DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案.doc

dns法测定酶活实验方法总结及优化方案目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。目前实验室采用测酶活方法：1、葡萄糖标准曲线制作：试管号1234561mg/ml葡萄糖标准液/ml00.10.20.30.40.5蒸馏水量/ml0.50.40.30.20.10葡萄糖浓度/mg/ml00.20.40.60.81ph4.8磷酸氢二钠-柠檬酸/ml1.51.51.51.51.51.5dns试剂/ml333333沸水浴7min后快速冷却加入蒸馏水/ml555555530nm比色。2、酶活测定方法：管号空白管0样品管1样品管2酶液/ml0.50.50.5沸水灭活10min1%cmc-na/ml1.51.51.545下反应30min，沸水灭活10mindns试剂/ml333沸水浴中7min显色快速冷却后蒸馏水/ml555考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。单位酶活的计算： n：稀释倍数；k：曲线斜率；t：反应时间，min；1000：mg换算成ug.以下是近期所做的实验结果：葡萄糖标准曲线两种产纤维素酶细菌不同测试结果浓度mg/ml吸光值总酶活（10ml）单位酶活浓度mg/ml吸光值总酶活（10ml）单位酶活r2上清（未破碎）0.2290.12566776.457727.645772183上清（未破碎）0.4020.22133.851713.385170.2390.13066779.49987.949980.4050.222135.068513.50685r2破碎（无缓冲未离心）0.4260.233333141.963914.19639183破碎（无缓冲未离心）0.43833330.24146.0214.6020.3840.21128.37612.83760.45466660.249151.495815.14958r2破碎（无缓冲取上清）0.3070.167667102.011210.20112183破碎（无缓冲取上清）0.4270.234142.369514.236950.3120.170667103.836510.383650.4430.243147.845314.78453r2破碎（1：1缓冲取上清）0.21566660.11871.793197.179319183破碎（1：1缓冲取上清）0.2090.11569.967946.9967940.25166660.13883.961528.3961520.16166660.08954.14915.41491测定结果实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比r2高，两种菌都是以胞外酶为主。目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。根据纤维素酶活力测定条件研究（夏服宝等，饲料工业2005年第26卷第16期）和影响纤维素酶活力测定的几个因素（刘妙莲等，中国