PEG诱导细胞融合.doc

科目 细胞生物学实验 实验题目 动物细胞融合 日期 2013.03.07 姓名 * 系年级 2011级生物基地 学号 * 实验一 利用聚乙二醇为媒介物进行细胞融合摘要细胞融合(cell fusion)是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心，震动，电刺激）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。关键词细胞融合；人工诱导；PEG前言人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体，单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点。因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。一 实验目的1. 了解动物细胞融合的常用方法及原理。2. 掌握利用PEG为介导物对细胞进行诱导融合的方法。3. 观察动物细胞融和过程中细胞的行为和变化。二 实验原理化学融合剂聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是乙二醇的多聚化合物，是存在一系列不同分子量的多聚体。PEG可诱导细胞间的融合，主要有两方面的原因：第一，PEG可以破坏和干扰各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散，进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相邻的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。第二，PEG 可与水分子借氢键结合，在高浓度的PEG 溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，引起细胞融合。为了发挥PEG 促进细胞融合的效力，必须采用较高浓度的PEG 溶液，但在高浓度PEG 溶液下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG 融合技术的关键。利用PEG诱导细胞融合,其融合效果受以下几个因素的影响：1.PEG的分子量：细胞融合效果与PEG的分子量成正比，但PEG的分子量越大，对细胞的毒性就越大。在实验时常常采用的PEG分子量一般为8001000。2. PEG的浓度：细胞融合效果与PEG的浓度成正比，但PEG的浓度越高，对细胞的毒性就越大。在实验时常常采用的PEG浓度一般为4060%。3.PEG的pH值：经验证，PEG的pH值在8.08.2之间融合效果最好。4.PEG的处理时间：处理时间越长，融合效果越好,但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在15分钟。5.融合时的温度：由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。为了获得更好的融合效果,在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细,一般采用的温度为3840。本实验所用材料为鸡的血细胞，这是因为:1).鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；2).实验材料便宜、易得。细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有一个核，为未融合细胞；有二个至多个核，为融合细胞。三 实验材料1. 材料用Alsever液悬浮的鸡血红细胞2. 器材普通光学显微镜、离心机、离心管、滴管、载玻片、盖玻片。3. 试剂Alsever 液(pH7.4)、0.85生理盐水、GKN 液、50PEG四 实验步骤1. 取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（4下保存）。（已由老师完成）2. 取上步中所得悬液1ml+4ml 0.85的NaCl溶液，进行以下离心处理：1200r/min离心5min。3. 将上步的沉降血球（去上清液后，约0.1-0.2ml），加入GKN液至1-2ml，使之成10%的细胞悬液。4. 取上述10%的血球悬液1ml，加入3ml GKN液，使每毫升含血球15000000个，即1.5107个/ml。5. 取步骤4中所得悬液，按以下三种方式进行混匀，滴片，2-3min后观察：（1）1ml+0.5ml 50%的PEG液（这一管标记为1号）；（2）0.5ml+0.5ml 50%的PEG液（这一管标记为2号）；（3）0.5ml+1ml 50%的PEG液（这一管标记为3号）。观察在不同PEG液浓度下的细胞融合情况，并说明，细胞融合率是否随着PEG液浓度的升高而逐渐提高。五 实验结果1.细胞融合观察： 2.不同PEG浓度下，细胞融合率的比较：据实验观察比较：1ml+0.5ml 50%的PEG诱导的细胞融合率与0.5ml+0.5ml 50%的PEG诱导的细胞融合率都很低，而0.5ml+1ml 50%的PEG诱导的细胞融合率明显高于前两组。于是，可得出结论：在一定的PEG浓度范围内，随PEG浓度的升高，细胞的融合率随之升高。六 结果分析从实验结果可知，鸡血红细胞之间出现了不同程度的融合现象，并且随着PEG浓度的升高，融合率也随之提高。总体来说融合率还是不错的。主要原因如为：PEG的分子量、浓度、与PH 值较为适合诱导细胞的融合，与鸡血红细胞悬浊液接触时间适宜， 向混合液中吹气泡，使PEG与鸡血红细胞充分接触，以至于达到了比较高的细胞融合率。由于PEG的作用，一些细胞发生变形，因为PEG有凝集作用，红细胞发生多细胞的凝集反应。七 注意事项1. 放置离心管的时候一定要对称放置，这样才能转起来，保证不偏；2. 开启离心机的时候一定要将盖子盖上，保证安全；3. 在制备鸡血红细胞时要反复离心洗涤制备的鸡红细胞液以清洗掉杂质；4. 仔细标记好试管，以免出错；5. 镜下观察时要注意区分重叠细胞和融合细胞；6. PEG加到细胞悬液中2-3min后，用滴管向内部吹气，使PEG与细胞悬液均匀混合，以达到比较高的融合率；7. PEG对细胞融合的作用效果与毒害作用随着分子量的增加而增大，实验中由于不要求对融合的细胞进行进一步的培养，可以选择分子量较大的PEG，本实验中PEG分子量为4000。8. PEG对细胞融合的作用效果和毒害作用随着浓度的增加而增大。在实验过程中一般采用40%-60%浓度的PEG溶液，PEG 的浓度以50%为好。9. PEG的PH 值应控制在8.08.2之间。八 实验心得通过本次实验，我懂得了聚乙二醇诱导细胞融合的原理和方法，并成功的完成了实验。细胞融合是生物学中一项基本的实验技能，是未来从事有关生物方面的研究所必备的基本素养。在实验过程中，我体会到了其中的乐趣，也激发了我对科学研究的热情。上了这次实验课，我受益匪浅。PS：单克隆抗体的制备及应用单克隆抗体的制备1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。2、细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。(1)体内诱生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。(2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。单克隆抗体的应用1检验医学诊断试剂作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。并且单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。目前，应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于：病原微生物抗原、抗体的检测；肿瘤抗原的检测；免疫细胞及其亚群的的检测；激素测定；细胞因子的测定。单克隆抗体对抗原的识别，与多克隆抗体有很大的不同。不同试剂盒因使用的单克隆抗体不同，识别抗原的位点不同，导致检测结果有一定差异。因此，标准化问题还需要进一步研究。2蛋白质的提纯单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强