[基础科学]环境微生物实验指导书2012学年-叶劲松.doc

环境微生物学实验指导书叶劲松 编合肥学院 生物与环境工程系2010年8月目 录实验室规则3实验一 空玻璃器皿的洗涤、包装和灭菌，无菌水的制备5实验二 培养基的制备和灭菌9实验三 微生物计数、分离培养12实验四 光学显微镜使用、微生物形态观察和染色技术20实验五 环境表面卫生学指标的测定和特定功能微生物的筛选24实 验 室 规 则1) 实验室是办学的基本条件之一，是师生进行科学实验、开展教研科技活动，培养实验能力的重要场所。进入实验室要自觉遵守纪律不得喧哗吵闹，保持肃静，有秩序地入座。2) 实验前必须认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。3) 实验过程中要听从教师的指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字要简练、准确。完成实验后经教师检查同意，方可离开实验室。4) 实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。公用试剂用完后，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品（尤其是NaOH）洒落在天平、实验台面和地上。毛刷用后必须立即挂好，各种器皿不得丢弃在水池内。实验完毕，仪器洗净放好，将实验台面抹拭干净，才能离开实验室。5) 配制试剂和用无离子水要注意节省，按实验实际使用量配制，多余的重要试剂和各种有机试剂要按教师要求进行回收，不得丢弃。6) 配制的试剂和实验过程中的样品，尤其是保存在冰箱和冷室中的样品，必须贴上标签、写上品名、浓度、姓名和日期等，放在冰箱中的易挥发溶液和酸性溶液，必须严密封口。7) 配制和使用洗液必须极为小心，强酸强碱必须倒入废液缶或冲稀后排放。电泳后的凝胶和各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。8) 使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。使用分光光度计时不得将溶液洒在仪器内外和地面上。仪器发生故障应立即报告教师，未经许可不得自己随意检修。9) 实验室内严禁吸烟、饮水和进食， 严禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液体不得接近明火和电炉，凡产生烟雾、有害气体和不良气味的实验，均应在通风条件下进行。10) 实验完毕必须及时洗净并放好各种玻璃仪器，插好自动部分收集器上的试管，保持实验台面和实验柜内的整洁。11) 每组的仪器和玻璃器皿要用油漆编号，严禁抄拿他组仪器，不得将器皿遗弃在分光光度计内和其他实验台面上，打破了玻璃仪器要及时向教师报告，并自觉登记，并进行赔偿。12) 实验室内严禁吸烟！加热用的电炉应随用随关，严格做到：人在炉火在，人走炉火关。乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。实验完毕，应立即拨去电炉开关和关好水笼头，拉下电闸。离开实验室以前应认真、负责地进行检查水电，严防发生安全事故。13) 要精心使用和爱护仪器，如使用分光光度计时，不能将比色杯直接置于分光光度计上，并注意拿放比色杯时，不要打碎。仪器损坏时，应如实向教师报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。14) 实验室内一切物品，未经本室负责教师批准，严禁带出室外，借物必须办理登记手续。15) 每次实验课由班长或课代表负责安排值日生。值日生的职责是负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性的工作。16) 根据原始记录，独立完成实验报告。实验一 空玻璃器皿的洗涤、包装和灭菌，无菌水的制备目的1. 掌握玻璃培养皿、吸管、试管和三角烧瓶、载玻片和盖玻片等的洗涤、包装和灭菌。2. 了解无菌水的制备原理。3. 了解干、湿热灭菌的原理及应用范围。原理清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先觉条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。微生物实验要求无菌条件相当严格，因此器皿需要包装，以防后来染菌。采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为灭菌。灭菌是要进行微生物纯培养的需要。 实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌效果。高温主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子发生变性。高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。湿热灭菌的效果比优于干热灭菌。湿热下热量易于传递，更容易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，加速其变性。此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消毒等也是微生物学操作中不可缺少的常用方法。仪器和材料1. 玻璃器皿培养皿、吸管、试管、三角烧瓶、载玻片、盖玻片2. 仪器高压灭菌锅、电热烘箱3. 溶液2的煤酚皂溶液（来苏尔）或者0.25新洁而灭消毒液4. 其它洗衣粉或洗涤剂、牛皮纸、报纸、细绳、纱布、普通棉花、细铁丝（牙签）、试管刷、吸耳球、剪刀、试管硅胶塞、三角瓶硅胶塞等实验内容一.玻璃器皿的洗涤和包装 1 洗涤（1）培养皿、试管、锥形瓶和烧杯等 可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗刷剂刷洗，然后用自来水充分冲净干净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。装有固体培养基的器皿应该先将其刮去，至垃圾桶中，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2的煤酚皂溶液（来苏尔）或者0.25新洁而灭消毒液内24小时或者煮沸0.5小时，再用上法洗涤。带病原菌的培养物应该先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。盛放一般培养基用的器皿经上法洗涤后，即可以使用。如需要精确配制化学药品，或做科研用的精确实验，在自来水洗涤干净后，再用蒸馏水洗涤三次。洗刷干净的玻璃器皿放架台自然晾干或放入烘箱中烘干、备用。（2）玻璃吸管 吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管（含毛细吸管），使用后应该立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内（底部应该垫以脱脂棉花，防止投入时损坏），免得干燥后难以洗涤，待实验完毕后集中冲洗。如吸管顶（尾）部塞有棉花。则冲洗前，先将吸管尖端与装在自来水头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出来。（3）载玻片和盖玻片 用过的载玻片和盖玻片，如滴有香柏油，则a.要先用皱纹纸擦净或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，b.再在肥皂水中煮沸510分钟，c.用软布或脱脂棉擦净，d.立即用自来水冲洗，e.然后在稀洗涤剂中浸泡0.5-2小时，f.自来水冲洗去洗涤剂，g.然后用蒸馏水换洗数次，h.待干燥后浸于95的乙醇中保存备用。使用时在火焰上烧去乙醇。检查过活菌的载玻片和盖玻片应该先在2的煤酚皂溶液（来苏尔）或者0.25新洁而灭消毒液内24小时，然后按照上法洗涤和保存。2 包装（1）培养皿的包装 一般5-8套培养皿做一包，用报纸密密包紧。包好后干热或者湿热灭菌。如有装培养皿的金属筒，则不必包装。（2）移液管的包装 在距其粗头顶端约0.5cm处，用细铁丝(牙签)将少许棉花（勿用脱脂棉）塞入构成11.5cm长的棉塞。将塞好棉花的移液管的尖端，放在45cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条成30-45度夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式包在移液管外面，余下纸头折叠打结。很多吸管用一大张报纸包好，进行干或湿热灭菌。如有装吸管的金属筒，可以将包好的吸管一起放入筒内，进行灭菌。如果预计一次灭菌的吸管可以一次用完，可以不用报纸包而直接装入筒内灭菌。但是吸管尖端要朝向筒底，使用时，筒卧放，手将粗端抽出。（3）试管和三角烧瓶等的包装 用棉塞将试管口和锥形瓶瓶口部塞住，然后再在棉花塞和管口或瓶口的外边，用两层报纸或牛皮纸与细线包扎好。棉塞的制作：方法一：大小、厚薄适中的普通棉花（虽然脱脂棉质量较好，纤维细长，有利于棉塞的制作，但是脱脂棉最容易吸收空气中的水分而使棉花受潮，棉塞受潮后，用来封闭试管或三角瓶，空气中的微生物就会沿湿润的棉塞进入，引起杂菌污染。）一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。方法二： 按试管或锥形瓶的大小，取适量棉花铺成近正方形，中间稍厚，边缘稍薄。 折角：将近方形棉花的一角往里折，略成五边形，然后从一侧往另一侧卷紧。 整理：使边缘的棉花起缚线的功能，勿使棉卷松开，并使外形像未开伞的蘑菇。 方法三：如下图所示棉塞的直径和长度视试管和锥形瓶的大小而定，一般约1/3塞入管内。必须做到松紧合适、紧贴管壁，拔出时不松散、不变形。现有一些市售的棉塞的替代品，如硅胶塞、塑料（耐高温）或不锈钢的套管等，均可使用。二.干湿热灭菌高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。1加水 将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为止。注意切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。2装料 将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞。3加盖 将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀；4排气 加热待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出。一般认为，当水沸后约5min，表明锅内空气已排净。注意灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。5升压 当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。6保压 当压力表指针达到所需压力刻度时，控制热源。开始计时并维持压力至所需时间。本实验用121，20min灭菌(含糖培养基用0.56kgcm2的压力)。7降压 达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下降到零后，打开排气阀。放净余下的蒸汽后，再打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。注意压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。8无菌检查 将已灭菌培养基于37培养24h，无杂菌生长，即可待用。干热灭菌法干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、移液管等的灭菌；1装入待灭菌物品 预先将各种器皿用纸包好或装入金属制的培养皿筒、移液管筒内，然后放人电热烘箱中。2升温 关好电烘箱门，打开电源开关，旋动恒温调节器至所需温度刻度(本实验所需为160170)，此时烘箱红灯亮，表明烘箱已开始加热，当温度上升至所设定温度后则烘箱绿灯亮，表示已停止加温。3恒温 当温度升到所需温度后，维持此温度2h。4降温 切断电源，自然降温。5.取出灭菌物品 待电烘箱内温度降到70以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。注意1使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故；灭菌时，操作者切勿擅自离开，务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。2干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触以免包装纸烤焦起火。三.无菌水制备1.在每个250mL的锥形瓶内装99mL的蒸馏水，放入30粒玻璃珠于锥形瓶内，并且塞上棉塞。2.在每试管内装9mL蒸馏水，塞上棉塞或塑料试管盖。再在棉塞外包上一张牛皮纸。高压蒸汽灭菌，0.1MPa，20min。实验报告1.结果1记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件(温度、压力等)。2试述高压蒸汽灭菌的操作过程及注意事项。2.思考题1高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸汽才能打开锅盖?实验二 培养基的制备和灭菌目的1.了解培养基的配置原理。2.掌握培养基常规配制程序。基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和 NaCl 。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而 NaCl 提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下 96 时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在 40 时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。 由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其 pH 凋至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。 牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5. 0g 水 1 000mL pH 7.4-7.6仪器和材料1玻璃器皿培养皿（直径90mm），试管（15mm150nm），（18mm180mm）支，移液管（10mL），锥形瓶（250mL），烧杯（300mL）、量筒、玻璃棒2.药品牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、或市售营养琼脂培养基、蒸馏水3.试剂精密PH试纸6.4-8.4、1mol/L NaOH,1 mol/L HCl. 4.仪器电磁炉、天平、鉄架、漏斗、乳胶管、弹簧荚、玻管（1mL枪头）5. 其它药勺、称量纸、记号笔、试管棉塞、三角瓶棉塞、牛皮纸、报纸、线绳、实验内容 （一）培养基的制备1. 称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。注意：蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。2. 溶化在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网（电磁炉）上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水倒所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角烧瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.52.0的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化和灭菌同步进行，节省时间。注意：在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。1. 调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/L HCL进行调节。对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法、可参考有关说明书）。注意：pH不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH。4过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验勿需过滤）。5分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装装置见下图。 液体分装 分装高度以试管高度的1/4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。 固体分装 分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后趁热适当倾斜制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。 半固体分装 试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。6加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等）。以阻止外界微生物进入普及内而造成污染，并保证有良好的通气性能。7包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外加牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。（有条件的实验室，可用市售的铝箔代替牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好。）8灭菌将上述培养基以0.103Mpa，121，20min高压蒸气灭菌。9搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜（见下图）。10无菌检查将灭菌培养基放入37的温室总培养2448h，以检查灭菌是否彻底。培养基分装 斜面制作（五）灭菌实验报告思考题1. 培养基配制好后，为什么必须立即灭菌？实验三 微生物计数、分离培养实验目的1.掌握环境中分离培养微生物的方法，获得若干种微生物纯培养技能。2.掌握稀释平板计数和显微镜直接计数方法。基本原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。 纯培养的确定：确定其菌落观察特征；结合显微镜检测个体形态特征的确定。平板菌落计数法是将待测样品适当稀释后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经培养，由每个单细胞生长繁殖而成的肉眼可见的菌落。统计菌数，根据稀释倍数和取样接种量即可算出样品中含有效菌数。但，由于待测样品往往不易分散成单个细胞，长成的单个菌落可能来自样品中2-3个或更多细胞。因此平板计数法往往偏低。为了清楚阐述平板菌落计数法的结果。现在已倾向使用菌落形成单位而不以绝对菌落数表示样品的活菌含量。显微镜直接计数法时将少量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快捷、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板，Peteroff-Hauser计菌器和Hawksley计菌器等，他们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。本实验采用的是常用的血细胞计数板（也称血球计数板）。血球计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。仪器和材料1.菌源：堆肥样品2.培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。3.溶液和试剂：500mL无菌水、装有10颗玻璃珠的250mL的无菌三角瓶、 装有9mL无菌水的试管。4.仪器：天平、无菌药勺、无菌碾钵（含杵头）、无菌量筒（100mL）、无菌玻璃涂棒、无菌移液管（1mL）、无菌培养皿（90mm）、接种环、显微镜、盖玻片、试管架、酒精灯等。实验内容纯种分离纯种分离的方法有两种：稀释涂布平板（含浇注平板法）和平板划线法（一）稀释涂布平板分离法 1倒平板将融化并冷至约50的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，每个平皿约15mL培养基，凝固即成平板。取对照的无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖，倒置于40培养2448h后观察结果。倒平板方法如下图所示倒平板a: 皿加法 b:手持法2菌源取样：用无菌锥形瓶到堆肥现场取一定量的样品，迅速带回实验室。 3稀释菌液制备：将10管9mL的无菌水排列好，按101 、102 、103 、104 、105 、106 、107 、108 、109 和1010依次编号。在无菌操作条件下，取10克堆肥样品，碾钵中碾碎，用无菌水总计90mL反复冲洗，转入250mL无菌三角瓶，摇晃使菌液均匀。再用1mL的无菌移液管吸取1mL稀释菌液置于101试管中，将移液管吹洗三次，即为101 浓度的菌液。然后，再用1mL无菌移液管吸取1mL101浓度的菌液于102 9mL试管无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为102浓度菌液。同样方法，依次稀释到1010。注意：在稀释过程中，吸取不同梯度的菌液需换用不同的吸管。 4涂布取10套无菌培养皿编号，107、108、109各三个，另一个为空气对照。取一支1mL无菌移液管从浓度小的109菌液开始，以109、108、107为序，分别吸取0.1mL菌液于相应编号的培养基平板上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀。在无菌培养皿底部注明分离菌名、稀释度。稀释涂平板完毕，合上且标记空气对照培养皿。注意： 每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀。 此法接种量不宜太多，只能在0.5mL以下，培养时起初不能倒置，先正摆20-30min等水分蒸发后倒置。 不要用 1ml 吸管每次只靠吸管尖部吸 0.2mL 稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。也可采用如下浇注稀释分离方法：先加入0.2mL菌液到平皿内，然后当培养基加热融化冷至45-50左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和反时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于40培养24-48 h，然后观察结果。取“对照”的无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖，倒置于40培养24-48h后观察结果。倒置于40培养箱2448h，然后观察记录结果。5. 挑菌落 将长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到斜面上，置于40培养，待长出菌苔后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。如发现有杂菌，需要再一次分离纯化，直到得到纯培养。稀释分离法（二）平板划线分离1倒平板同上，稀释平板分离方法2. 划线分离在近火焰处，用接种环挑取菌悬液一环，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环深入培养皿内，在平板上轻轻划线。划线完毕后盖好皿盖，倒置，40培养2448h后观察记录结果。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。划线的方式可取图中任何一种。1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法1. 斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法接种技术由于实验的目的、所研究的微生物种类、所用的培养基及容器的不同，因此，接种方法也有多种，现简介如下：（）接种用具常用的接种用具有接种环、接种针、接种钩、玻璃刮刀、铲、移液管、滴管等。接种环和接种针等总长约25 cm，环、针、钩的长为4.5 cm，可用白金、电炉丝或镍丝制成。上述材料以白金丝最为理想，其优点是在火焰上灼烧红得快，离火焰后冷得快，不易氧化且无毒。但价格昂贵，一般用电炉丝和镍丝。接种环的柄为金属的，其后端套上绝热材料套。柄也可用玻璃捧制作。微生物的分离培养、接种等操作需在经紫外线灯灭菌的无菌操作室、无菌操作箱或生物超净台等环境下进行。 （二）斜面接种技术斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下 1接种前将桌面擦净，将所需的物品整齐有序地放在桌上。 2将试管贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人、组别、姓名等。 3点燃酒精灯 4将一支斜面菌种和一支待接的斜面培养基放在左手上，拇指压住两支试管，中指位于两支试管之间，斜面向上，管口齐平。 5右手先将棉塞拧松动，以便接种时拔出。右手拿接种环，在火焰上将环烧红以达到灭菌. 注意：环以上凡是可能进入试管的部分都应灼烧。 6在火焰旁，用右手小指、无名指和手掌夹住棉塞将它拔出。试管口在火焰上微烧一周，将管口上可能沾染的少量菌或带菌尘烧掉。将烧过的接种环深入菌种管内，先触及没长菌的培养基（或者冷壁）使环冷却，然后轻轻挑取少许菌种，将接种环抽出管外迅速深入另一试管底部，在斜面上由底部向上划曲线。抽出接种环，将试管塞上并插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完毕。试管拔塞后过火灭菌（a）和取菌接种（b）斜面划线 微生物计数方法（一） 稀释平板菌落计数法具体操作步骤同上稀释平板分离纯化，只是5.挑菌落，改为5.计数培养 24-48h 后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中菌落形成单位（cfu） = 同一稀释度三次重复的平均菌落数稀释倍数10 一般选择每个平板上长有 30-300 个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适，同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由 10-7 、 10-8和 10-9 三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。 注意：1. 平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后，所出现的平均菌落数在 50 个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。2. 涂布平板用的菌悬液一般以 0.1ml 较为适宜，如果过少，菌液不易涂布开；过多则在涂布完后或在的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快渗入培养基表层内，然后倒置 37 的培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式在外，还可以用涂布平板的方式（见上分离培养方法）进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于 37 左右的温箱中烘烤 30 分钟，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好恒温箱中培养 2448h 。 3. 已经有菌落计数器可以自动对于培养基上菌落进行自动计数。如下图所示美 国 进 口 全 自 动 影 像 分 析 菌 落 计 数 仪报价8.7万(含电脑一台,彩色照片打印机一台)感应压力计数系统，快速精确，使用简便 。3位数字LED显示，可计数0-999，每一次计数均有语音提示（中英文可选），避免漏数和重复计数 。可选明暗背景，无眩目背光，便于观察培养皿，操作不易疲劳 。可放置直径50-90mm培养皿 。放大镜放大倍数可变，可用于计数小菌落 。可弯曲的支臂连接放大镜，可清楚地观察培养皿 。我国数字显示式自动细菌检验仪器实验报告1.结果根据平板上生长的微生物菌落数量，计算出原样品中所含的微生物数量，以单位（CFU/克干重）表示。将培养后菌落计数结果填入下表：稀释度10-710-810-9123平均123平均123平均CFU数/平皿每毫升中的CFU数2.思考题1用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，应从哪个浓度开始？为什么？3. 如何确定平板上分离得到的单菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤实验四 光学显微镜使用、微生物形态观察和染色技术目的1.了解光学显微镜的结构、原理，掌握显微镜的操作和保养方法。2.观察细菌、放线菌和真菌的个体形态，学会生物图的绘制。通过观察和比较细菌、放线菌、酵母菌、霉菌和原生动物、后生动物的特征，达到初步鉴别上述微生物的能力。3.掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。基本原理（一） 显微镜基本原理微生物都是个体微小的生物，用肉眼不能看到它们的个体，所以观察它们的形态必须在显微镜下进行，另外微生物细胞具有较高的透明性，所以有些微生物（尤其是细菌和放线菌）需要经过染色后才能观察清楚，细菌个体很小，其大小以微米计，所以需要在油镜下观察。放线菌和霉菌的个体一般呈丝状，并且明显地分为基质菌丝和气生菌丝。成熟地个体还具有各种形态的孢子。显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。（二） 形态观察基本原理微生物都是个体微小的生物，用肉眼不能看到它们的个体，所以观察它们的形态必须在显微镜下进行，另外微生物细胞具有较高的透明性，所以有些微生物（尤其是细菌和放线菌）需要经过染色后才能观察清楚，细菌个体很小，其大小以微米计，所以需要在油镜下观察。放线菌和霉菌的个体一般呈丝状，并且明显地分为基质菌丝和气生菌丝。成熟地个体还具有各种形态的孢子。（三） 染色基本原理微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生地各种化学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样，碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力，易于吸附。但是，要使酸性物质染上酸性材料，必须把它们的物理形式加以改变（如改变pH值），才利于吸附作用的发生。相反，碱性物质（如细胞质）通常仅能染上酸性染料，若把它们变为适宜的物理形式，也同样能与碱性染料发生吸附作用。细菌的等电点较低，pH值大约在25之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。影响染色的其它因素，还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性，如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否，在染色上都起一定作用。此外，培养基的组成、菌令、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等，也都能影响细菌的染色。革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 由于微生物细胞含有大量水分（一般在80-90%以上），对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的明暗差。所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。但是，任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。仪器和材料1 显微镜、香柏油、二甲苯，擦镜纸、吸水纸；接种环、载玻片、盖玻片、酒精灯，生理盐水。2 示范片：大肠杆菌、放线菌、酵母和丝状真菌，以及钟虫、轮虫，微囊藻和眼虫等。3 菌种：大肠杆菌，枯草杆菌，或者培养皿中生长的细菌。4 草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95乙醇、番红复染液。操作步骤一：光学显微镜使用 （一）认识光学显微镜的结构1 机械装置：镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器1. 光学系统：目镜、物镜、聚光器、反光镜、滤光片（二）显微镜的操作方法1 低倍镜的操作（1） 置显微镜于固定的桌上，窗外不宜有障碍视线之物。（2） 旋动旋转器，将低倍镜移到镜筒正下方，和镜筒对直。（3） 转动反光镜向着光源处，同时用眼对准目镜，仔细观察，使视野亮度均匀。（4） 将标本片放在载物台上，使观察的目的物置于圆孔的正中央。（5） 将粗调节器向下旋转，眼睛注视物镜，以防物镜和载玻片相碰。当物镜的尖端距载玻片约0.5cm处时停止旋转。（6） 左眼向目镜里观察，将粗调节器向上旋转，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细调节器调节，至目的物清晰为止。（7） 如果粗调节器旋的太快，使超过焦点，必须从第（5）步重调，不应正视目镜情况下调粗调节器，以防没把握的旋转使物镜与载玻片相碰撞坏。（8） 观察时两眼同时睁开。单筒显微镜应习惯用左眼观察以便绘图。2 高倍镜的操作（1） 使用高倍镜前，先用低倍镜观察，发现目的物后将它一至视野正中处。（2） 旋动转换器换高倍物镜，如果高倍镜触及载玻片应立即停止旋动，说明原来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没有找到，要用低倍镜重调。如果调对了，换高倍镜时基本可以看到目的物。若有点模糊，用细调节器就清晰可见。3 油镜的操作（1） 如果用高倍镜目的物未看清，可用油镜。先用低倍镜和高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。（2） 在载玻片上滴一滴香柏油，将油镜移至正中使油镜头侵没在油中，刚好贴近载玻片。用细调节器微微向上调即可。（3） 油镜观察完毕，用擦镜纸将镜头上的油揩干净，另用擦镜纸蘸少许二甲苯揩拭镜头，再用擦镜纸揩干。（三）普通显微镜的保养显微镜是精密贵重的仪器，必须很好地保养。显微镜用完后要放回原来的镜箱或镜柜中，同时要注意下列事项：1、观察完后，移去观察的载玻片标本。2、用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭23次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。3、转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。4、将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。镜头的保护最为重要。镜头要保持清洁，只能用软而没有短绒毛的擦镜纸擦拭。擦镜纸要放在纸盒中，以防沾染灰尘。切勿用手绢或纱布等擦镜头。物镜在必要时可以用溶剂清洗，但要注意防止溶解固定透镜的胶固剂。根据不同的胶固剂，可选用不同的溶剂，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。方法是用脱脂棉花团蘸取少量的二甲苯，轻擦，并立即用擦镜纸将二甲苯擦去，然后用洗耳球吹去可能残留的短绒。目镜是否清洁可以在显微镜下检视。转动目镜，如果视野中可以看到污点随着转动，则说明目镜已沾有污物，可用擦镜纸擦拭接目的透镜。如果还不能除去，再擦拭下面的透镜，擦过后用洗耳球将短绒吹去。在擦拭目镜或由于其他原因需要取下目镜时，都要用擦镜纸将镜筒的口盖好，以防灰尘进入镜筒内，落在镜筒下面的物镜上。二：微生物形态观察实验内容和方法（1） 严格按光学显微镜的操作方法，依次按低倍、高倍及油镜的次序逐个观察细菌示范片或者培养皿中的细菌菌落，用铅笔分别绘出细菌的形态图。（2） 同法逐个观察放线菌的示范片或者培养皿中的放线菌菌落，绘出其形态图。（3） 同法逐个观察真菌示范片或者培养皿中的真菌菌落，绘出形态图。（4） 不用油镜，观察原生动物和后生动物教学示范片，绘出形态图。三 微生物的染色技术实验内容和步骤（一）细菌的简单染色步骤1 涂片取干净的载玻片于实验台上，在正面边角做个记号并滴一滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，将接种