教育部科学技术研究重点项目 结题（验收）报告.pdf

项目编号：109112 所属学科：家畜传染病学 教育部科学技术研究重点项目 结题（验收）报告 v200801 项目名称：口蹄疫重组仙台病毒活载体疫苗的研究 项目负责：钱平 承担单位：华中农业大学 起止时间：20 09 年 1 月 至 20 10 年 12 月 结题（验收）时间： 2012 年 6 月 16 日 教育部科技司制 2008 年 1 月 教育部科学研究重点项目结题（验收）报告 v 200801 教育部科学技术司 2 目目 录录 填写说明 一、结题验收项目成果简表 二、项目成果摘要 三、计划任务、考核指标及主要技术经济指标、计划执行评价 四、项目负责人项目完成期内个人基本情况介绍 五、研究取得的成果 六、成果转化情况，取得的经济、社会效益 七、人才培养情况 八、经费决算表 九、依托单位意见 十、有关附件： 附件 1. 教育部科学技术研究项目批复立项文件（复印件） 附件 2. 学校申请项目验收的函（复印件） 附件 3. 获得专利 附件 4. 经费使用说明 教育部科学研究重点项目结题（验收）报告 v 200801 教育部科学技术司 3 填填 写写 说说 明明 教育部科学技术研究重点项目结束后， 项目负责人须按要求认真填报结题 （验收） 报告，作为项目结题和验收的主要依据，同时为资助项目研究工作的重要档案。 1项目负责人在项目研究工作的基础上，实事求是地撰写结题（验收）报告， 并提供必要的附件材料，保证填报内容真实、数据准确。表内填写不下时，可自行加 页。 2项目依托单位应认真审查，确保材料齐全，督促项目负责人在项目结束后 3 个月内完成项目结题（验收） 。 3直属高校须将结题项目的报告内容通过教育部科技管理平台进行网上申请， 按平台各栏目要求提交相关材料，经科技司审查通过后，将在网上批复同意与否。合 格的即完成结题工作。 4地方或部门高校承担的项目按上述要求填写报告后，报送至地方教育厅（教 委） 或部门审核结题， 审核合格者须登录教育部科技管理平台按平台各栏目要求提交 相关材料完成结题工作。纸质材料报教育厅（教委）或部门存档。 5须验收的项目， 结题验收报告填写完成并经单位审核合格后，须通过教育 部科技管理平台进行网上申请，按平台各栏目要求提交相关材料。 6. 地方（部门）高校的主管部门和直属高校同时须提交验收纸质验收申请，并 报送附件的纸质材料。科技司将根据审查情况在网上批复同意与否。经批准后，由我 部组织召开项目验收会。 7验收会后，须将专家组验收意见和专家组名单上传至教育部科技管理平台。 同时提交完整的纸质结题验收报告报送至我部存档（必须加盖主管部门和依托单 位公章） 。 8经费支出根据实际支出科目列支。 9报告须用 a4 纸打印，每项目录内容之间用彩色纸作为间隔。 教育部科学研究重点项目结题（验收）报告 v 200801 教育部科学技术司 4 一、结题（验收）项目成果简表 项目名称 口蹄疫重组仙台病毒活载体疫苗的研究 项目编号 109112 项目类型 重点 起止时间 2009.12010.12 项目 情况 项目经费（万） 10 其中国拨 10 万 验收（结题）时间 2012.6 姓 名 年龄 学位 职称 获得国家各类人才计划的情况 钱平 40 博士 教授 新世纪人才 曹胜波 37 博士 教授 新世纪人才 项目 主要 完成 人员 李祥敏 37 博士 副教授/ 项目来源 项目名称 负责人 经费 起止时间 新世纪人才 基金 口蹄疫抗性基因发掘与新型疫苗研究 钱平 25 2009-2012 获得 各类 后续 资助 情况 序号 成 果 名 称 成果类型 获得时间 第 1 项 一种表达人工修饰合成的甲型h1n1流感病毒ha-na-m1基 因的重组杆状病毒 专利 2009 第 2 项 主 要 成 果 第 3 项 应用类别 效益说明 应用时间 成 果 应 用 情 况 知识产权情况 人才培养情况 发表论著情况 其 他 知 识 产 权 博 士 后 博 士 硕 士 国 家 软 件 登 记 专利情况 名称 其 他 在 读 已毕业 收录情况 论文情况 学术会议 论 著 国际 国内 项 发明专利授权项 发明专利申请项 新型专利授权项 新型专利申请项 人 数 人 数 人 数 人 数 s c i 篇 e i 篇 i s t p 篇 国 内 科 技 刊 物 国 外 科 技 刊 物 特 邀 报 告 大 会 报 告 分 组 报 告 特 邀 报 告 大 会 报 告 册 1 12 教育部科学研究重点项目结题（验收）报告 v 200801 教育部科学技术司 5 二、项目成果摘要（不少于 500 字） 仙台病毒（sendai virus, sev）是一种优良的载体，可以诱导很好的粘膜免疫、体液免疫和细 胞免疫，尤其可诱导高水平的干扰素，广泛应用于病毒基因工程疫苗活载体和干扰素的诱导剂。 本研究克隆了 o 型口蹄疫病毒结构蛋白基因 p1 并根据密码子偏爱性对其进行修饰 p，分别构建 含口蹄疫病毒 p1 基因和绿荧光蛋白 （egfp） 基因的全长 cdna 质粒 psevfl-p1/ psevfl-egfp。 进而通过反向遗传学技术，将全长质粒分别与辅助质粒 psev-n, psev-p 和 psev-l 共转染表达 t7rna 聚合酶的细胞系 bsrt7，转染 72h 后将产物通过尿囊腔途径接种 9 日龄鸡胚，盲传 56 代，western-blot 和间接免疫荧光检测结果表明：成功获得表达口蹄疫病毒 p1 基因的仙台病毒 sev-p1 和表达 egfp 的仙台病毒 sev-egfp。 sev-p1 和 sev-egfp 的生长特性、 稳定性和增殖能力 等与亲本毒株相似。小鼠动物试验显示：无论是采用滴鼻还是肌肉注射的免疫途径，sev-p1 均 能有效诱导机体产生抗 fmdv 的 elisa 抗体和中和抗体，而且免疫效果呈剂量依赖性，其抗体 水平与灭活口蹄疫疫苗相当。另外 sev-p1 能诱导一定水平的干扰素产生。用仙台病毒表达口蹄 疫的基因工程疫苗在国际上还未见报道，具有创新性，其研究成果将为口蹄疫预防、控制和根除 提供技术保障，具有重要的经济价值和市场前景。 注: 摘要内容详实，文字简练，着重介绍创新点和取得的突出成果,包括代表性的图解。 三、计划任务、考核指标及主要技术经济指标、计划执行评价 计划任务： 1. 日本仙台病毒反向遗传操作系统辅助质粒 psev-n, psev-p, psev-l 和含有 egfp 的全 长 cdna 质粒 psevfl-egfp 的制备。 2. 含有口蹄疫病毒 p1 基因的全长 cdna 质粒 psevfl-p1 的构建。 3. 利用 egfp 标记的全长 cdna 建立日本仙台病毒的反向遗传操作系统技术平台。 4. 拯救表达口蹄疫病毒 p1 蛋白的重组仙台病毒。 5. 重组仙台病毒生物学特性的研究（稳定性，外源基因的表达、一步生长曲线和多步生长 曲线等） 。 6. 重组病毒小鼠的试验（粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫等） 。 7. 重组病毒猪的试验（粘膜免疫 iga、体液免疫 igg 和细胞免疫代表 th1、th2 和 th17 等的细胞因子水平；免疫保护效率等指标） 。 8. 基因工程活载体疫苗的制备和农业微生物转基因安全评价的实验室研究。 考核指标及主要技术经济指标 1. 表达绿荧光蛋白egfp的重组仙台病毒一株。 2. 表达口蹄疫病毒p1蛋白的重组仙台病毒一株。 3. 生产3批口蹄疫重组仙台病毒的基因工程疫苗中试产品。 教育部科学研究重点项目结题（验收）报告 v 200801 教育部科学技术司 4. 发表论文34篇，sci论文23篇。 5. 申报发明专利一项。 6. 培养研究生23名。 7. 完成农业转基因微生物安全评价的实验室研究。 计划执行评价 本课题组投入大量的人力和物力进行该项目的研究获得了表达口蹄疫病毒p1基因和绿荧光 蛋白基因的仙台病毒各一株。 我们利用反向遗传操作系统， 将口蹄疫病毒的主要免疫原性基因p1， 并根据密码子便爱性对其进行优化得到p1m,将其插入到仙台病毒的基因组中。动物试验结果表 明重组疫苗株能够诱导机体产生良好的口蹄疫体液免疫和细胞免疫， 其口蹄疫中和抗体和elisa 抗体与口蹄疫油乳剂灭活疫苗相当。具体分述如下： （一） 、表达口蹄疫病毒p1基因的重组仙台病毒株的构建 （一） 、表达口蹄疫病毒p1基因的重组仙台病毒株的构建 1.1 含有 egfp 和口蹄疫病毒 p1 基因的全长 cdna 质粒 psevfl-egfp/ psevfl-p1 的构建 通过mlui将外源基因插入到仙台病毒骨架载体n和p基因之间的mlui位点，获得中间转移质 粒psevfl-egfp/p1，构建示意图如图1所示。 图1：转移质粒psevfl-egfp/p1的构建示意图 设计一对引物，从质粒pn-egfp上扩增绿荧光蛋白基因egfp，并在两端加入mlui位点，克 隆基因后连入载体psevfl中，获得转移质粒psevfl-egfp。 同样，设计一对引物，从含有o型口蹄疫病毒es株p1和p2基因的质粒pmdp1p2上扩增p1基 因，序列分析表明在p1基因内第3bp和1170bp出有两个mlui位点，为了通过mlui将p1基因克隆入 psevfl。通过两次定点突变去除mlui位点。图1和图2分别是第一次和第二次点突变后mlui酶切 鉴定图，结果表明成功的去除3bp处mlui位点。进而通过mlui位点将p1基因连入psevfl，图3表 明1和2号质粒为正向连入，3号质粒为反向连入psevfl的酶切结果，表明获得最终转移载体 psevfl-p1（如图3所示） 。 6 教育部科学研究重点项目结题（验收）报告 v 200801 教育部科学技术司 7 图2：第一次突变后酶切鉴定图 m: dl15000bp marker;18:pmdp1m1/mlui 图3:第二次突变后酶切鉴定图 18：pmdp1m2/mlui；m：dl15000bp marker 图4：psevfl-p1酶切鉴定图 m0：250bp marker；13:plasmid/mlui; m1: dl2000bp marker; m2: dl15000bp marker 1.2 重组病毒 sev-p1/sev-egfp 的获得 全长质粒 pfl4-egfp 和 pfl4-p1 分别与辅助质粒 pn，pp 和 pl 共转染 bsrt7。转染前用 0.1moi vvvt7 感染 bsrt7 细胞，1h 后进行转染。转染 48h 后将转染物接种 9-10 日龄鸡胚的尿 m12345678 1 2 3 4 5 6 7 8 m m0 1 2 3 m1 m2 教育部科学研究重点项目结题（验收）报告 v 200801 教育部科学技术司 囊腔中，3 天后收集尿囊液继续接种 2-3 代。收集尿囊液提 rna 为模板，设计可以扩增仙台病 毒部分片段和外源基因的一对引物，通过 rt-pcr 鉴定外源基因的存在，结果表明，在 f3 代和 f4 代尿囊液中扩出 vp1 基因片段（如图 4 所示） ，表明获得重组外源基因的仙台病毒。由于 sev-egfp 有标记基因，直接通过在荧光显微镜下观察荧光来鉴定。 图 5：重组仙台病毒 sev-p1 的 rt-pcr 鉴定图 13、f3 代尿囊液；46： ：f4 代尿囊液；7：h2o；m: dl2000bp marker 1.3 重组病毒 sev-p1/sev-egfp 的外源基因的表达 由于 sev-egfp 本身带有荧光蛋白，通过在荧光显微镜下观察荧光鉴定该重组病毒。转染产 物 72h 后收集接种 9 日龄鸡胚，盲传 1 代后尿囊液感染 bhk-21 细胞，分别在 24h、36h 和 48h 观察荧光，可见绿色荧光如图 5 所示，表明获得表达 egfp 的仙台病毒。 将sev-egfp连续接种9日龄鸡胚，f5代获得高滴度的病毒，将其接种鸡胚后在荧光显微镜下 可以观察代鸡胚呈强烈荧光，如图6所示。 图 5：f1 代 sev-egfp 感染 bhk-21 细胞不同时间荧光图片 a：感染后 12h；b：感染后 24h；c：感染后 36h；d：bhk-21 m1234567 2267bp 8 教育部科学研究重点项目结题（验收）报告 v 200801 教育部科学技术司 图 6：f5 sev-egfp 感染鸡胚 36h 图片 a：sev-egfp 感染鸡胚 36h 显微镜；b：a：sev-egfp 感染鸡胚 36h 荧光显微镜 1.4 重组病毒 sev-p1 的遗传稳定性鉴定 重组病毒sev-p1连续接种9日龄的鸡胚，收集尿囊液并提取其rna进行rt-pcr鉴定，以保证 整合到仙台病毒基因组中的外源基因在进行多次传代的过程中不会丢失，具有良好的遗传稳定 性，通过对第1、4、8、12、16、20代基因组中p1基因内vp1基因片段（图7） ，结果显示外源基 因能够稳定遗传，表明重组病毒具有良好的遗传稳定性。血凝试验测定毒价f1、f2、f3、f4、 f5、f6、f7、f8、f9、f10代病毒，血凝价分别为26、28、29、29、29、210、210、210、210、210，表明重组 病毒能稳定增殖。 图 7：重组病毒 sev-p1 的遗传稳定性鉴定 16: f1、f4、f8、f12、 f16、f20 尿囊液；7：h2o；m: dl2000bp marker 1.5 重组病毒 sev-p1 的外源基因的表达 将sev-p1病毒接种bhk-21细胞，感染后48h进行间接免疫荧光，鉴定p1基因的表达。同 时将感染细胞和尿囊液进行western-bloting。结果表明外源基因在重组病毒中得到表达。 western-bloting揭示在72kd处有预期大小的特异条带。间接免疫荧光显示，重组病毒能够发 出强烈荧光，表明外源基因在重组病毒中得到高效表达（如图7所示） 。 9 教育部科学研究重点项目结题（验收）报告 v 200801 教育部科学技术司 10 图 7：重组病毒 sev-p1 间接免疫荧光与 western bloting 检测 a: recombinant virus sev-p infected bhk-21 cells; bhk-21 cells mock infected; c: western blotting 1.6 重组病毒 sev-p1 在细胞水平刺激干扰素的鉴定 病毒sev-p1、sev-egfp、sev 以血凝价（ha）28滴度剂量感染bhk-21细胞，利用实时 荧光定量pcr（real-time pcr）检测i型和ii型干扰素的表达水平。结果表明sev-p1能诱导细 胞产生高水平的ifn-, 但sev-egfp、sev却很低（如图8a） 。相对ifn-而言，三种病毒产 生ifn-和 ifn-水平都不高（如图8b、c） 。 图 8：重组仙台病毒 sev-p1 诱导干扰素的实时荧光定量 pcr 图 a:ifn-的结果；b：ifn-的结果；c:ifn-的结果 bhk: bhk-21cells mock infected; sev: 野生型仙台病毒感染的 bhk-21 细胞组；p1: sev-p1 感染 的 bhk-21 细胞组；egfp: sev-egfp 感染的 bhk-21 细胞组 1.7 双荧光素酶报告系统检测 ifn-和 nf-kb 启动子活性 质粒ifn-luciferase和nf-kb-luciferase质粒relina共转染bhk-21细胞。转染24h后， a b c a b c 教育部科学研究重点项目结题（验收）报告 v 200801 教育部科学技术司 分别用病毒sev，sev-p1，sev-egfp刺激bhk-21细胞1h，换新鲜培养基培养。转染48h后， 收集细胞进行荧光素检测。由图可知，sev-p1能有效启动ifn-启动子活性，但对nf-kb没有 影响（图9） 。 11 图 9：双荧光素酶报告系统检测 ifn-luciferase 和 nf-kb-luciferase 启动子活性 a：双荧光素酶报告系统检测 ifn-luciferase 启动子活性 b：双荧光素酶报告系统检测 nf-kb-luciferase 启动子活性 （二） 、表达口蹄疫病毒p1基因的重组仙台病毒株的动物试验 （二） 、表达口蹄疫病毒p1基因的重组仙台病毒株的动物试验 1. 表达口蹄疫病毒 p1 基因的重组仙台病毒疫苗的制备 物理性状：自然田间下，可见所制成的疫苗为乳白色海绵状疏松团块，易于瓶壁分离，加 稀释液后能迅速溶解，溶解后呈浅红色，说明疫苗正常。 疫苗效价测定：在疫苗中加入2.5ml dmem稀释，将冻干疫苗恢复到原来体积，通过红细胞 测定基因工程疫苗冻干前后的血凝价ha，结果表明疫苗冻干后效价由原来的2 10下降到28，说明冻 干对毒价有一定的影响。 2. 表达口蹄疫病毒 p1 基因的重组仙台病毒株的动物试验 2.1 重组病毒诱导的 elisa 抗体水平 重组病毒 sev-p1 分别以 ha 27、28、29/只三个梯度免疫小鼠，每组 6 只，sev-egfp 以 29/ 只免疫小鼠，每组 5 只，分别以滴鼻和肌注两种途径免疫；并以 o 型 fmdv 灭活疫苗作为阳性 对照（肌注） 、pbs（肌注）作为阴性对照，四周后加强免疫一次，分别在免疫前、首免后 14 天、 28 天、 42 天和 56 天尾静脉采血， 分离血清后用血凝抑制试验检测抗 sev 血凝抑制价和用 elisa 试剂盒检测抗 fmdv o 型 elisa 抗体水平。表 1、2 和图 10、11 结果显示重组病毒均能在机体 内有效增殖并诱导机体产生一定的血凝抑制价。 表 1：滴鼻免疫途径不同时间点的抗 sev 血凝抑制价 pbs egfp 组 疫苗对照 p1-高剂量 p1-中剂量 p1-低剂量 0week 2.40.548 30.707 3.20.919 2.80.983 3.70.816 3.00.894 2weeks 3.80.447 5.0 5.0 5.30.516 5.0 5.10.408 4weeks 4.20.477 5.60.548 5.0 7.30.516 6.70.516 6.10.408 6weeks 4.20.477 6.80.447 5.0 8.80.983 8.30.516 7.51.049 8weeks 4.0 5.80.447 5.0 7.51.049 7.50.548 6.71.033 注：所有的数据均取 log2 的对数；滴鼻免疫 （xsd) a b 教育部科学研究重点项目结题（验收）报告 v 200801 教育部科学技术司 0 2 4 6 8 10 12 免疫前一免后2w一免后4w二免后2w二免后4w 图 10：滴鼻免疫途径不同时间点针对 sev 的血凝抑制价 pbs：阴性对照组；egfp: sev-egfp 免疫组；疫苗：口蹄疫商品疫苗阳性组； p1-高剂量组： 29 ha sev-p1免疫组； p1-中剂量组： 28 ha sev-p1免疫组； p1-低剂量组： 27 ha sev-p1 免疫组； 表 2：肌肉注射免疫途径不同时间点的抗 sev 血凝抑制价 pbs egfp 组 疫苗对照 p1-高剂量 p1-中剂量 p1-低剂量 0week 2.40.548 2.81.095 3.20.919 2.71.211 3.00.894 3.00.632 2weeks 3.80.447 5.00.707 5.0 6.00.632 5.80.408 5.50.548 4weeks 4.20.477 6.60.894 5.0 8.0 7.30.516 6.80.753 6weeks 4.20.477 7.20.447 5.0 10 9.70.516 9.70.816 8weeks 4.0 5.60.548 5.0 9.30.816 8.80.408 8.00.632 注：所有的数据均取 log2 的对数；肌肉注射 （x sd) 图 11：肌肉注射免疫途径不同时间点针对 sev 的血凝抑制价 pbs：阴性对照组；egfp: sev-egfp 免疫组；疫苗：口蹄疫商品疫苗阳性组； p1-高剂量组： 29 ha sev-p1免疫组； p1-中剂量组： 28 ha sev-p1免疫组； p1-低剂量组： 27 ha sev-p1 免疫组； 12 教育部科学研究重点项目结题（验收）报告 v 200801 教育部科学技术司 不论滴鼻还是肌肉注射， 重组病毒 sev-p1 的三个剂量组从首免到免疫后 6 周 fmdv elisa 抗体水平一直呈上升趋势，随后有所下降，在首免后第 42 天抗体水平达到高峰，并呈剂量依耐 性，比商品化疫苗组略低。sev-egfp 和 pbs 组抗体水平一直处于较低水平（表 3、4 和图 12、 13 所示） 。 表 3：滴鼻免疫途径不同时间点的抗 fmdv 的 elisa 水平 pbs egfp 组 疫苗对照 p1-高剂量 p1-中剂量 p1-低剂量 0week 0.10620.0106 0.11840.0212 0.13680.0436 0.13650.0473 0.14920.0494 0.16930.0488 2week 0.12400.0428 0.16720.0326 0.47860.0551 0.38600.0440 0.30620.0284 0.30420.0235 4week 0.13760.0405 0.16020.0506 0.85190.0938 0.53250.0621 0.42800.0343 0.33750.0184 6week 0.12260.0435 0.15220.0495 1.74170.0947 1.43530.0387 1.21980.1147 1.04000.1055 8week 0.15300.0607 0.16340.0251 1.46730.1185 1.19980.0479 1.04270.0864 0.90550.0689 注：od630nm0.3 判为阳性（xsd) 图 12：滴鼻免疫途径不同时间点的抗 fmdv 的 elisa 水平 pbs：阴性对照组；egfp: sev-egfp 免疫组；疫苗：口蹄疫商品疫苗阳性组； p1-高剂量组： 29 ha sev-p1免疫组； p1-中剂量组： 28 ha sev-p1免疫组； p1-低剂量组： 27 ha sev-p1 免疫组； 表 4：肌肉注射滴鼻免疫途径不同时间点的抗 fmdv 的 elisa 水平 pbs egfp 组组 疫苗对照疫苗对照 p1-高剂量高剂量 p1-中剂量中剂量 p1-低剂量低剂量 0week 0.10620.0106 0.15340.0504 0.13680.0436 0.13830.0484 0.15680.0441 0.17500.0485 2week 0.12400.0428 0.17220.0533 0.47860.0551 0.36930.0440 0.32980.0208 0.30370.0395 4week 0.13760.0405 0.14160.0404 0.85190.0938 0.54320.0378 0.46420.0258 0.34700.0188 6week 0.12260.0435 0.14460.0440 1.74170.0947 1.42930.0461 1.22330.1189 1.11680.1278 8week 0.15300.0607 0.15000.0515 1.46730.1185 1.24800.0777 1.12930.1030 0.94630.0695 注：od630nm0.3 判为阳性（xsd) 13 教育部科学研究重点项目结题（验收）报告 v 200801 教育部科学技术司 图 13：肌肉注射免疫途径不同时间点的抗 fmdv 的 elisa 水平 pbs：阴性对照组；egfp: sev-egfp 免疫组；疫苗：口蹄疫商品疫苗阳性组； p1-高剂量组： 29 ha sev-p1免疫组； p1-中剂量组： 28 ha sev-p1免疫组； p1-低剂量组： 27 ha sev-p1 免疫组； 2.2 重组病毒诱导的中和抗体水平 将小鼠的血清经 56灭活 30min 后用 fmdv 进行中和试验， fmdv 中和抗体水平从首免 后一直呈上升趋势，在二免后 2 周达到高峰，但比商品化疫苗组略低。并且三个梯度之间中和抗 体水平差异不大(p0.05)，但呈一定剂量依赖性。从产生中和抗体水平来说，肌肉注射效果略好 于滴鼻免疫(表 5 和图 14，表 6 和图 15)。 表 5：滴鼻免疫途径不同时间点的抗 fmdv 的中和水平 pbs egfp 组 疫苗对照 p1-高剂量 p1-中剂量 p1-低剂量 pbs egfp 组 疫苗对照 p1-高剂量 p1-中剂量 p1-低剂量 2weeks 1.20.447 2.60.894 4.20.422 3.50.548 3.330.516 3.330.516 2weeks 1.20.447 2.60.894 4.20.422 3.50.548 3.330.516 3.330.516 4weeks 1.60.894 40.707 5.10.316 4.670.516 4.330.516 4.170.408 4weeks 1.60.894 40.707 5.10.316 4.670.516 4.330.516 4.170.408 6weeks 2.41.140 4.20.447 6.10.316 50.632 4.830.408 4.670.516 6weeks 2.41.140 4.20.447 6.10.316 50.632 4.830.408 4.670.516 8weeks 1.40.548 3.40.578 5.40.516 4.670.516 4.330.516 4.170.408 8weeks 1.40.548 3.40.578 5.40.516 4.670.516 4.330.516 4.170.408 注：所有的数据均取 log2 的对数 注：所有的数据均取 log2 的对数 14 教育部科学研究重点项目结题（验收）报告 v 200801 教育部科学技术司 图 14：滴鼻免疫途径不同时间点的抗 fmdv 的中和水平 pbs：阴性对照组；egfp: sev-egfp 免疫组；疫苗：口蹄疫商品疫苗阳性组； p1-高剂量组： 29 ha sev-p1免疫组； p1-中剂量组： 28 ha sev-p1免疫组； p1-低剂量组： 27 ha sev-p1 免疫组； 表 5：肌肉注射免疫途径不同时间点的抗 fmdv 中和水平 pbs egfp 组 疫苗对照 p1-高剂量 p1-中剂量 p1-低剂量 pbs egfp 组 疫苗对照 p1-高剂量 p1-中剂量 p1-低剂量 2weeks 1.20.447 3.60.548 4.20.422 4.170.408 3.670.516 3.50.548 2weeks 1.20.447 3.60.548 4.20.422 4.170.408 3.670.516 3.50.548 4weeks 1.60.894 4.20.447 5.1.316 5.0 4.50.548 4.50.548 4weeks 1.60.894 4.20.447 5.1.316 5.0 4.50.548 4.50.548 6weeks 2.41.140 4.20.447 6.1.316 5.830.408 5.50.837 5.330.516 6weeks 2.41.140 4.20.447 6.1.316 5.830.408 5.50.837 5.330.516 8weeks 1.40.548 3.80.447 5.4.516 5.170.408 4.830.408 4.830.408 8weeks 1.40.548 3.80.447 5.4.516 5.170.408 4.830.408 4.830.408 图 15：滴鼻免疫途径不同时间点的抗 fmdv 的中和水平 pbs：阴性对照组；egfp: sev-egfp 免疫组；疫苗：口蹄疫商品疫苗阳性组； p1-高剂量组： 29 ha sev-p1免疫组； p1-中剂量组： 28 ha sev-p1免疫组； p1-低剂量组： 27 ha sev-p1 免疫组； 2.3实时荧光相对定量 pcr 检测免疫小鼠脾细胞中 ifn mrna 表达 小鼠首免 42 天后脱臼处死，无菌操作取出脾脏，分离细胞加入灭活的 fmdv 病毒作为刺 激因子培养 20