双标水法在能量代谢测定中的研究及应用现状.doc

双标水法在能量代谢测定中的研究及应用现状第8卷第5期2008年2月16711819(20085125207科学技术与工程sciencetechnologyandengineeringvo1.8no.4feb.2id0l82008sei.teeh.engng.医药卫生双标水法在能量代谢测定中的研究及应用现状刘健敏朴建华杨晓光(中国疾病预防控制中心营养与食品安全研究所,北京100050)摘要双标水法是能量代谢测定方法中的金标准,综述了双标水法在国内外的研究及应用现状,为双标水技术在修订我国膳食能量摄入标准(rni)中的应用提供有益参考.关键词双标水能量代谢测定中图法分类号r151.1;文献标志码a能量代谢(energymetabolism)是人体最基本的生理活动之一,能量代谢的测定对于营养学,运动生理学,预防医学和临床医学等均具有重要的意义.寻找客观,精确,重复性高的能量代谢测量方法,一直就是生理学家,营养学者和医学工作者研究的重要内容.目前测定人体能量代谢的方法很多,常用的有直接测热法(directcalorimetry)和间接测热法(indirectcalorime扛y).直接测热法是在隔热的条件下,将受试者关闭在量热器内,测量人体能量代谢过程中散发的热能.由于设备复杂,活动受限,其应用受到限制.间接测热法是现在能量代谢测量中常用的方法.其原理是根据三大产能营养素在产能时所消耗的氧气和产生的二氧化碳存在的定比关系,在特定条件下,一定时间内测量耗氧量和二氧化碳的生成量来计算其能量消耗.常用的有多氏袋和近年来出现的气体代谢分析仪.2007年l1月15日收到国家自然科学基金(30771811)资助第一作者简介:刘健敏(1971一),中国疾病预防控制中心营养与食品安全研究所博士生.通信作者简介:杨晓光,研究员.双标水法是20世纪80年代出现的一种人体能量消耗测定技术,它以稳定同位素标记的h埔o作为示踪物,通过稳定性核素氘(h)标记身体中的ho,用重氧(埔o)标记身体中ho和co,通过分析尿液中标记物的峰度值变化,了解机体的能量代谢情况,其精确度2%8%,准确度1%3%,被誉为能量消耗测定的金标准.现综合有关文献,对双标水技术在能量代谢测定中的研究及应用现状做一综述,希望这项在国外已被广泛应用于营养科学领域的新技术能够在不久的将来切实有效地服务于我国的科学实践,并对准确制定我国的食物能量摄人标准提供有益参考.1国内外研究现状1.1历史渊源用双标水测定动物能量消耗率的方法由lifson等_4始创于20世纪50年代,最初的研究主要局限于小动物.直到20世纪80年代才开始应用于人体研究.其主要原因是招o的价格昂贵,当时每公斤体重所需的同位素价格为1500美元.后来,随着5期刘健敏,等:双标水法在能量代谢测定中的研究及应用现状l253生产同位素的成本下降,特别是由于高灵敏度和高精确度的同位素比质谱仪(isotoperatemassspectrometer,irms)的应用,使得同位素的用量大大减少,从而费用降低,才有可能将此方法推广到人体.采用双标水法对人体活动时的能量消耗进行测定最早见于schoeller和vansanten的研究,它是一种能够准确测量人体在13常生活和工作中总能量消耗的能量代谢测定方法.1.2基本原理在营养代谢研究中,稳定同位素常被用作示踪剂来描述营养物质被摄人体内以后所经历的代谢动力学过程,最常用的稳定同位素包括n13c,h,埔0,ca,44ca等等,其中双标记水(h埔0)常用来作为能量代谢的示踪剂.双标记水中的稳定性同位素h和埔0丰度远高于自然界中水的丰度(水中天然丰度:h0.015%,埔00.204%),当受试者摄入一定量的双标记水(h2180)后,机体即被这两种同位素所标记.h参加水的代谢,其速率常数反映水的代谢率rh0;埔0既参加水的代谢,又参加co的代谢,由于碳酸酐酶的催化作用使得0在h0和co之间处于反应平衡,其速率常数反映水的代谢率rh0和co的代谢率或生成率rco,当h0和co反应平衡时,k.一k可得到co的生成率rco2.通过呼吸商(respiratoryquotient,rq)和得到的co生成率可算出o消耗量,最后利用经典的weir公式_6就能计算出单位时间内平均能量的消耗量.1.3基本操作1.3.1双标水的来源国际上主要重氧水(h,o)的生产厂家有:美国cambridgeisotopelaboratories,inc(简称:cil);sigmaaldrichcorporation等.其中,美国剑桥同位素实验室公司是全球最大的医用o同位素分离单位,年生产能力为250kg,并通过gmp和美国fda认证,重氧水的规格分别有:10.0atom%,95.0atore%和97.0atom%.国内仅有极少生产厂家报道生产重氧水(ho)产品:上海化工研究院采用水精馏路线,生产3种规格的重氧水(h埔o)产品:10.0atom%,95.0atom%和97.0atom%;江苏华益埃索托普公司采用高效的精馏分离技术,可根据不同用户的要求提供2%97%各种规格的重氧水以及双标水,年生产能力达100kg.1.3.2双标水的给药途径及剂量双标水一般采用口服的方式给药,事先按照一定的比例配制,消毒灭菌后用于人体.目前双标水的应用剂量为:h(0.050.70)g/kgtbw(totalbodywater),o(0.120.40)g/kgtbw,未成年人剂量要稍微高于成人.二者的浓度没有严格的比例限制,以同位素测试仪器的精确度为准.同位素的剂量与同位素丰度测试的误差有关,剂量大,费用增加,剂量小,精度低于5%.根据以往的研究经验,h和o的最适同位素剂量见表1.表1最适同位素剂量及实验周期1.3.3实验周期及样品收集实验周期与同位素的生物半衰期有关,实验期过短,同位素丰度值变化太小增加偏差;实验期过长,后期样品的同位素丰度接近本底值增加测量误差,通常收集时间为13周,最适实验周期见表1.双标水法收集的样品可以是尿液,唾液或者血液,通常样品为尿液,婴儿可收集唾液或尿液.样品收集有多点法和两点法,多点法是指收集全部实验过程的样品并分析,两点法是指只收集实验开始一天和结束一天的样品并分析,大多数情况下,两种方法都能得到正确的结果,但在某些特殊情况下每种方法都有其优点和缺点j.收集到的样品分装于密封管中,一20c冰箱保存备用.1.3.4样品分析及结果计算样品经过预处理,采用气体同位素比质谱仪(isotoperatemassspectrometer,irms)进行测定,得到样品的8招o和8h.上海第二医科大学罗伟等用双标水示踪法测定13例正常成年人的能量1254科学技术与工程8卷消耗,首次在国内建立了双标水样品测定方法,尿样双复管测定的平均cv%小于1%,最大不超过2.5%.得到样品8值后,结果计算参照以下步骤.(1)8值的修正实验测得的各时间点墙o和h的8值首先要使用下面的公式进行修正,换算成百分数=(d一d)/(dd一d)(18.02a/wa)为墙0或h的丰度;d为样品的丰度比值(相对于工作标准的比值8);d.为口服双标水前,基线样品的丰度比值(相对于工作标准的比值8);d由为稀释后双标水的丰度比值(相对于工作标准的比值8);d为现场自来水的丰度比值(相对于工作标准的比值8%.);a为分析用双标水重量(g);w为稀释口服双标水所用的重量(g);a为口服双标水的重量(g).(2)同位素消除曲线的绘制分别用样品埔o和h的丰度值取自然对数为纵坐标,以时间为横坐标作图,分别得到两条直线,即为同位素的消除曲线,见图1.o和h的速率常数分别为各自消除曲线的斜率和.由两条消除曲线反推到t=0,得到截距,把截距反对数后再取倒数,得出.和,它们分别代表o和h代谢池的大小,二者的比值应在1.0151.06之间.y=一o.1062x一7.44168o1h,时问/d图1尿样中同位素的消除曲线(3)co的产生速率由同位素的消除曲线,可以得到埔o和h的速率常数k.和以及埔o和h代谢池的大小.和,从而得到co:的产生速率.由于尚需考虑标记水分子的分馏因素而加入校正因子,因此实际计算用的公式各家报道不尽相同,目前国内外文献中常用的是speakmanmodel,它是在lifsonmodel和schoellermodel的基础上,综合了161份双标水测定数据得到的,根据speakmanmodel算出co2的产生速率.rco2=(n/2.196)(ko一1.0427).其中,n=(no+d/1.0427)/2.(4)呼吸商(rq)呼吸商是指一定时间内机体co产量与o消耗量的比值,rq随着受试者摄人的混合食物中蛋白质,脂肪,碳水化合物的比例不同会产生0.71.0的变化.当受试者处于热量平衡状态(体重恒定)时,可用食物商(foodquotient,fq)代替rq,食物商(fq)可由实际摄人的食物组成计算得到.已知食物商fq和co生成率rco2,则o2的消耗速率ro=rco/fq.(5)总的能量消耗(tee)最后,总的能量消耗可以依据经典的weir公式计算得到.tee=3.941ro2+1.106rco22.17un(un为每天的尿氮量g/d)1.4优缺点评价1.4.1优点首先,双标水法测定结果准确,与常规的能量代谢测定方法相比,其精确度(2%8%)和准确度(1%3%)都比较高,被称为能量代谢测定的金标准.其次,双标水法基本不干扰受试者的一切正常活动,它测定的是人体在自由活动情况下的能量消耗,与实际情况更为接近,可以实现对不能合作者及活动不应受限制者的能量消耗的测定.最后,双标水法无毒,无损伤,它使用的示踪物h和埔o是无放射性的稳定同位素,对人体无害;样本的收集过程较为简单,仅收集尿液来计算体内同位素的残留量,对人体无创.此外,双标水法在测定能量代谢的同时,可以评价总体水及体成分.1.4.2缺点首先,双标水法实验费用昂贵,不仅试剂双标水价格昂贵,而且测试需要灵敏度和精确度较高的同位素质谱仪和高技术素质的分析人员,这限制了鲫m0培墙一mu1一籁茛皿笛】旱巡件喀婪5期刘健敏,等:双标水法在能量代谢测定中的研究及应用现状此方法在营养科学和流行病学大样本人群中的应用.其次,双标水法只能测定人体总的能量消耗量,它是对某时间段内尿液中的稳定同位素进行分析,只能获得这一时间段内总能量消耗方面的信息,难以了解每天或每小时的能量消耗模式.最后,双标水法还存在分析准确性上的缺陷.因为双标水法是建立在一些假设和理想条件下的,当应用于实际环境时容易产生误差,需要进行相应的校正.在理想条件下,h只以水的形式代谢,o也只以水和二氧化碳形式代谢,但实际上机体组织会发生同位素捕获或者交换.例如,合成脂类时就有h的掺入,同位素还会以尿素,碳酸氢盐等非水的形式排泄.当受试者的体重在研究期间发生变化时,这种现象造成的误差会很明显,导致低估能量消耗.但如果机体处于稳定阶段,这种误差则可以忽略.2国内外应用现状目前,国外用双标水法研究人体能量代谢的报道f3益增多,研究领域不断扩大;现国内已有学者同国外实验室合作,用双标水法进行研究.2.1各种生理条件下的人群双标水法目前已广泛应用于不同人群能量消耗的研究,如早产儿,儿童,艾滋病人,肥胖人群,孕妇,哺乳期妇女和老年人,这些人群如果采用其他能量测定方法则会遇到很多问题.譬如,以往因检测方法的限制,研究婴儿能量消耗很困难,只有在睡觉时才能较容易测定.现在由于双标水法的优势,使这方面的研究有了很大进展2一.国内也开展了这方面的工作,广东中山大学蒋卓勤等用双标水法对4月龄或6月龄婴儿的能量需要量进行了研究;中国疾控中心王京钟等用双标水法测定了54例4月龄和6月龄婴儿的体成分.近几年双标水方法在成人和儿童肥胖,慢性病等流行病学方面的研究成果也引人关注7,这些研究充分显示了该法的突出优点,即对不能合作者及活动不应受限制者的能量消耗的测定.2.2体育科学领域充足的能量摄入对于出色的竞技非常重要,教练员,运动员,科研人员都很关注男女运动员的能量代谢.尽管心率监测法等在个体能量消耗测定中普遍应用,但这些方法有时会对训练和比赛有负面影响;而双标水法丝毫不干扰训练活动,可作为有效,精确测量能量消耗的参考.目前,双标水法已初步应用于体育科学领域的实验室研究和场地研究中,如环法自行车赛运动员,南极探险运动员,珠穆朗玛峰登山运动员等j.一直以来,运动员的能量摄入主要依靠饮食记录法进行估算,其准确性存在很大的争议.trappe等对5名女子游泳运动员的研究表明,大运动量训练期间,女子运动员的每f3能量摄入ei(饮食记录法)与总能量消耗tee相比有很大差距(ei:3136-4-227kcal/d,tee:5593-4-495kcal/d).ebine_j等对8名男子足球运动员能量消耗的测试也发现,采用饮食记录法所得到的数据有明显的低报.这说明以膳食记录为基础计算能量摄入不能较好地预测运动员的能量消耗.在我国,北京医科大学运动医学研究所与英国dunn营养中心合作,将双标水技术应用于我国少年体操运动员的能量消耗研究,结果表明儿童体操运动员的总能量消耗高于推荐能量摄入量,这一结果与国外的相关研究相一致,可能与运动员每f3从事运动训练时消耗大量能量有关j.2.3评定其它能量代谢测定方法的准确性利用双标水方法的准确性,以双标水法为参照来评定其它能量代谢测定方法的有效性和可靠性,有关这方面的报道很多卜j.如美国约翰?霍普金斯学院joan等将7f3体力活动回顾问卷法与双标水法做了比对研究,结果表明体力活动问卷能够较为准确地评估个体总能量消耗,但是需要良好的个体依从性及严格的督导.国内关于这方面也有报道,如中国疾控中心刘爱玲等应用双标水法对加速度计(csa)测量成人f3常体力活动的效度进行验证,结果表明两者测得的能量消耗值存在显着的正相关关系(r=0.31,p<0.01).2.4能量推荐摄入量(rni)的制定能量推荐摄入量(rni)是营养科学重要的技术1256科学技术与工程8卷指标,也是国家制定食物发展计划和指导食品加工及食品营养素标识的重要依据.由于能量需要量与人种和膳食模式密切相关,许多国家都制定了各自的能量推荐量.目前,中国居民膳食能量参考摄人量(rni)是中国营养学会2000年制订的,它是以1985年fao/who/unu有关能量方面的报告为基础,采用who推荐使用的schofield公式,对其稍做修正后用于计算中国久的基础代谢能量消耗,进而估算总能量需要量.由于缺乏可靠的中国人体实测数据,完全在西方人体数据的基础上进行经验下调,因此其准确性值得商榷.2002年全国营养调查结果显示j,过去20年,我国居民膳食能量摄人呈下降趋势.以标准人计,1982年10413kj/d,1992年9732kj/d,2002年9407kj/d,2002年能量摄人仅达到推荐值的94%.与此同时,中国人的超重和肥胖率却呈上升趋势,与1992年相比,2002年成人超重率上升39%,肥胖率上升97%.从能量平衡的角度来解释,这种现象一方面可归因于国人体力活动减少降低了能量支出;另一方面,也让我们对我国的能量推荐值是否过高产生了疑问.而rni的高估必然导致能量蓄积,对个体而言最终引起超重和肥胖的发生,对群体来说导致超重率的增加,这种变化是一个长期积累的过程,最终势必引发严重的公共卫生问题.who的报告建议j,各国应尽可能以实际测定的能量消耗量为基础,来确定人体的能量需要量.制定能量需要量应以准确的能量消耗测定值为基础.因此,双标水法在制定新的能量推荐需要量中发挥了重要的作用.目前,西方国家已经积累了大量的人体能量代谢数据.black等收集了12年中576例关于双标水的研究,结果显示美国于1989年制定的能量摄人标准中,婴儿和儿童的偏高,而青少年和成年人的偏低.davis综述了双标水研究中400多个婴儿的资料,认为目前对1周岁内婴儿能量摄人的推荐值比用双标水法测定的能量消耗值高10%.bandini等对109名(812)岁儿童的研究发现,他们的平均能量消耗比black等的评估要高(100200)kcal/d.bratterby_4等对46名青春期少年的研究与black等的评估基本相符.carpenter等对164名(6570)岁的老年人的研究资料显示,男性受试者能耗量与black的评估值基本相符,而女性受试者的能耗值与black结果有较大差距.这些人体能量代谢数据对于rni的修订和补充具有重要的参考价值.在我国,有关这方面的报道很少.目前,只有中国疾控中心姚漫江等与美国tufts大学合作,以(3549)岁北京市民为受试对象,用双标水法测定了其日常活动能量消耗.对于我国能量rni的进一步修订,则需要更多,更新的中国人的实测数据来支持.3总结最后,我们认为关于能量消耗测定方法的选择,取决于实验的目的,测量的条件(实验室,现场),实验对象及经济因素等.每种方法的有效性都受其方法本身固有的缺陷所限制,包括双标水法在内.双标水法尽管准确,但由于其高额的成本,限制了它在大范围人群中的应用.而rni的修订则需要有不同年龄,不同职业,不同地域的大样本参与,这就需要以双标水法为标尺,寻找更为经济,适用于大样本人群的能量代谢测定方法.参考文献1李继尧.人体的能量代谢.生物学通报,1995;30(2):293o2吴坤.营养与食品卫生学.北京:人民卫生出版,2003:34353胡雅儿.实验核医学与核药学.北京:人民卫生出版.2004:262_2634lifnn.gordongb.mcclintockr.meurementoftotalcbondioxidepmducdonbymeans0fd2oapplphysiol,1955;(7):7o4_7lo5schodlerda,vansantene.meureofhumanenergyexpenditureinhumansbydouylabdedwatermethods.japephysiol,1982;5319559596weirjb.newmethodsf0rcmculingmetabolicrmewitlispecimief-encet0proteinmetabolism.jphysiol,1949;109:l-_97prenticeam,vquesvl,daviespsm,eta1.t0t8lenergyex-penditureoffreelivingiantsandchildrenobtainedbythedouylabeledwatermethod.switzerland:idecg.1987:83一lol5期刘健敏,等:双标水法在能量代谢测定中的研究及应用现状12578prenticeam.thedoublylabeledwatermethodformeasuringenergyexpenditure.vienna,internationalatomicenergyagency,19909murgatroydpr,shttyps,prenticeam.techniquesforthemeasurementofhumanenergyexpenditure:apracticalguide.intjobes,1993:17:54956810罗伟,戴腾昌,夏宗勤.用双标记水示踪法测定人体自由活动时的能量消耗率.中国应用生理学杂志,1994;10(3):28328711speakmanjr,nairks,goranmi.revisedequationsforcalculatingco2productionfromdoublylabeledwaterinhumans.amphysiolsoci,1993;264:e912-e91712schoellerda,ravussine,schutzy,eta1.energyexpenditurebydoublylabeledwater:validationinhumansandproposedealeulation.amphysiolsoci,1986;250:r823-r83013blackae,prenticeam,cowardwa.useoffoodquotientstopredictrespiratoryquotientsforthedoublylabeledwatermethodofmeasuringenergyexpenditure.humnutrclinnutr.1986;40(5):38139114westerterpkr.foodquotient,respiratoryquotient,andenergybalance.amjclinnutr,1993;57(supp1):759s-765s15toubros,s,rensentia,hindsbergerc,eta1.twentyfourhourrespiratoryquotient:theroleofdietandfamilialresemblance.jclinendocrmeta,1998;83(8):2758-276416cowardwa.thedoublylabeledwater(h218o)method:prineiplesandpractice.proenutrsoc,1988;47:20921817schoellerda.measurementofenergyexpenditureinfreelivinghumansbyusingdoublylabeledwater.jnutr,1988;118:1278128918robertssb.areviewofthedoublylabeledwatermethodformeasurementoftotalenergyexpenditure,totalbodywater,waterintakeandmetabolizableenergyintakeinhumansandsmallanimals.canjphysiolpharmac.1989;67:1190119819sehoellerda.bandiniig,dietzwh.inaccuraciesinselfreportedintakeidentifiedbycomparisonwiththedoublylabeledwatermethod.canjphysiolpharmae.1990;68:94194920blackae.thesensitivityandspecificityofthegoldbergcutoffforei:bmiforidentifyingdietreportsofpoorvalidity.eurjclinnutr,2000;54:39540421冯建英.一种测定能量消耗的新技术双标水法.中围运动医学杂志,1996;15(3):203-20522goranmi,carpenterwh,poehmanet.totalenergyexpenditurein4一to6一yroldchildren.amjphysio1.1993;264:e70623daviespsw,gregoryj,whitea.energyexpenditureinchildrenaged1.5to4.5years:acomparisonwithcurrentrecommendationsforenergyintake.eurojclinnutr.1995;49:3602728293233353839livingstonembe,cowardwa,prenticeam,eta1.dailyener-gyexpenditureinfreelivingchildren:comparisonofheartratemonitotingwithdoublylabeledwater(h2o)method.amjclinnutr,1992;56:343jiangzq,yanq,suyx.energyexpenditureofchineseinfantsinguangdongprovince,southchina,deter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