探讨聚肌胞联合E7免疫对宫颈癌患者树突状细胞的影响.doc

文章来源 毕业论文网 探讨聚肌胞联合e7免疫对宫颈癌患者树突状细胞的影响文章来源 毕业论文网 1 引言人乳头瘤病毒(hpv)感染是引起宫颈癌的主要病因，hpv 相关抗原具有宫颈癌特异性，因此hpv 相关抗原能够有效预防人的hpv 感染，但是临床研究发现不能治疗hpv 感染、宫颈癌或癌前病变。笔者首次报道，聚肌胞(poly (i:c)联合e7(44-62)（属hpv 多肽，同时含mhci 和ii 类抗原）能产生特异性细胞毒性t 细胞反应且增加树突状细胞（dc）数量，完全抑制人宫颈癌模型小鼠的肿瘤生长，与mhc i 类抗原比较，含mhc i 和ii 类抗原的多肽疫苗能够显著延长抗肿瘤免疫反应时间1-3。拟通过mtt 实验和流式细胞技术研究正常人、宫颈癌和癌前病变患者的外周血dc 在聚肌胞联合e7(44-62)刺激下的免疫反应，为其临床应用提供理论和实验依据。2 材料和方法2.1 检测对象及分组（1）宫颈癌组： 10 例。为湖南省肿瘤医院收治的宫颈癌患者，女，年龄4162（平均51.5）岁。所有宫颈癌均经病检证实，凡接受放、化疗或免疫调节治疗患者均排除在外。术前1 周内清晨空腹抽取外周静脉血，肝素抗凝，待检。（2）cin 组： 10 例。均为宫颈上皮内瘤变/期患者，所有宫颈上皮内瘤变经病检证实。女，年龄3954（平均46.2）岁。术前1 周内清晨空腹抽取外周静脉血，肝素抗凝，待检。（3）正常对照组： 10 例。女，年龄2835 岁（平均34.2）岁，均为在校的健康志愿学生，清晨空腹抽取外周静脉血，肝素抗凝，待检。2.2 检查项目及方法2.2.1 dc 的分离和培养方法见参照文献4，以ficoll 密度梯度离心方法从外周血中分离单个核细胞，在无菌条件下将所获细胞加入含10%小牛血清的rpmi 1640 培养液（美国gbico 公司产品）中培养（37、5%co 2）。1h 后，轻洗培养瓶去除非贴壁细胞，贴壁细胞加入含重组人白细胞介素-4(500u/ml)和重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子（500u/ml）的rpmi 1640 培养液中继续培养7d，23d 更换培养液1 次。2.2.2 mtt 实验加入0.25% trypsin-edta solution 消化后，用rpmi 1640 培养液制成dc 细胞悬液，台盼蓝拒染法鉴定细胞存活率> 95%。各组细胞（1×105/ml，总体积100 μl）在rpmi 1640完全培养液中与含聚肌胞（终浓度为50μg/ ml，购自英国ge healthcare 公司），或聚肌胞（终浓度为50μg/ml）和e7(44-62)（终浓度为100μg/ml，序列为qaepdrahynivtfcckcd，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）或培养液（空白对照）共同培养。5 d 后，加入mtt(10 μl，5mg/ml)并于37 孵育4 h，采用酶标仪检测490nm 波长吸光度值。dc细胞增殖比例实验组吸光度/ 空白对照吸光度。2.2.3 流式细胞技术将分离的dc移入rpmi 1640 培养液内含聚肌胞，或聚肌胞和e7(44-62)（ 终浓度均同前），或培养液共同培养16 h。根据固定/渗透试剂盒（购自英国bd 公司）说明进行细胞内双染色，流式细胞仪检测异硫氰酸（fitc）标记鼠抗人cd11c 单克隆抗体和藻红蛋白（pe）标记鼠抗人cd86 单克隆抗体（抗体均购自美国ebioscience 公司）标记的细胞。阳性细胞百分率（%）染色阳性细胞数总细胞数×100。2.3 统计分析计量资料用±s 表示，组间差异采用anova 及q 检验分析。p <0.05 认为统计学上有显著意义，统计学处理采用spss 13.0 软件。3 结果3.1 dc 的比例及增殖反应宫颈癌组外周血的dc 占外周血单核细胞的比例（0.12+0.007，%）显著低于c 组（1.13+0.056，%）和cin 组（0.25+0.012，%）（均p <0.01）；cin 组dc 的比例显著高于宫颈癌组（p <0.05）。与聚肌胞比较，聚肌胞联合e7(44-62)刺激能够显著提高c 组、cin组和宫颈癌患者外周血的dc 的增殖反应（均p <0.01）。宫颈癌组和cin 组dc 对聚肌胞联合e7(44-62)刺激的增殖反应显著低于c 组（均p <0.01），宫颈癌组dc 的增殖反应与cin组无显著差异（p >0.05），图1。3.2 dc 的cd11c+/cd86+表达宫颈癌组dc 的cd11c+/cd86+的表达水平显著低于c 组和cin 组（p <0.01，p <0.05），c 组cd11c+/cd86+的表达水平显著高于cin 组（p <0.05）。 与聚肌胞组比较，聚肌胞联合e7(44-62)刺激能够显著提高宫颈癌患者外周血的dccd11c+/cd86+的表达水平（p 值分别<0.01，<0.05），图2。dc 的cd11c+/cd86+表达 a：c 组dc 在加入培养液后cd11c+/cd86+的表达；b：c 组dc 在加入聚肌胞后cd11c+/cd86+的表达；c：c 组dc 在加入聚肌胞联合e7