固定化反胶团漆酶及其在修复土壤DDT污染中的应用.doc

生态环境 2008, 17(2): 606-610 Ecology and Environment E-mail: 基金项目：广东省自然科学基金项目（021016；036716）；广东省科技计划项目（2002C31603；2003C34505）；广州市科技计划项目（2007Z3-E0471） 作者简介：赵月春（1964），女，副教授，博士，研究方向主要是土壤有机污染生物修复。E-mail: *通信作者：E-mail: 收稿日期：2007-10-08 固定化反胶团漆酶及其在修复土壤 DDT 污染中的应用 赵月春 1，付蓉1，莫测辉2*，易筱筠3 1. 华南农业大学应用化学系，广东 广州 510640；2. 暨南大学环境工程系，广东 广州 510632；3. 华南理工大学环境科学与技术系，广东 广州 510640 摘要：采用吸附法将反胶团漆酶吸附在表面改性后的硅藻土上，制备固定化反胶团漆酶。探讨了反胶团漆酶固定化的影响因 素及其部分酶学特性，并对其在修复土壤 DDT 污染中的应用进行了研究。反胶团漆酶固定化的最佳温度是 35 ，载体硅藻 土的改性剂 Tween-80 的加入量为硅藻土质量的 15%。固定化反胶团漆酶的最适作用温度为 35 ，最适作用 pH 为 3.55.0； 与游离漆酶相比，固定化反胶团漆酶的热稳定性和酸碱稳定性都显著提高。采用游离漆酶和固定化反胶团漆酶修复 DDT 污 染土壤，游离漆酶处理中 DDT 总量（DDTs）的降解率为 50.53%，而固定化反胶团漆酶处理中 DDTs 的降解率高达 69.17%。 固定化反胶团漆酶处理较游离漆酶处理的 DDTs 降解率提高了近 20%。 关键词：反胶团漆酶；固定化；稳定性；DDT 中图分类号：Q93 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（2008）02-0606-05 漆酶（EC ）是一种含铜的氧化酶，由于 漆酶能催化氧化多种环境污染物，因此，在环境保 护方面得到广泛的应用。有机氯农药 DDT 作为一 种高效的杀虫剂曾被广泛使用。DDT 具有高毒、高 残留、持久性和生物蓄积性等特征，对生态环境和 人体健康有严重危害1。尽管我国早在 1983 年就 停用 DDT，但各地土壤中其检出率仍然很高，一些 地方甚至超标较严重，导致一些农产品中的 DDT 检出率高达 100%2。因此，需要对 DDT 污染土壤 进行修复，以确保农产品安全和人体健康。 本文的前期研究表明，漆酶能有效降解残留 在土壤中的 DDT3。但是由于土壤中土壤胶体的 吸附、过酸或过碱以及土著蛋白酶的生物降解等 作用，可导致漆酶在使用过程中变性失活，进而 引起降解效率下降等问题，限制了它的应用。为 了有效保持漆酶的活性和稳定性，很多学者研究 了漆酶固定化技术，主要的技术有吸附法4-6、交 联吸附法7-9、共价键结合法10-12和包埋法固定化 酶13-15。在吸附法中通常是将漆酶直接吸附在无 机吸附剂上，如 Gianfreda 等将漆酶直接固定在 蒙脱石、高岭土等载体上，保持了酶的活力和稳 定性16。但该方法仍存在酶与载体结合不牢固， 易脱落引起酶失活现象，使得降解效率降低17。 本实验采用先将漆酶制备成反胶团漆酶，然后将 反胶团漆酶吸附在改性硅藻土上的方法制备固定 化反胶团漆酶，并对固定化反胶团漆酶的部分酶 学性质以及其在修复土壤 DDT 污染中的应用进 行了研究。 1 材料与方法 1.1 材料 供产漆酶的多孔菌购自中国科学院广州化学 有限公司。邻联甲苯胺（上海化学试剂总厂）。AOT 气溶胶（浙江嘉善巨枫化工厂）。Tween-80（上海申 宇医药化工有限公司）。Sephadex G-75 葡聚糖凝胶 （瑞典 Pharmacia Biotech 公司）。供试土壤赤红壤 取自华南农业大学树木园，其质地为粉沙质壤土， pH（水/土=2.5/1）为 5.35，有机质为 7.89 g.kg-1，氮、 磷、钾分别为 0.71、0.72、2.61 g.kg-1，DDT 未检出 （检出限见下文）。DDT 的 4 种组分 P,P-DDE、O,P -DDT、P,P-DDD 和 P,P-DDT 的标准物质购于美 国 Supelco 公司。 1.2 方法 1.2.1 游离漆酶、反胶团漆酶和固定化反胶团漆酶 的制备 将多孔菌接种到以甘薯粉作碳源的好气纤维 分解菌固体培养基上活化，等菌种布满培养皿表面 时用 10 mm 的打孔器接种到马铃薯液体培养基中， 每 50 mL 培养液接入一片，放入 28 转速为 130 rmin-1的恒温摇床培养 9 d 后离心，取上清液即得 漆酶液。经盐析和 Sephadex G-75 柱层析纯化进一 步提高其活力，制得游离漆酶18。 在 100 mL 容量瓶中依次加入 pH 为 4.6 浓度 为 0.02 molL-1的醋酸-醋酸钠缓冲液 0.64 mL、酶 活为 37 U 游离漆酶液 2 mL 和含 0.1 molL-1 AOT 气溶胶和 0.0125 molL-1 Tween-80 的异辛烷溶液 97.36 mL，然后在磁力搅拌器上搅拌 12 h 得到含水 赵月春等：固定化反胶团漆酶及其在修复土壤 DDT 污染中的应用 607 量为 15 的反胶团漆酶液。 取 3 g 的硅藻土作载体，加入一定量的 Tween- 80 对硅藻土进行表面改性，充分搅拌均匀后加入含 水量为 15 的反胶团漆酶液 25 mL，混匀后在 30 下搅拌干燥，直至其成固体粉末状，制得固定化反 胶团漆酶。 1.2.2 游离漆酶和固定化反胶团漆酶的活力测定 以邻联甲苯胺为底物。取 0.1 mL 游离漆酶液 和 0.6 g 固定化反胶团漆酶，分别加入 0.1 molL- 1，pH 4.6 的醋酸盐缓冲液 3.4 mL，再加入 3.36 mmolL-1的邻联甲苯胺 0.5 mL，放入 25 恒温箱 中培养 25 min 后，放入 25 下 4000 rmin-1的离 心机上离心 5 min。采用 756MC 型紫外可见分光光 度计测 600 nm 处的光密度（OD 值）（测定固定化反 胶团漆酶的酶活力时取上清液），以蒸馏水做空白 对照。酶活力以游离漆酶和固定化反胶团漆酶与底 物反应 30 min 后光密度的改变值表示，以每分钟 光密度增加 0.01 为 1 个酶活力单位（U）19。 1.2.3 固定化反胶团漆酶对土壤中 DDT 的降解试验 DDT 溶液的制备：将 0.0547 g DDT 放入 100 mL 容量瓶中，用丙酮定容至刻度。此溶液 DDT 质 量浓度为 0.547 mgmL-1，置于 4 冰箱中保存备用。 在 50 g 过 60 目筛的土壤中加入 5 mL DDT 丙酮溶 液，搅拌均匀，室内风干后再与 450 g 过 2 mm 筛的 土壤混合均匀，即制得 DDT 污染土壤。放置 4 周后 进行漆酶修复试验。试验中保持土壤的含水率为 15%左 右。 每克土的加酶量为 6 U，设置对照处理、游离 漆酶处理和固定化反胶团漆酶处理共 3 个处理。每 个处理用土 15 g，设 3 个重复，分别置于烧杯中试 验处理 25 d。实验后将土壤风干，过 60 目备测。试 验前测定土壤 DDT 的 4 种组分 P,P-DDE、O,P- DDT、P,P-DDD 和 P,P-DDT 初始质量分数分别 为 0.357、0.764、1.432 和 2.342 mgkg-1，DDT 总质 量分数（DDTs）为 4.895 mgkg-1。 1.3 样品预处理与土壤中 DDT 的气相色谱分析 样品预处理和 DDT 的检测参照国标 GB/T1455093 方法进行20。 1.3.1 样品预处理 称取 10 g 土壤置于索式抽提器中，用体积比 为 11 的石油醚和丙酮混合液 100 mL 浸泡 10 h 后 抽提 6 h。同时做空白试验。将抽提液转移至分液漏 斗中，加入 10%的无水硫酸钠溶液，摇荡 1 min 后 静止分层，取上层石油醚层并加入相当于石油醚层 体积 1/10 的浓硫酸分配 34 次，直至上下层都呈 无色为止。再加入剩余石油醚层体积一半的 10%无 水硫酸钠溶液洗涤，直至石油醚层溶液至中性，过 无水硫酸钠脱水，浓缩，定容至 10 mL，待测。 1.3.2 土壤中 DDT 的气相色谱(GC)分析 DDT 标准溶液含 P,P-DDE、O,P-DDT、P,P- DDD、P,P-DDT 4 种组分，其质量浓度分别为 20、20、60.08、60 mgL-1，用丙酮（色谱纯）稀释出 4 个浓度系列。 气相色谱仪为 HP5890，色谱柱为 HP-5，30 m0.320 mm（id）0.25 um；载气为 99.999%的高纯 氮气，气化室温度 220 ，柱温 195 ，检测器 （ECD）温度为 245 ，载气流速 2 mLmin-1。采用 不分流进样，进样量为 2 L。用回收率指示物 (2,4,5,6-四氯间二甲苯)控制整个操作流程的回收率， 抽提样品用回收标样控制整个操作流程的回收率。 指示物的回收率为 78%88.6%，DDT 总量 （DDTs）的回收率为 88.4%98.7%。P,P- DDE、O,P-DDT、P,P-DDD 和 P,P-DDT 的检测限 分别为 0.902、3.869、2.847l 和 0.756 gL-1。 2 结果与讨论 试验数据采用 SAS 8.1 软件分析，运用 DMRT 法和 Duncan 法进行多重比较分析。 2.1 反胶团漆酶的固定化 2.1.1 温度的影响 温度对反胶团漆酶固定化的影响如图 1 所示。 从图 1 可以看出，在 3040 之间，固定化反 胶团漆酶的活力变化不显著，且活力都维持在较 高水平。但温度低于 25 或高于 45 ，酶活力会 受到影响，15 时相对酶活只有 77.03%（35 时 的酶活力按 100%计算）；50 相对酶活为 84.91%。温度影响分子热运动的速度，在相同的固 定化时间内,它将直接影响酶吸附到载体上的效率， 在较低的温度下进行固定化，固定化载体吸附反 胶团漆酶的量比较小；而固定化温度的较高时，分 子运动逐渐加剧，脱附速度加快，同时的温度升高 会引起酶失活变性，因此，反胶团漆酶固定化的最 佳温度是 35 。 1020304050 75 80 85 90 95 100 d cd c bc b ab ab a 相对酶活/% t/ 图 1 温度对反胶团漆酶的固定化的影响 （数据为平均值，具有相同字母的处理间无显著差异（P0.05） Fig. 1 Effect of temperature on the immobilization of reverse micelles laccase 608 生态环境 第 17 卷第 2 期（2008 年 3 月） 2.1.2 Tween-80 的影响 采用 Tween-80 对反胶团漆酶的载体硅藻土进 行表面改性，其加入量对固定化反胶团漆酶酶活力 的影响如图 2 所示。 从图 2 可以看出，随着 Tween-80 的加入量的 增加，固定化反胶团漆酶的活力逐渐增加且差异显 著，当 Tween-80 的加入量为硅藻土质量的 15时， 表面改性效果最好，此时固定化反胶团漆酶的活力 最高，但 Tween-80 的加入量的继续增加，酶活力则 开始下降，但差异不显著。因此，对载体硅藻土的 改性剂 Tween-80 的加入量为硅藻土质量的 15。 2.2 固定化反胶团漆酶的酶学性质 2.2.1 温度对酶活的影响及酶的热稳定性 温度对固定化反胶团漆酶活力的影响如图 3 所示。 从图 3 可以看出, 在 25 40 之间固定化反 胶团漆酶的酶活力随温度变化不显著；30 35 时 的酶活力略高于其他温度下的活力。固定化反胶团 漆酶的最适作用温度为 35 。 在不同温度下对游离漆酶和固定化反胶团漆 酶的热稳定性进行测定，结果如图 4 所示。 图 4 表明，固定化反胶团漆酶在 30 下保存 稳定，30 d 后活力还保留 92.1，而游离漆酶仅保 留 69.4；40 时固定化反胶团漆酶保存较稳定， 30 d 后活力保留 88.6，游离漆酶仅保留了 10.5；在 50 下保存 30 d 后固定化反胶团漆酶活 力保留 76.8，而游离漆酶仅保留了 6.2。可见固 定化反胶团漆酶的热稳定性显著提高。 2.2.2 pH 对酶活的影响及酶的酸碱稳定性 pH 对固定化反胶团漆酶活力的影响如图 5 所示。 由图 5 可见，固定化反胶团漆酶在 pH 3.05.6 时活力变化不显著，在 pH6.2 或 pH0.05） Fig. 2 Effect of Tween-80 on the activity of laccase 图 5 pH 对固定化反胶团漆酶活力的影响 （数据为平均值，具有相同字母的处理间无显著差异（P0.05） Fig. 5 Effect of pH on the activity of immobilized reverse micelles laccase 图 4 游离漆酶和固定化反胶团漆酶的热稳定性 Fig. 4 Thermal stability of free laccase and the immobilized reverse micelles laccase 图 3 温度对固定化反胶团漆酶活力的影响 （数据为平均值，具有相同字母的处理间无显著差异（P0.05） Fig. 3 Effect of temerature on the activity of immobilized reverse micelles laccase 2025303540 92 94 96 98 100 b ab ab a a 相对酶活/% t/ 051015202530 70 75 80 85 90 95 100 相对酶活/% 时间 /d 30 40 50 051015202530 20 40 60 80 100 相对酶活/% 时间 /d 30 40 50 0.000.250.30 70 80 90 100 c b b ab ab a 相对酶活/% Tween-80/硅藻土/g.g-1 234567 75 80 85 90 95 100 b ab a a c b ab a a 相对酶活/% pH 赵月春等：固定化反胶团漆酶及其在修复土壤 DDT 污染中的应用 609 力受到显著影响。在 pH 3.55.0 时固定化反胶团漆 酶的酶活力较高。 不同 pH 时对游离漆酶和固定化反胶团漆酶的 稳定性进行测定，结果如图 6 所示。 图 6 表明，固定化反胶团漆酶在 pH 3.55.0 时 保存比较稳定，pH 4.5 时保存最稳定，保存 30 d 活 力仅损失了 10.5。游离漆酶在 pH 3.0 下保存最稳 定，保存 30 d 活力损失了 28.2。可见，固定化反 胶团漆酶的酸碱稳定性也显著提高。 2.3 固定化反胶团漆酶修复 DDT 污染土壤 游离漆酶与固定化反胶团漆酶对 DDT 各组分 及总量的降解率如图 7 所示。 从图 7 可以看出，除 P,P-DDE 外，与不加酶对 照相比，DDT 其它组分及总量在游离漆酶及固定 化反胶团漆酶处理中的降解率均显著提高，而且在 反胶团固定化漆酶处理中的降解率显著高于它们 在游离漆酶处理中的降解率。不同组分降解率有所 不同。对于 DDT 总量（DDTs），在游离漆酶处理中 的降解率为 50.53%，在固定化反胶团漆酶处理中 的降解率高达 69.17%。固定化反胶团漆酶处理较 游离漆酶处理的 DDTs 降解率提高了近 20%。说明 固定化反胶团漆酶对 DDT 各组分及总量的降解优 于游离漆酶。这是因为固定化反胶团漆酶是先将分 离纯化的游离态漆酶制备成亲水基向内而疏水基 向外的反胶团漆酶，再将其固定在表面改性过的硅 藻土上，能较好的保持漆酶的活性和稳定性，从而 提高了固定化反胶团漆酶对 DDT 的降解效率。 对于组分 O,P-DDT、P,P-DDD 和 P,P-DDT， 它们在不加酶对照处理中的降解率为 6.48%25.88%；在游离漆酶处理中降解率为 42.00%62.36%；而在固定化反胶团漆酶处理中降 解率为 64.10%80.17%。 对于组分 P,P-DDE，不加酶对照处理中的降 解率为 1.56 %。在游离漆酶处理中的降解率为-1.20%。 而在固定化反胶团漆酶处理中的降解率为 6.07%。 图 6 不同 pH 下游离漆酶和固定化反胶团漆酶的稳定性 Fig. 6 Stability of free laccase and immobilized reverse micelles laccase under different pH P,P-DDE O,P-DDT P,P-DDD P,P-DDTDDTs 0 20 40 60 80 100 化 降解率/% dd c c c c b b b b a a a a d 对照 游离酶 固定 酶 DDT组分 图 7 游离漆酶与固定化反胶团漆酶对土壤中 DDT 各组分及总量的降解 （数据为平均值，同一组分不同处理间具有相同字母者 无显著差异（P0.05） Fig. 7 The degradation of ingredients of DDT and total DDT using free lacccase and immobilized reverse micelles laccase in the soil 051015202530 50 60 70 80 90 100 相对酶活/% 时间/ d pH=3.0 pH=3.5 pH=4.0 pH=4.5 pH=5.0 pH=5.5 pH=6.0 051015202530 20 40 60 80 100 相对酶活/% 时间/ d pH=2.5 pH=3.0 pH=3.5 pH=4.0 pH=4.5 pH=5.0 pH=5.5 610 生态环境 第 17 卷第 2 期（2008 年 3 月） 这一结果也说明游离漆酶处理过程中有新的 P,P- DDE 生成，从而使 P,P-DDE 浓度略有增大，降解 率为负值。 3 结论 反胶团漆酶固定化的最佳温度是 35 ，载体 硅藻土的改性剂 Tween-80 的加入量为硅藻土质量 的 15。固定化反胶团漆酶的最适作用温度为 35 ，最适作用 pH 为 3.55.0；与游离漆酶相比，固 定化反胶团漆酶的热稳定性和酸碱稳定性都显著 提高。采用游离漆酶处理土壤 DDT 污染，DDT 总 量（DDTs）的降解率为 50.53%，而在固定化反胶团 漆酶处理中 DDTs 的降解率高达 69.17%，固定化 反胶团漆酶处理较游离漆酶处理的 DDTs 降解率 提高了近 20%，固定化反胶团漆酶对 DDT 各组分 及总量的降解优于游离漆酶。 参考文献： 1 MARCO J A M, KISHIMBA M A. 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