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渤海海洋沉积物放线菌非培养多样性研究渤海海洋沉积物放线菌非培养多样性研究摘要放线菌研究在酶技术、医药工业和环境保护领域有重要的应用价值有广阔的应用前景, 研究渤海沉积物中的放线菌非培养多样性，能促进放线菌资源开发，有利于新物种和新产物的发现。利用放线菌特异性引物扩增16s rdna基因，构建16s rdna基因克隆文库，对文库中的克隆片段进行rflp(restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性)分析。研究分析表明:b71-2样品的27个克隆子获得了23个otus, 其中 34.8%的克隆序列分布于放线菌门(phylum actinobacteria)放线菌亚纲(actinobacteridae)和酸微菌亚纲(acidimicrobidae)中，并且在这两个亚纲中有62.5%的克隆序列属于放线菌的新分类单元;另外 65.2%的克隆序列以极高的自展值在放线菌门内支持形成一个独立的大分支，极有可能代表一个新亚目或更高级分类单元的类群。b37-3样品的31个克隆子获得了24个otus，其中 37.5%的克隆序列分布于放线菌门(phylum actinobacteria)放线菌亚纲(actinobacteridae)和酸微菌亚纲(acidimicrobidae)中，并且在这两个亚纲中有66.7%的克隆序列属于放线菌的新分类单元;另外 62.5%的克隆序列以极高的自展值在放线菌门内支持形成一个独立的大分支，极有可能代表一个新亚目或更高级分类单元的类群。通过分析免培养结果，表明渤海放线菌具有较高的多样性，并蕴藏着多种新分类单元，有进一步研究价值。关键词：免培养方法 放线菌多样性 渤海 海洋沉积物studies on the diversity of uncultured actinomycetes from the sediment of bohai seaabstractthe study of actinomycetes has potential application in the fields of medical industry, biological chemistry and environmental protection. studies on the actinobacterial diversity in the yellow sea and bohai sea would promote the development and utilization of actinomycetes resources.specific primers were used to amplify the actinobacterial 16s rdna gene, and corresponding clone libraries were constructed for the sediment samples. different clones selected on the basis of haeiii digestion patterns were sequenced. the analysis of 16s rdna gene sequences showed that: 27 clone sequences of b72-1include 23 otus, 34.8% of which belonged to phylum actinobacteria,subclass actinobacteridae and subclass acidimicrobidae . in these two subclasses, 65.2% of the clone sequences belonged to new taxons of actinomycetes . 65.2% of the clone sequences with high bootstrap values in phylum actinobacteria support the formation of an independent branch, most likely represents a new suborder, or more advanced taxa groups. 31 clone sequences of b37-3 include 24 otus ,37.5% of which belonged to phylum actinobacteria,subclass actinobacteridae and subclass acidimicrobidae. in these two subclasses, 65.2% of the clone sequences belonged to new taxons of actinomycetes. 62.5% of the clone sequences with high bootstrap values in phylum actinobacteria support the formation of an independent branch, most likely represents a new suborder, or more advanced taxa groups.bohai sea harbors abundant actinobacteria, including large number of unknown actinobacterial groups, which is worth- while for further study.key words: uncultured diversity of actinomycetes bohai sea marine sediment目录1前言：11.1 海洋放线菌的多样性及研究进展11.2放线菌的分子生物学分类和鉴定21.2.1 16s rdna 序列分析31.2.2 dnadna(rrna)分子杂交31.2.3 dna 碱基组成比例的测定41.3放线菌的免培养方法42.材料和方法52.1材料52.2主要试剂和仪器52.2.1 试剂52.2.2 仪器62.3实验操作流程62.3.1 土壤总dna的提取62.3.2 土壤dna的纯化(周法提取的宏基因组dna需要纯化)82.3.3 用放线菌特异引物扩增dna和胶回收82.3.4 连接转化92.4 克隆文库构建92.4.1构建克隆文库92.4.2 rflp分析102.5 系统发育分析103 实验结果113.1总dna的提取及放线菌特异性序列的扩增113.2 菌液pcr电泳结果113.3酶切后电泳结果123.4部分测序和比对结果123.5系统多样性分析163.5.1 进化多样性分析（进化树）163.5.2 稀有度分析214 讨论23参考文献24致谢261前言： 1.1 海洋放线菌的多样性及研究进展放线菌是一类具有分枝状菌丝体的，高gc含量的革兰氏阳性细菌，目前在伯杰氏系统细菌学手册第四卷中，放线菌属于原核生物界，厚壁菌门、放线菌纲、放线菌目(actinomycetales)1。其生理代谢活动活跃，次级代谢产物丰富多样，是一类具有广泛实际用途和巨大经济价值的微生物资源。目前已报道的23，000种微生物来源的生物活性物质中，有超过10,000种化合物是由放线菌产生的，比例达到75%，陆生放线菌，尤其是链霉菌所产生的抗生素占天然来源抗生素的70%以上2。但是，陆生放线菌所产生的新型天然活性化合物逐渐减少，长期以来对大量菌株的重复分离和使用使得新化合物的发现概率逐步降低。近年来，人们开始将搜寻新颖天然产物的目光投向了海洋。海洋占地球表面积的70%，是生命的发源地，它包括海水、溶解和悬浮于水中的物质、海底沉积物，以及生活于海洋中的生物，是一个非常复杂的系统。其急剧变化的压力、温度，低营养、特殊的光照条件、高盐等所谓的极端环境孕育了一大批具有独特生理机能和适应机制的生物。研究表明海洋中生活着大量未知的微生物类群，生物多样性极为丰富3-4。早期人们普遍认为海洋环境是贫瘠的，再加上深海样品采集的难度，对海洋放线菌的研究十分有限。随着分子生态学方法的广泛使用、遗传分析技术的发展、分离培养以及纯化方法的改进，对海洋微生物的研究进展显著。近几年的研究结果显示，海洋放线菌的分布十分广泛，从河湾浅滩到马里亚纳海沟的海底沉积物都有发现，只是在数量上要劣于陆生环境5。海洋放线菌的研究开展得比较早。早在1944年，zobell和upham就从海泥中分离出两个actinomyces新种 ;1946年，zobell在 marine microbiology一书中对海洋来源的放线菌进行了总结，包括mycobacterium，actinomyces，nocardia，micromonospora四个属6。海洋环境的多样性造就了海洋微生物的多样性，海洋放线菌的种类与陆生放线菌有所不同，它们广泛存在于动植物体表、体内、海水及沉积物中7。一般近海沿岸的浅海海域中的海洋放线菌以链霉菌属streptomyces、诺卡氏菌属nocardia、小单胞菌属micromonospora为优势属，还包括红球菌rhodbcoccus、分枝杆菌mycobacterium等稀有属种;远海放线菌则以高温放线菌thermoactinamyces、戈登菌gordonia、游动放线菌acrinoplanetes居多8。 海洋沉积物是一类特殊的生态环境，它集化学物质和微生物于一体，既不同于淡水沉积物、土壤等陆地环境，又与海水水体环境相对独立，营养相对于海水较为丰富，是良好的微生物栖息地。目前对全球范围内海洋细菌生物量的估算显示，深海中蕴藏着极为丰富的微生物,其中大部分微生物深埋在沉积物中。在不同深度的沉积环境中，可培养放线菌的数量有较大的变化9。2008年bredholt等在trondheim fjord区47om处的新鲜沉积样品中检测到6.7x103个/g样品的放线菌;而pathonraree等从深度达10898m的马里亚纳海沟的海底沉积物中分离得到6个属的38株放线菌，其中的dermacoccus和tsukamurella是首次在海洋环境中发现10。尽管可培养海洋放线菌占纯培养微生物的比例较低，但通过分子生物学等非培养手段，己经证明了海洋放线菌在沉积环境中大量存在。在2003年stach等设计了一套针对海洋放线菌的特异性引物，从海洋沉积环境中检测到多个全新类群。同时，分离策略的改进和培养条件的提高帮助科研人员能更好地获得海洋放线菌的纯培养株，从而推动其生物活性潜力的进一步发掘。2004年magarvery等从稗斯麦群岛和所罗门群岛的海泥中分离到102株放线菌，通过分类学鉴定证明其中有两个属于micromonosporaceae的新属，并将其中一个新属命名为“solwaraspora”。2010年，pindi等从南大洋的海洋沉积物中分离到一株革兰氏阳性菌，经 16s rrna序列比对、系统发育学分析、形态学特征及dna杂交，将其定为arthrobacter sp.。11-13 1.2放线菌的分子生物学分类和鉴定80 年代 stackebrandt 和 wbese 根据 16sr dna 相似性、dnarrna 和 dnadna 杂交的结果构建了放线菌和其它生物间的系统发育树，这标志着放线菌分类学分子分类时期的开始(stackebrandt，1981)。应用于分类的分子主要为 dna 和rna，随着分子生物学的发展，分子分类法正成为分类学的主要方法，并且越来越受到重视。常用的分子指征包括:1.2.1 16s rdna 序列分析对自然界微生物群落进行分子进化研究常用的基因序列有：重复基因序列、功能基因序列和 rdna 序列。由于 rdna 序列进化变异频率缓慢，通常采用 rdna序列来对自然界微生物群落进行系统进化分类。rdna 能作为“分子钟”的原因有以下几点：（1）rdna 作为蛋白质合成机器的关键元件，在所有生物中具有功能和进化上的同源性；（2）rdna 是古老的分子，在整体结构上极端保守；（3）rdna核苷酸序列也是保守的；（4）rdna 是细胞质的重要组成部分，易于从各种生物获得；（5）rdna 可提供充分的序列信息来进行统计分析；（6）rdna 基因不能在同代生物之间进行转移，因此 rdna 之间的关系反映了生物之间的进化关系（olsen etal，1986）。16srdna 序列分析法解释了放线菌许多分支之间的进化关系。一般说来，如果两株放线菌 16srdna 顺序相似性在 97%以上，则可以将它们看成相同的种，相似性在 85%97%之间则可以定为不同的种，如果相似性小于 85%，则应分属不同的属(姜成林，1995)。目前，16s rdna 已成为细菌系统分类研究中最常用的分子指标。研究表明，编码 16s rdna 的基因(rdna)全长约 1500bp，由一系列保守区和可变区间隔而成。保守性能够反映生物物种的亲缘关系，为系统发育重建提供线索，这些保守序列在千百万年的进化过程中几乎没有发生过变化；高变性则能揭示出生物物种的特征核苷酸序列，是种属鉴定的分子基础。如1351-1369 位(以大肠杆菌为对照)是 g-菌的保守区，1401-1419 位是 g+菌的保守区，1167-1189 位在所有细菌中都保守。随着核酸测序技术的发展，16s rdna 序列越来越多地被用于放线菌的系统进化研究，并已经成为确立放线菌新分类单位的必要数据。近年报道的链霉菌新种大多是以 16srdna 序列分析结果为依据的(springer b et al，2001)。另外，随着互联网的迅速发展，我们可以更快捷、更容易地从一些大型数据库如：rdp、embl或 genbank 中获得相关菌株的 16s rdna 序列用于构建系统发育树。 1.2.2 dnadna(rrna)分子杂交dna 杂交百分比和杂交体热稳定性的降低通常用于对种属的同源性进行描述。dna 结合百分比或 dna 杂交值或相关结合比例都是两个全基因组之间比较序列相似性的间接参数。dnadna 同源性可以揭示种内和种间的亲缘关系，而dnarrna 杂交则在属水平上发挥更大作用(马邦亚，1999)。不过为了有针对性，分子杂交技术必须以形态和分子分类特征的结果为基础。 1.2.3 dna 碱基组成比例的测定dna 内 g+c 含量摩尔百分比(g+c mol%)的测定是典型的基因型指征之一，并且通常被认为属于细菌分类群的标准描述不可或缺的部分。一般认为，g+cmol%的含量在种内不超过 3%，在属内不超过 10%(wayne，1987；hill，1966)。在放线菌中，由于各属重叠较多，数值范围窄，一般只起辅助作用，常常以 g+cmol%的显著差异来纠正错误的种属划分。14-151.3放线菌的免培养方法二十世纪 80 年代，有学者首次提出可以不通过经典的分离培养方法，仅利用 5s rdna 和 16s rdna 序列分析环境中的微生物群落，并发现了许多微生物物种，标志着微生物分子生态学研究的开始16。随着分子生物学的发展，免培养方法也不断改进和完善，应用范围在逐步扩大，用于微生物生态学研究的新方法和新技术不断出现。核酸指纹图谱以及宏基因组学(metagenomics)等分子技术的出现提供了一种探知微生物多样性的方法，也是一条寻找新基因及其产物的新途径。现在普遍使用的以 16s rdna 基因序列为分子指标的研究方法，即通过构建样品 16s rdna 基因序列文库，对文库中的片段进行测序，序列通过比对分析，即能得到样品中微生物的组成信息17。除了这种方法以外，还有一些较为成熟的分子生物学技术运用到了环境微生物的研究中，包括变性梯度凝胶电泳(dgge)、温度梯度凝胶电泳(tgge)、单链构象多态性(sscp)、限制性片段长度多态性(rflp)、随机扩增多态性 dna(rapd)、扩增片段长度多态性(aflp)、southern 杂交技术、荧光原位杂交技术、数量印记杂交技术、dna 芯片技术等18。本文重点介绍pcr-rflp方法。grodzicker 等人于 1974 年发明了限制性片断长度多态性 (restrictionfragment length polymorphism，rflp)方法，即用限制性酶切片断长度差异来检测微生物个体之间的差异。先用 pcr 扩增出核酸目的片段，然后用特定的限制性核酸内切酶处理 pcr 产物，经电泳检测，根据酶切后片段大小以及分布情况的不同来分析微生物群落的结构组成多样性差异19。该方法目前已广泛应用于土壤中微生物的多样性研究。2.材料和方法2.1材料渤海样品b37-3 采集时间:2011.6.24 14:03 地理位置: 12113.044e 3806.429n 水深32米 下层40cm沉积物渤海样品b71-2 采集时间:2011.6.28 19:39地理位置: 12019.620e 380.555n 水深19.9米 沉积物2.2主要试剂和仪器2.2.1 试剂tris-base、乙二胺四乙酸二钠(edta)、氯化钠、氯化钙、十二烷基硫酸钠（sds）、tris-饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、丙烯酰胺、50tae电泳缓冲液、变性胶配置溶液(胶浓度为8%)、depc水、x-gal、iptg、葡萄糖、琼脂糖、溴化已锭、40%聚丙烯酰胺凝胶贮藏液（购自上海生工）；工具酶：溶菌酶、蛋白酶k购自德国merk公司； 试剂盒与分子量标准：-hind iii marker、dl2000 dnamarker、100bp dna marker、dna产物纯化试剂盒和凝胶回收试剂盒。以上均购自宝生物工程(大连)有限公司（takara）；放线菌的特异性引物（s-20：5-cgcggcctatcagcttgttg-3，a-19：5-ccgtactccccaggcgggg-3）20载体：pmd19-t载体购自宝生物工程(大连)有限公司（takara）；主要溶液配置21：tae(50)缓冲液：tris-hac 2mol/l edta (ph=8.0) 50mmol/lte缓冲液：tris-hci (ph=8.0) 10 mmol/l edta 1 mmol/llb（luria-bertani）液体培养基（1l）：10g nacl， 10g 蛋白胨， 5g 酵母粉，调节ph7.0，于121高压蒸汽灭菌20min。lb固体培养基补加1.0%的琼脂。氨苄青霉素溶液：将1g粉末状的氨苄青霉素溶于100ml超纯水中，至终浓度10mg/ml，分装于1.5ml的管内，-20保存备用。x-gal贮液：将x-gal溶解于二甲基酰氨（dmf）中，配成20 mg/ml的贮液，分装后避光保存于-20，无须过滤或灭菌。iptg贮液：将iptg溶解于灭菌水中，配成20贮液，用0.22 m的滤膜过滤除菌，分装后保存于-20。2.2.2 仪器 恒温摇床hwy111、电热恒温培养箱dh5000a、超净工作台bcn-i 360b、ph计model868、水平凝胶电泳装置。高速冷冻离心机、电子分析天平、电热恒温水浴锅lvf6、微型离心机sanyo cx1.5、烘箱salvis 7c 40s、涡旋混合器genie-2、超低温冰箱mdf-382e、pcr扩增仪px2 thermo pcr、高压蒸汽灭菌锅sanyo、移液枪eppendoff、凝胶成像分析系统fluor chem 5500、超纯水器milli-q、-80超低温冰箱706。2.3实验操作流程2.3.1 土壤总dna的提取2.3.1.1 sds-ctab土壤宏基因组dna提取方法（改进的周法）22 1) 称5g土壤于50ml离心管中，加入13.5ml提取缓冲液（2 ctab提取液，ph 8.0）和50l蛋白酶k（20mgml）,置于恒温摇床上（水平放置），150-180rpm、37摇1h。 2) 加入1.5ml 20sds，轻轻混匀，放入65水浴锅中加热45min，每隔20min轻轻摇动一次，混匀泥浆。 3) 6000 rpm常温离心10min，将上清液转移至新的50ml离心管中。 4) 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24：1），混匀2-3min（颠倒，不要剧烈震荡），低温（4）、12000rpm离心10min。 5) 将上清液转移至新的50ml离心管中，向上清中加入等体积的异戊醇，轻轻混匀，于室温静置1h。 6) 低温、12000rpm离心15min，倒出上清，置于滤纸上吸干。 7) 加入300-500l 70乙醇洗涤，盖紧盖子，上下、左右轻轻转动离心管，12000rpm离心3min。 8) 吸取乙醇，倒置于滤纸吸干液体，37烘干30min-40min。 9) 加入200-300lte，所得溶液即为dna粗提液。2.3.1.2 试剂盒法（omega e.z.n.a.tm soil dna kit） 1 称取500mg玻璃珠于15ml离心管中，加入0.2-0.5g土壤样品。加1ml buffer slx mlus，以最大转速涡旋震荡3-5min，以溶解土样。2 加入100l buffer ds，震荡混匀。3 70oc水浴10min,水浴过程中，轻轻震荡。4于室温离心（3000rpm）3min，上清吸取800l至2ml离心管，加入270l buffer sp2，充分震荡混匀。5 冰浴5min, 4oc、12000rpm离心5min。6小心将上清移至新的2ml离心管中，加入0.7倍体积异丙醇，反复颠倒混匀（轻轻地20-30次），于室温放置30min。74oc、12000rpm离心10min，以沉淀dna。8弃上清，确保不将dna团块倒掉，将管口至于卫生纸上1min，以流干液体。9加入200l elution buffer于管内，轻轻震荡10s。10加入50-100l htr reagent ,轻轻震荡10s。11室温放置2min，12000rpm离心2min。12将上清移至新的离心管中，加入等体积xp2 buffer，轻轻震荡混匀。13将上一步中的样品转移到插有柱子的收集管中， 10000rpm室温离心1min，弃上清。14加入300l xp2 buffer， 10000rpm离心2min，弃收集管。15将柱子插入新的收集管，加入700l spw wash buffer（提前用无水乙醇配好）， 10000rpm离心1min，弃上清。16重复上一步。17弃液体，12000rpm室温离心2min。18将柱子插入新的离心管中，加入30-50l elution buffer于柱子中央，65oc水浴10-15min。1912000rpm离心1min，洗脱dna，洗脱液保留。20重复步骤18、19。2.3.2 土壤dna的纯化(周法提取的宏基因组dna需要纯化)qiagen试剂盒法提纯dna;2.3.3 用放线菌特异引物扩增dna和胶回收用放线菌特异性引物（s-20：5-cgcggcctatcagcttgttg-3，a-19：5-ccgtactccccaggcgggg-3）对土壤总 dna 的放线菌特异性序列进行pcr 扩增 pcr的反应体系 反应物 体系（l） pcr mix 12.5 ddh2o 9.5 a-19 (20m) 1 s-20 (20m) 1 dna模板 1 总体积 25pcr的反应条件： 反应条件为95预变性4 min，之后的10个循环包括： 95变性45s，72退火45s（每个循环降0.5），72延伸1min；随后的20循环：95变性45s，68退火45 s，72延伸1min，最后再72延伸5 min。pcr产物凝胶电泳检测：pcr完成后进行1琼脂糖凝胶电泳分析，电泳电压100v，电泳时间为30min。pcr产物回收： pcr产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶，用宝生物公司omega普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒进行纯化,收集dna。用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测回收后的 dna。2.3.4 连接转化一、连接t载体连接体系（10l）： 纯化的pcr产物 2.0l solution 5.0l pmd19-t载体 0.5l ddh2o 补至10l混匀之后，于16连接反应2 h，用于后续的转化。二、转化大肠杆菌感受态细胞1 保存的感受态细胞冰上融化，取50l于无菌ep管（一般吸取30l左右，视情况而定）；2 加入连接片段，混匀，冰浴半小时；3 将ep管置于42水浴中热激90s，迅速冰浴90s；4 加800ml lb液体培养基，37振荡培养4050min；5 培养液5000rpm离心2min，弃适量上清（视生长情况而定），重悬后取100l转化物涂布于加氨苄青霉素(amp)（100 g/ml）的lb固体平板（已加40l x-gal、7l iptg并涂布涂匀）上，37倒置培养1216 h。2.4 克隆文库构建2.4.1构建克隆文库随机挑取96个白色阳性克隆子打入lb液体培养基37震荡培养10h，进行菌液pcr验证，反应体系如下：pcr的反应体系 反应物 体系（l） taq酶 0.5 dntp 4 ddh2o 12.5 a-19 (20m) 1 s-20 (20m) 1 dna模板 1 总体积 20将阳性克隆的转化子保存于96孔板中(每孔中100l的菌液和50l 30%的甘油)。2.4.2 rflp分析将放线菌特异引物扩增产物(即菌液pcr产物)用限制性内切酶haeiii 37 水浴中酶切2h，并用2琼脂糖电泳检测，135v，27min。酶切体系如下：rflp反应体系 体积 hae iii （10u/l） 0.5l 10 m buffer 2l dna 5l 灭菌双蒸水 12.5l total 20l将酶切图谱中条带有差异的阳性克隆送上海博尚生物工程有限公司测序。2.5 系统发育分析1）所获得的 16s rdna 序列用 check-chimera 工具检测，将其中的嵌合体等不正常的序列剔除。2）对于剩余的放线菌 16srdna 序列，首先进行多序列比对，然后根据 95%相似度的分类标准，将所得的序列进行系统发育类型的归类。3）通过 blast 工具从 genbank 获得与本实验所得到序列亲缘关系最近的序列。将这些序列与本实验获得的 16s rdna 序列一起使用 clustalw 工具进行多序列比对。然后使用 mega 中的 kimura 双参数修正模型进行系统发育树的构建，对于序列间差异较大的未分级序列，使用 p-distance 模型。4）细菌的 16s rdna 序列的系统发育类型多样性根据 shannon 多样性指数 (h)计算， shannon index： h = - pilnpi，pi 某一系统发育类型在所有样品中所占有的比例即 pi =ni/n.3 实验结果3.1总dna的提取及放线菌特异性序列的扩增样品b71-2,b37-3的总dna琼脂糖凝胶电泳检测结果见图3-1-1b71-2电泳条带比b37-3的条带稍亮，可以看出两个样品中dna含量都很高 图2-1-1 ：宏基因组dna电泳检测结果 m: -hind iii marker；1：b71-2 2：b37-3两个样品的总dna用放线菌特异性引物（s-20，a-19）进行扩增，在640 bp处出现条带（见图3-1-2）。图3-1-2：放线菌特异性引物扩增dna电泳检测结果1：marker d2000 2：b37-3 3：b71-23.2 菌液pcr电泳结果利用放线菌特殊引物s-20；a-19为引物进行连接转化，对菌液进行pcr的结果（部分样品）如图3-2：图3-2菌液pcr电泳图像1：marker d2000 条带：b71-2 69-783.3酶切后电泳结果部分样品如图3-3：图3-3：hae iii酶切电泳结果1：marker d2000 条带：b71-2 39-583.4部分测序和比对结果b71-2 60ctgtggtagaggcggatcgagctcggtacccggggatcctctagagattccgtactccccaggcggggtacttaatgcgttagcttcggcacggcagtcctggataagaccgccacacctagtacccaacgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgctcctcagcgtcggtatcggcccagagagccgccttcgctactggtgttcctctcgatatctgcgcatttcaccgctacaccgagaattccactctcctctaccgaaccctagccatagcagtttcgatcggcgtcccggagttgagccccggggtttcacgaccgacttgctaagccgcctacgagctctttacgcccaataaatccggacaacgctcgccccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttggccggggcttcttctggaggtaccgtcaatttcgtccctcctgaaagaggtttacgacccgaaagccttcatcccccacgcggcgtcgctgtctcaggcttgcgcccattggacaatattccctgctgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcgtcctctcagaccagctacccgtcgttgccttggtgagctgttacctcaccaacaagctgataggccgcgaatcgtcgacctgcaggcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcatuncultured actinobacterium clone anox-056 16s ribosomal rna gene, partial sequencegenbank: jf344618.1genbankgraphicspopsetgi|326699519|gb|jf344618.1| uncultured actinobacterium clone anox-056 16s ribosomal rna gene, partial sequenceagagtttgatcatggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaatgcatgcaagtcgaacgggaccctccgtctgggtaaccagacggggacgtctagtggcgaacgggtgagtatcacgtgagtaacctgccccgaagaccgggatagcccggggaaacccggattaataccggatatcgtcatcggatcacctgatctgatgacgaaatggtccgccgcttcgggatgggctcgcggcctatcagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgacgggtagctggtctgagaggacgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagcagggaatattgtccaatgggcgcaagcctgagacagcgacgccgcgtgagggatgaaggctttcgagtcgtaaacctctttcaggagggacgaaattgacggtacctccagaagaagccccggccaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggggcgagcgttgtccggatttattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttagcaagtcggtcgtgaaaccccggggctcaactccgggacgccggtcgaaactgctatggctagggttcggtagaggagagtggaattctcggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcgagaggaacaccagtagcgaaggcggctctctgggccgataccgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgttgggtactaggtgtggcggtcttatccaggactgccgtgccgaagctaacgcattaagtaccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacggggccccgcacaagcggcggagcatgcggcttaattcgatgcaacccgaagaaccttacctggacttgacatcatgggaaaaaccgtggagacacggtgtgcttcggcgtccatgacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcctatgttgccagcggataatgccggggactcataggagactgccggggacaactcggaggaaggcggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccagggctgcacgcatgctacaatgggcggtacaacgggccgcgatcccgcaagggtgagccaatcccttaaagccgtcctcagttcggattggagtctgcaactcgactccatgaagccggagtcgctagtaatcgcggatcagcaaagccgcggtgaatacgttctcggggcttgtacacaccgcccgtcacatcacgaaagtcggtaacacccgaagtcagtggcccaaccttttaggagggagctgccgaaggtgggatcggtgattgggatgaagtcgtaacaaggtab37-2 9gagaggcggattcgagctcggtacccggggatcctctagagattccgtactccccaggcggggcacttagtgcgttagctgcggcaccgaggggttcgctccccccgacgcctagtgcccatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagcttcggcccagcgagccgccttcgccactggtgttcgtcccgatatctacgcattccaccactacaccgggaattccactcgcctctaccgagctctagccacgcagtatcgcctgcagccccggagttgagccccgggatttcacaagtgactgacgcggccgcctacgcgcgctttacgcccagtaattccggacaacgctcgcaccctccgtattaccgcggctgctggcacggagttagccggtgcttcctctgggggtaccgtcactcccggtcccctattcgaggccgggcattcgtcccccctgacagtggtttacaacccgaaggccttcatcccacacgcggcgtcgctgcgtcagccttgcggccattgcgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtatctcagtcccaatgtggctggccatcctctcagaccagctacccgtcgtcgccttggtaggccattaccccaccaacaagctgataggccgcgaatcgtcgacctgcaggcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaatttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggttgcgtattggggcggctuncultured actinobacterium clone adl-a126 16s ribosomal rna gene, partial sequencegenbank: hq718741.1genbankgraphicspopsetgi|338708795|gb|hq718741.1| uncultured actinobacterium clone adl-a126 16s ribosomal rna gene, partial sequencecgcggcctatcagcttgttggtgaggtcacggctcaccaaggcgacgacgggtagctggtctgagaggatggccagccacattgggactgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcgcaatggccgcaaggctgacgcagcgacgccgcgtgtgggatgaaggccttcgggttgtaaaccactgtcaggggggacgaatacccggcttcgaacaggggaccgggggtgacggtacccccagaggaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttgtccggaatcactgggcgtaaagcgcacgtaggcggccgcttaagtcgcttgtgaaatcccggggctcaactccggggctgcaggtgatactgggtggctagagctcggcagaggcgagtggaattcccggtgtagcggtggaatgcgtagatatcgggaagaacaccagtggcgaaggcggctcgctgggccgaagctgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgggcactaggcgtcggggggagcgaccccttcggtgccgtcgctaacgcattaagtgccccgcctggggagtacgg3.5系统多样性分析实验随机挑选96个克隆子，经过hae酶切筛选后，对b71-2样品27个克隆子进行测序,对b37-3样品31个克隆子进行测序，同时各自构建两个样品点的克隆文库。3.5.1 进化多样性分析（进化树）把测序获得的30个克隆的16srdna基因插入片段同genbank 数据库中已知序列进行比对，每个序列以99.0%相似性23划分为一个out 作为标准来分析序列信息24，得到黄渤海b71-2样品位点23个otus，b37-3位点24个otus。将测序结果以及在ncbi中blast比对结果利用mega 4软件进行进化树构建如下b71