚合物谱图是对称的，近似于高斯 分布，因此应用最多的是用高斯分布函数 来描述。 为了能够更好的表示出分子量，将高斯公 式进行化简： 式中，B12.303B。 则可以得到分子量为 自变量的质量微分分布函数 ： 其中B1；MP为峰位分子量，可由校正 曲线中查出。将其代入 和d的定义中可 得到： 4.3.2条法 当谱图不对称或出现多峰时，就不能近似成高斯分布函数 ，则上式不适用 。 把GPC曲线沿着横坐标分成n等分，然后切割