药学论文天然药用植物蛋白质的理化性质与分离研究.doc

天然药用植物蛋白质的理化性质与分离研究 摘 要 本文从蛋白质的结构特点出发，分析了植物蛋白质的理化性质，提出分离和提取蛋白质应根据所分离蛋白质的性质，选择适当的方法进行预试验，优选出最佳方法和工艺路线，再进行工艺技术条件的考查，确定操作的关键、技术指标和必要的技术参数，以达到提取、分离和制备工艺的稳定可行的目的。关键词 植物蛋白质 理化性质 分离 研究 天然药用中含有两大类有效成分，1类是具有生物活性的化学成分如生物碱类、皂苷类、蒽醌类、黄酮类、香豆素类、强心苷类等等，另1类是具有生物功能的高分子化学成分如各种蛋白质、多肽和胰岛素等。1般从天然药物中提取的高分子化学成分颇为多见并有重要利用价值的是植物蛋白质。1、植物蛋白质的理化性质 蛋白质按其结构和构象的不同可分为两大类，即纤维状蛋白质和球状蛋白质两大类。前者分子的长轴与短轴之比1般大于10、成纤维状、不溶于水、不易被蛋白酶水解，在动植物体内起支持和保护作用；而球状蛋白质分子的长短轴相差较小、呈球状或楕圆状，其肽链的构象常包含部分螺旋、片层、折角和无规则的卷曲而形成紧密的球状结构，多数非极性侧链位于分子内部，而极性侧链基团多数位于分子表面形成亲水区，故1般都溶于水，这些极性基团的种类、数量和分布与蛋白质的生物功能密切相关，1般存在于天然药物中的蛋白质多数为球蛋白。论文 毕业论文网 蛋白质是1类高分子化合物，分子量1般在1万以上，通常将分子量低于1万者称为多肽，高于1万者称为蛋白质。当然这种界限划分不是很严格的，如胰岛素的分子量低于1万，而习惯上则称它为蛋白质。蛋白质是以氨基酸为单位的肽链结合起来的链状结构，链的尽头存在自由氨基和羧基(通常称为氨基酸残基)；处于侧链上的氨基酸残基尚有不少可离解成两性离子,所以蛋白质是两性物质。即在不同的ph值环境下可解离为正离子和负离子，而且具有各自的等电点。蛋白质的两性解离与等电点的特殊性对蛋白质的分离纯化和检测分析都具有重大的实用价值。蛋白质的等电点沉淀、离子交换和电泳等分离分析方法都是基于这种特性。 由于蛋白质具有较大的分子折叠结构(通常又以2级结构、三级结构和四级结构来描述)，分布于外表的亲水基团与水分子以氢键形成水化膜，在电荷作用下阻止蛋白质的沉降，因而它们的水溶液呈胶体状态，具有胶体的性质(如布朗运动、光散射现象、不能通过半透膜以及具有吸附能力等特性)。蛋白质胶体较稳定，其稳定的基本因素是它分子表面的水化层和同性电荷的作用。若破坏这些因素即可促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，这就是蛋白质盐析、等电点沉淀和有机溶剂分离沉淀法的基本原理。 蛋白质分子聚集而从溶液中析出即蛋白质沉淀，可能是变性的，也可能是未变性的，它主要取决于沉淀的方法和条件。例如，在蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐，如nacl、na2s04、 (nh4)2s04等， 因破坏了蛋白质的水化层并中和其电荷，使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，这就是盐析作用，这种沉淀出的蛋白质不变性；但如果在蛋白质溶液中加入与水可互溶的有机溶剂，如乙醇、丙酮、甲醇等，虽然也能使蛋白质表面失去水化层相互聚集而沉淀，却可引起蛋白质变性；另外，加热也可使蛋白质变性沉淀。可见，选用不同的沉淀方法所沉淀出来的蛋白质可以是变性的，亦可以是不变性的。蛋白质变性作用的本质是它分子空间构象的改变，而不涉及其1级结构的改变或肽链的断裂，因此变性过程不伴随蛋白质组成和分子量的变化。 引起蛋白质变性的因素很多，其中有物理因素(如加热、紫外线照射、声波、高压等处理)，也有化学因素(如在脲、胍、去垢剂以及有机溶剂等的作用下)。不同的蛋白质对变性因素的敏感性各不相同，有的蛋白质相当稳定，有的则很敏感。变性蛋白质常丧失生物活性、溶解度降低、粘度增大、扩散系数变小、某些原来埋藏在分子内部的侧链基团(如酪氨酸残基等)会暴露到分子表面而出现光谱变化等等。蛋白质变性沉淀和未变性沉淀，其实是两个不同的概念，通常将前者称为变性蛋白质，将后者称为沉淀蛋白质。2、分离提取植物蛋白质的方法及工艺研究 药用植物蛋白质的分离提取可按其基本性质选择溶剂和提取次数，并通过试验优选出适宜的溶剂和提取条件。总的要求既要尽量提取所需的蛋白质，又要防止蛋白酶的水解及其它因素对蛋白质特定构象的破坏作用。蛋白质的分离方法主要有部分分级沉淀法、吸附法和超滤法。部分分级沉淀法包括有机溶剂分级沉淀法、盐分级沉淀法和ph分级沉淀法。有机溶剂分级沉淀法通常使用乙醇、丙酮作溶剂，预先将蛋白质分离样品和溶剂分别冷却，并将有机溶剂由低至高选择几个实验浓度，每1个浓度所沉淀出的蛋白质经离心分离，取出沉淀物，立即溶于足够量的水或缓冲溶液中，使有机溶剂稀释到无害浓度，再将其母液继续加有机溶剂到预定的另1个浓度，沉淀出另1部分蛋白质。盐分级沉淀法也是比较常用的，硫酸铵是最常用的沉淀剂，因为它的溶解度大，且对蛋白质或酶无破坏作用，硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、磷酸钾也可使用。盐析分级沉淀的蛋白质1般能保持着天然构象而不发生变化，有效地使蛋白质分级沉淀常取决于选用不同的盐浓度。 ph分级沉淀法是利用蛋白质在等电点时其溶解度最小的性质，使蛋白质沉淀分离出来。在改变ph值情况下，有时是有活性的蛋白质沉淀，而没有活性的仍可保留在溶液之中，或反之。通过这种方法，可以除去1部分杂质而达到分离纯化的目的。 吸附法是纯化酶的1种经典的且至今仍在继续沿用发展的重要方法。吸附剂对酶的吸附力常受ph值、温度、溶剂、吸附剂状态及电解质浓度等条件的影响，通常以弱酸性(ph=56)和低的电解质浓度比较适宜。吸附后的酶进行洗脱或改变1下ph值就可达到目的，有时则可通过改变电解质浓度来进行洗脱。常用的吸附剂有氧化铝、磷酸钙、活性炭和淀粉等。分级沉淀法和吸附法所得到的蛋白质或酶，常含有盐和其它小分子杂质，可用透析方法除去。超滤法是利用超滤膜在1定压力或离心力的作用下，大分子物质被截留、而小分子物质则被滤过排出的1种膜分离技术，可以通过选择不同孔径的超滤膜来截留不同分子量的蛋白质或选择性分离所需分子量的蛋白质。超滤过程中无相态的变化、条件温和、蛋白质不变性。并且，本法具有简便、快速、大容量等特点，随着制膜技术和超滤装置的发展和进步，超滤法将是1种很有前途的分离方法。三、分离效果和活性检测 蛋白质的纯度在这里是指1定条件下的相对均1性。所以选择检测方法的灵敏度，要与有效成分的纯度相1致。检查分离效果主要是看其纯度，其检测方法有色谱法、电泳法和免疫化学法。在实际操作中可根据蛋白质的性质和纯度标准选择适当的方法进行检测，以控制产品稳定于1定的纯度。为此，应首先确定含量的测定方法。 蛋白质含量的测定方法有克氏定氮法、福林酚试剂法(cowry法)、双缩脲法和紫外分光法，近年来也报道1些新的方法如bca比色法和biorad蛋白分析法等。bca比色法是依据在碱性溶液中，蛋白质将cu2+还原为cu+，再与bca生成紫色复合物，于562nm处有最大吸收峰，其强度与蛋白质浓度成正比,此法最大的特点是抗干扰性强。biorad蛋白分析法是利用特有色素与蛋白质分子侧链基团结合，引起光吸收性质改变，并在1定范围内服从beer定律。此法的特点是简便、快速，只需加1次试剂，10min左右即可完成，灵敏度很高，可测定lg含量蛋白质，而氨基酸、edta去垢剂和糖类均对其无干扰。 蛋白质的高分子特性形成了复杂而特定的空间构象，从而表现出蛋白质特异的生物活性。某些物理和化学因素可使蛋白质分子的空间构象发生改变和破坏，导致蛋白质变性而丧失其特有的生物活性，因此在提取、制备具有生物活性的蛋白质、多肽和酶时，要特别注意防止发生蛋白质变性。所以除了在提取、分离、制备过程中要严格控制条件，防止发生蛋白质变性之外，还要通过各种生物活性的测定方法对制品的活性进行考查，以验证提取和分离效果。四、结 语 药用植物品种繁多，所含蛋白质的类别也很多。分离纯化出高纯度有生物功能的蛋白质1直是1项艰巨的工作，在基因工程药物蛋白质的生产中，收率低和纯度低是亟待解决的关键问题。蛋白质提纯的总目标是设法增加制品纯度或比活性，对纯化的要求是以合理的效率、速度、收率和纯度，将需要蛋白质从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来，同时仍保留有这种多肽的生物学活性和化学完整性。由于药物蛋白质昂贵的市场价格，回收率稍有提高就有可能带来巨大的经济效益，所以，有关蛋白质在分离纯化中的失活