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南京理工大学 硕士学位论文 复合物理场对微生物的诱变作用 姓名：唐仕荣 申请学位级别：硕士 专业：生物化工 指导教师：杨树林 20040701 坝f 论文复合物理场对微生物的诱变作用 摘要 本论文对本实验室筛选得到的一株产纤维素酶细菌l b t 一3 6 进行了紫外、微波复 合诱变，选育到一株滤纸酶活力提高了2 0 2 7 的突变株w b 2 。同时进行了发酵条件 的优化，最佳条件为：麸皮5 0 l ，( n h 4 ) 3 p 0 4o | 4 ，蛋f 勺胨0 ，1 ，n a c l0 4 ，t w e e n 8 0 o 2 ，接种量3 ( v v ) ，p h 8 0 ，3 0 培养4 8 h ，滤纸酶活力达到1 2 3 5 u m l 。还研 究了红、黄、蓝、绿和紫色五利t 发光二极管对w b 一2 生长的影u 虮 同时对牛物表面活性剂产生菌l 2 1 进行了紫外诱变，筛选到一株糖脂产量提 高了1 1 2 5 的突变株l z 2 5 1 1 。 关键词：诱变育种纤维素酶发酵优化l e d 生物表面活性剂 彻i 论文 复台物理场埘微生物的诱变作j i j a b s t r a c t m i c r o b i a lb r e e d i n gs e l e c t i o nw i t hp h y s i c a lm u t a g e n sw a si n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e r t h es t r a i nw b 2o fh i 叠hy i e l dc e l l u l a s ew a st h em u t a n to fs t r a i nl b t 一3 6t r e a t e db yu v a n dm i c r o w a v e i t sf i l t e rp a p e ra c t i v i t yw a s i n c r e a s e db y2 0 2 ，7 。t h eo p t i m u mp a r a m e t e r s f o rf e r m e n t a t i o nc o n s i s t e do f5 0 9 lw h e a tb r a n ，0 4 ( n h 4 ) 3 p 0 4 ，0 1 p e p t o n e ，o 4 n a c l 0 2 t w e e n 8 0 ，p h 8 0 t h em a x i m u mf p ao fw b 一2 r e a c h e d12 3 5 u m la f t e r g r o w t ha t3 0 。c f o r4 8 ho nar o t a r yf l a s ks h a k e r e f f e c to ng r o w t ho fw b 一2w a ss t u d i e d u s i n g f i v el e d s ，w h i c hc o n t a i n e dr e d ，y e l l o w ，b l u e ，g r e e na n dp u r p l e t h es t r a i nl z 2 5 1l o f h i g hy i e l db i o s u r f a c t a n tw a so b t a i n e da f t e ru v t r e a t m e n tf r o m l 2 1 ，i t so u t p u to f g l y c o l i p i dw a si n c r e a s e db yl1 2 5 k e yw o r d s ：b r e e d i n g s e l e c t i o nc e l l u l a s ec o n d i t i o n o p t i m i z a t i o n l e d b i o s u r f a c t a n t y 6 2 4 s 皇6 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生躲醯 ：】哪够月，日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：匿鱼蕴蝌年夕月日 顺i j 论文复台物理场对微生物的诱业作用 1 绪论 1 1 克题依据 工、敖牛物的芮种选f 亨是发酵工业中的重点，是决定该发酵产品是否具有川k 化 生产价值及发酵过程成败的关键。现代发酵工业之所以如此迅猛发展，除了发酵工艺 的改进和发酵设备的更新外，更重要的因素是山于菌种的选冉、改良而为发酵二r ：业提 供了各种类型的突变株，从而使抗生素、酶制剂、氨基酸、维生素等产品的产量成倍 的增长，同时产品的质量也不断的提高。因此，工业微生物育种对 二提高发酵工业产 品的产量和质量，进一步开发利用微生物资源，增加发酵工业产品的品种，具有极其 重要的地位, - 4 1 。 优良的工业微生物菌种是发酵工业的基础和关键，理想的：l ：业微，卜物菌种应符合 以下要求：遗传性状稳定；生长速度快，有较强的抗杂菌污染能力；目的产物 生物合成时间短，产物得率高，较易分离提纯，最好能分泌到胞外；菌株对诱变剂 处理敏感，从而可能选育出高产菌；对温度、p h 值、离子强度等环境冈素敏感性 差；培养基成分简单、来源广、价格低廉；能较长时州保持良好的经济性能。实 际j ：，许多刚从自然界中筛选出来的蒲株一般产量较低，性能较差，必须通过选育来 提高其性能，使其在产量、稳定性上达到定的水平，以更有利于生产。 微生物育种的f 1 的就是要人为地使某些代谢产物过量积累，把牛物合成的代谢途 径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合，优化遗传性 状从而获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。从自然界中筛选出的菌种一般都需经 过诱变育种、杂交育种、原生质体融合或基因重组等方法来提高其性能。诱变育种足 目前使用的极为普遍，效果显著的育种方法，已经获得了许多成果。其中化学诱变 剂的应朋较多，有的诱变效果也较为理想，主要是这些诱变剂刘细胞都具有强 烈的毒性，作用后使微生物发生变异而起到诱变育种的作用，但因其对人体的 致畸致癌作用，实际应用中受到一定的限制。原生质体融合和基凼重组育种是随 着2 0 世纪7 0 年遗传 ：程的发展而发展起来的新型育种方式，在国内外都有较为广 泛的应用，但是它的应用仍存在着较大的局限性，因为基因重组育种的实施首 先需要刘生物的基因结构、序列和功能有充足的认识，并且这种方法较为复杂， 遗传基因重组的发生频率较低，目前还难以像诱变育种那样得到普遍应用，但 随着技术的发展，基因重组已变成越来越重要的育种方法之一。紫外线、微波、 激光等物理诱变因子设备简单，方法易行，操作安全，诱变效果较好，在国内 外有着广泛的应用。复合诱变因子比单一因子诱变效果有很大优势，可以获得 更好的诱变效果。现在诱变育种中广泛使用复合方法，根据不同实验目的而使 用一i 同的处理方式。普遍认为，复合诱变具有协同效应，如果两种或两种以 ： 倾i ，硷殳复台物婵场对微生物的诱蹙种 诱变剂合理搭配使崩，诱变效果要比单一诱变效果好【“。通过微生物在复合 物理场中的诱变作用，研究紫外线、微波等物理历变凶子对微生物的诱变情况， 选育具有实际应用价值的j ：业菌，在理论和实际应用方而都具有重要的意义。 纤维素的高效降解利用和生物表【f i ：活性剂均是当前困内外生物技术领域 的研究热点，具有非常重要的实用价值。纤维素酶可用于_ i 产葡萄糖、单细胞 蛋白、酿酒，以及饲料工业、纺织l ：业、环卫污物处理、农产品加工以及生物 工程等方面，纤维素的生物转化与利用对当前世界能源危机、粮食短缺和环境 污染等问题具有重要的意义，困内外对纤维素酶的研究都极为重视“ “】。生物 表面活性剂是由微生物代谢产生的具有表面活性的两性化合物，与化学合成的 表面活性剂相比，它们除具有降低表面张力、稳定乳化液等相同特性外，还具 有一般化学合成表面活性剂所不具备的无毒、能生物降解等特性，有利于环境 保护，它们在医药、化妆品、洗涤剂、纺织、农药、采矿和食品等许多领域都 有极大的应用潜力，特别是在石油工业，因此，近年来对它的研究同益增多p 、 i 2 1 。 1 2 微生物菌种选育的方法 1 2 1 自然选育 在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变进行菌种筛选的过程即是 自然选育。自然突变主要是微生物在没有人工参与。卜 自发发生的那些突变。人们对这 些偶发事件大量统计后发现碱基对发生自然突变的几率仪为1 0 堪1 0 一。 这种自然突变的结果一般有两种情况：一种是菌种衰退；另种足产生了降能更 好的突变株。所以在生产中应经常进行自然分离( 自然选育1 ，以获得性能稳定的菌株 用于生产。经诱变的突变株也会继续发生变异，多是菌种的衰退而出现产量才i 稳状念， 这时必须进行自然分离，所以自然分离也是诱变育种和杂交育种工作中一个一i 可缺少 的环节。 总之，自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种、防i e 菌种哀退、 稳定生产、提高产量的f 1 的。但是自然选育效率低、进展慢，很难使生产水甲有人幅 度的提高。 1 2 2 诱变育种 诱变育种就是人为的利用物理或化学等因素使诱变的细胞内遗传物质染色体或 d n a 的片段发生缺失、易位、倒位、重复等畸变，或d n a 的某一部位发生改变( 又 称为点突变) ，使微生物的遗传物质的化学结构发生变化，从而引起微生物的遗传变 异，通过筛选获得符合选育目的的变异菌株的一种方法。其理论基础是基因突变，主 要环节是以合适的诱变剂处理大量而分散的微生物细胞，在引起多数细胞死r ：的i 刊时 大大提高存活个体巾的变异率，然后用适当的方法将极少数产生有益变异的菌株挑选 坝f 。论文 复合物埋场埘微牛物的湾叟作门 出来，进行培育，从而获得优良菌株。因此，诱发突变的变异幅度远远大于自然突变。 引发微生物变异的因素主要有物理的、化学的和生物的三大类，见表1 2 2 4 o 表1 2 2 常j j 诱变荆及类别 ! ! ! ! ! ! ：；：；! ! 尘尘i ! 巴! 塑g ! 坚i ! g ! ! ! ! g ! 型 化学诱变剂 1 2 2 1 物理诱变剂 物理诱变剂有紫外线、激光、微波、x 射线、t 射线、射线、d 射线和快巾子等， 其中对微生物诱变效果较好、应用较广泛的有紫外线、激光、x 射线和丫射线。 1 2 2 1 1 紫外线 紫外线是一种使用最* 沿用最久应用效果明显的微生物诱变剂，诱变频率高，迄 今仍然是微生物育种中最常用和有效的诱变剂之。 诱变作用主要是由f 紫外光对微生物的蛋门质、核酸的光化作用而引起的【l ”，其 中d n a 和r n a 的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力，最突出的是嘧啶碱基，它 比嘌呤碱基敏感上酉倍，最大的吸收峰在2 6 0 n m 左右，因此在2 6 0 n t o 五：右的紫外辐 射是最有效的致死剂。紫外线被吸收后引起突变的原因，一般认为：有的是d n a 与 蛋白质交联，有的是胞嘧啶与尿嘧啶之问的水合作用，有的是d n a 分子内或分了间 发生交联反应，如使d n a 分子中相邻的嘧啶碱綦形成嘧啶二聚体，二聚体的出现会 减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基问的正常配对，从而有 可能引起突变或死亡，同时二聚体的形成还会妨碍双链的解7 l ：，因而影响d n a 的j 卜 常复制和转录，从而使子代d n a 形成缺口，碱基错误插入该缺m 造成新链的碱基 序列与母链不同而引起突变。紫外辐射还可以引起转换、颠换、移码突变或缺失等。 其中形成嘧啶二聚体是产生突变的主要原因，嘧啶二聚体不仅可以由单饿上牛h 邻的两 个胸腺嘧啶反应后形成，也可以由双链相应的两个胸腺嘧啶之问产生f 图1 2 2 1 1 ) ”j 。 坝i 。论文复合物耻场对微生物的诱t 璺作用 j 7 开一 ! t p 一五。 l l ；：! - ，l l 一 1 1 一1 1 一r 一 t t a a n 。，i i c h 3 n h ，c i i 、义。 矽廿孑k 一。叮矿一。 胸腺嘧睫 ( t ) 脚腺啼啶二聚体 x ( t t ) a 、。p 髓l 【l 双链卜形成柏哺啶二聚体 b 、胸腺嘀啶二聚体的分r 结构 图1 2 2 1 1 嘧啶二聚体的形成及其分子结构 f i g 1 2 2 1 1f o r m a t i o no f d i p y r i m i d i n e a n dm o l e c u l es t r u c t u r e 经紫外线照射后的微生物，如果马 ：暴露在t 叮见光中，紫外线造成的损伤c q 。以得 到及时修复，细胞的死亡率和突变率都会明显下降。这是光激活酶见光后活化，重新 把胸腺嘧啶二聚体水解成单体，使d n a 复原。 紫外线是常用的物理诱变因子，是诱发微生物突变的一种非常有用的丁具。山丁 紫外线的能量比x 射线和t 射线低得多，在核酸中能造成比较单一的损伤，所以在 d n a 损伤与修复的研究中，紫外线也具有一定的重要性。 山东大学微生物技术国家重点实验室的宋小炎等【”1 以拟康氏木霉经紫外诱变处 理后，l f j 葡萄糖( 梯度浓度) 纤维素双层半扳选育获得一株葡萄糖浓度高达1 0 仍能产 生纤维素水解透明圈的突变株u v i i i 。培养6 d ，干曲的c m c 酶活、f p 酶活和6 g 酶 活分别是出发株的2 4 倍、3 , 4 倍和1 2 6 倍。赵莉等【l5 】以黑曲霉1 0 3 为出发菌株，经 紫外诱变获得一株复合酶高产菌株5 9 8 ，固体发酵培养，其纤维素酶活力、蛋白酶活 力、果胶酶活力、糖化酶活力分别比出发菌株提高了1 1 3 9 、2 9 2 、1 1 2 5 、1 1 5 4 ， 斜面传代培养4 代，产酶性能稳定。值得注意的是，白兰芳等【l6 】以紫外线、光复活处 理两罗莫司产生菌，得到正变株u v 8 6 1 的效价较 ；发菌株高2 3 倍，目紫外照射后， 光复活处理比暗修复处理的证变率高得多，这与u v 处理菌种后必须暗修复的传统观 点恰恰相反。 1 2 2 1 2 激光 自激光问世以来，人们利用激光技术己在许多农作物上进行了诱变试验的探索， 并取得了一些呵喜的成果。在诱变育种r 巾研究得最多的是低强度激光，根据波k 的不 同可分为紫外激光、可见光激光、红外激光。一般认为，激光对生物体的影u 主要是 由于其光、热、压力和电磁场等几方面效应的综合作用，直接或间接地影响，j i 物体的 形态、机能、生长发育及遗传规律【1 7 叫8 1 。 光效应的本质是生物分子吸收不同波长的激光，分子内发生能级跃迁，达到一定 的振动能，引起生物分子内分解、离解或断裂，导致分子激活或损伤。由于激光的光 强度很大，单色性好，一旦激光的频j 棼与某物质分子的振动频率相等，就会产生很强 坝l 论史复合物理场对微生物的诱变韵。，i 的共振，结果使浚物质分子对这种激光产生吸收高峰，在足够高的激光强度下完全可 以有选择地打断特定的化学键，实现光化学反应。核酸的重要组成部分是d n a ，往 d n a 分子中其分子内的氧键、离子键和碱基堆积力维持d n a 分子的稳定，c c 键、氧键、磷酸酯的p o 键和cn 键是形成d n a 分子的天键因素，其q ，c n 键在分子中比例最大，其次是c c 键，o h 键l 耳的比例最小。其中。一h 键共振 波长为2 6 9 n m ，碱基为2 6 5 t - t i n i 右，而共扼双键的共振波长为2 6 0 n m ，且存分子巾 占1 0 9 的比例，它们的吸收波长在紫外2 6 0 n m 波段，由于共扼双键在分子中比例 较大，且吸收2 6 0 2 9 0 n m 波段的紫外光，因而紫外激光的诱变效率最高。而cn 键的共振波长为5 3 4 2 n m ，在可见光范用。而p o 构型、氧键及碱基堆集的其振波 k 分别在9 5 3 0 n m ，1 4 8 0 n m ，1 0 7 8 0 n m 左右浮动，川c 0 2 ，y a g 、n d 等红外激光器 照射达到一定能级后，能引起这些键的断裂，对生物体的结构产生影响。所以，除紫 外光的光子能打断分了内的键，导致突变外，如果其它激光的波长与特定分子键的共 振波长一致时，并且其输出住达到一定能级后，也能够引起特定键的变化及断裂，从 而对生物体产生生物学效应及诱变作用。 热效应主要是一定功率密度的激光作用于生物体可以引起组织内温度的升高，从 丽引起酶失活、蛋白质变性，导致牛物的生理及遗传变异。压力效应使组织变形、破 裂，引起牛理及遗传变异。激光的光束能量极高，具有较大的光压。而且热效心也会 引起强大的次生冲击波压力，再加上其热效应作用可以使细胞染色体结构畸变。激光 的电磁场效应主要在于激光能激发分子，产生自由皋，产生的自山基导致d n a 损伤， 引起突变。自山基是作用核酸引起变异的重要因素，通过自山基的直接或阳j 接作用， 导致碱基损伤、或糖基损伤、链的断裂、以及嘧啶二聚体的形成和核酸及蛋白质的交 联等损伤，引起生物分子的生理及遗传变异。 作为种新的诱变源，激光以其高亮度、高方向性、高相干性以及单色性，在微 生物育种领域已得到广泛应用，而且不同种类的激光辐照微牛物，所表现出的细胞学 和遗传学变化也不同，这也给微生物诱变育种提供了便利条件。 赵小立等【l9 从产果胶酶的黑曲霉菌中分离出一支产酸性蛋白酶等多种水解酶的 菌株n o 3 号，经铜蒸汽激光诱变，选育出一支高产复合酶的菌株h d 1 ，该菌在简单 的固体发酵培养基上，2 8 培养4 8 h ，酶活力平均提高3 8 8 6 ，最高达7 8 6 ，经多 次连续传代和贮存一年后，产酶性状稳定。彭益强等【2 0 】用1 0 6 u m ，1 5 k h z 高重复率 声光调q n d ：y a g 激光以2 0 w 和1 5 w 的功率对产植酸酶的黑曲霉孢子液和原生质体 液分别辐照不同时间，筛选到了株酶活力提高达3 7 5 倍的变异菌株。 1 2 2 1 3 微波 微波即指频率为3 0 0 m h z 3 0 0 g h z 的超高频电磁波。微波用于微生物诱变育种 并取得效果的文献报道较少，且处于探索性阶段。 倾i 。论文复台物理场肘微生物的诱变作用 微波的生物效心具有热效应和非热效应【2 “。微波的热效应卡要是由丁：生物体或组 织中的水分予和蛋门质分子，在受到微波照射时，在o l “ ) i l l 交变电磁场的作1 j 下会随外 场的频率而转动，转动过秤中同相邻分子的摩擦而，“+ 尘热能。微波的1 f 热效应指生物 体受到低功率的微波照射时，在不引起生物温度明显升高的情况下所出现的生理、病 理反应。非热效应目前在机理上尚未得到完整的解析和理论，有以下几种典型的解释： ( 1 ) 微波是一种电磁波，其交变电场对微生物细胞内d n a 等极性分子的洛仑兹力作j l j ， 强迫其按照电磁场作用的方式运动，从而引起d n a 分了点突变，产生遗传变异，这 町能是最主要的。( 2 ) 微波极强的穿透效应使细胞内外水分子同时产生剧烈转动，从 而引起细胞壁通透性发生变化，使胞内代谢物更容易分泌出来。( 3 ) 2 4 5 0 m h z 微波能 使水分子在1 s 内1 8 0 0 来回转动2 4 5 亿多次，强烈的转动摩擦使得胞内d n a 分子氢 键和碱基堆集力受损，最终引起d n a 分子结构变化导致遗传变异。 李永泉 2 2 】对黑m 霉小聚糖酶生产菌进行微波诱变处理，结果选育到一株产量较高 的生产菌a n i g e r h d 一3 ，6 ，发酵单位从1 5 0 0 0 u t m l 提高到2 1 5 0 0 u m l ( 提高了4 3 3 ) 。 所选育的菌株经多次传代，遗传性状十分稳定。周建琴等【2 ”用微波埘免疫抑制剂康乐 霉素c 的产生菌进行了菌种诱变，研究了微波处理条件、照射时间及剂量，选育到 一株变异菌株，其康乐霉素c 生产能力比出发菌株提高了1 8 0 。 微波在生物学上丰要用于杀菌、刺激植物种子发芽生氏等，而用于微生物诱变育 种的研究报道较少。此项研究具有清洁、高效、操作简单、方法易行等特点，在微生 物菌种选育中具有较大的推f “价值，也有待十更深入的研究。 1 2 2 1 4 电磁场 电子技术的飞速发展使人类和其它生物体受电磁场环境的影响显著增多。人们刈 电磁场产生的影响，特别是电磁场的安全性更加关注，国内外学者刘电磁场的生物学 效应【2 4 、”1 ( 主要是人和其它哺乳动物) 的研究r 1 益广泛和深入。但足，关于电磁场对 微牛物影响的研究鲜见报导。 天于电磁场对生物体的诱变机理也没有形成一致的解释，主要认为可能是电磁波 的电磁效_ i 娅和热效应。并且对磁场的研究多集中在磁场对其他诱变因素所引起的 d n a 损伤的修复方面( 包括医疗方面的磁场治疗作用咆丰要集中往t l - 痛j 、镇静等方 面) 。一般认为，磁场处理对微生物遗传物质的复制有重要影h i j j t 2 6 】，并且磁场处理可 以提高溶液的渗透压或渗透能力。当微生物经过诱变处理而使其d n a 结构发生变化， 在修复其受损的d n a 时如果不是在自然环境中进行的，也就是说将受损伤的微生物 的生长环境改变( o n 放在磁场e 1 1 ) ，其修复过程必将改变，修复的结果就会发生变化， 这样就有利于产生变异菌株，从而有利于选育出新的微生物菌种。刘字鹏等 2 7 1 用诺卡 氏菌h d 9 6 1 l 经紫外线诱变处理后在磁场条件下进行培养，其诱变致死率和营养缺陷 型的诱发率均比诱变后在自然条件卜培养的要高，并且经u v 与磁场复合诱变所筛选 f 域1 。论义 复台物理场对微生物的诱变作用 m 的菌株酶活力也比单纯紫外线处理的划照芮株平均酶活力高1 7 2 。 1 2 2 1 5 z 射线及丫射线等 x 射线和y 射线都是高能电磁波，具有很强的穿透能力，只要强度适当可以使生 物分子发生电离，从而使生物体遭受破坏性损伤，直接或间接地改变d n a 结构【2 ”。 其直接效应足脱氧核酸的碱基发生氧化，或脱氧核糖的化学键和糖一磷酸相连接的化 学健，d n a 的单链或双链键断裂。间接效应是电离辐射使水或有机分子产牛白l l i 基， 这些白山基与细胞中的浴质分子起作用，发生化学变化，作用于d n a 分子而引起缺 失和损伤。此外，电离辐射还能引起染色体畸变，发生染色体断裂，形成染色体结构 的缺失、易位和倒位等。 李文革等采用6 0 c o y 射线对柠檬酸产生菌黑曲霉c 0 9 6 进行辐射，两次处理 后选育出l 1 2 1 7 和l 8 0 1 两株优良柠檬酸产生菌。中试结果表明菌株l 1 2 1 7 较l 8 0 1 更优：产酸率较菌株c 0 9 6 提高了1 7 6 、对糖转化率提高了1 3 3 ，日发酵周期缩 短了1 3 4 。 1 2 2 1 6 低能离子注入 离子注入是2 0 世纪8 0 年代初我国首创的一项高新技术，注入离子具有高f 能线 密度( l e t ) 、尖锐的电离蜂( b r a g g 峰) 及低氧增比，并可精确控制入射深度和部位，经 加速后的离子具有一定的静止质量，注入生物体后，质量、能量和电荷共同作用丁- 生 物体，刁i 同的质量数、电荷数和能量又可以根据需要进行组合，因此，离予注入生物 体后质、能、电的联合作用比其它电离辐射对生物体的作用内容更为丰富和复杂。特 别值得指出的是，离子注入与牛物体相互作用存在峰值，在峰值范围内，注入离了与 生物体的相互作用是局部的、多重的和不易修复的。因此，离子注入用于诱变育种有 可能在损伤轻的情况卜获得较高的突变率和较宽的突变谱。在离子注入过程中，+ 物 分子将吸收能量，经历着复杂的物理、化学变化，这些变化的中问体是各类闩由摹， 所产生的活性自山基能引起其它正常生物分子的损伤，可使细胞的染色体畸变，d n a 链发生断裂，也可使质粒d n a 发生断裂【3 0 、” 。 1 2 2 2 化学诱变剂 在微生物诱变中，有诱变作用的化学物质很多，主要有烷化剂、亚硝基胍、硫酸 二乙酯、氮芥盐酸盐、5 一溴脲嘧啶等，这些化学诱变剂刘细胞都具有强烈的毒性，一 般不能被微生物所利用，作用后使微生物发生变异而起到诱变育种的作用。化学诱变 剂往往具有专一性，一种诱变剂对基因的某部位发生作用，对其余部位则影响很少。 由于突变多为基因突变，并且主要是碱基的改变，其中尤以转换为多数，冈此各种具 有诱发作用的化学物质和碱基接触时能起化学反应，然后通过d n a 的复制使碱基发 生改变。化学诱变剂对d n a 分予的这种特异效应，不仅有利于控制诱变育种，并且 可以用于揭示突变过程遗传物质的变化及研究诱变与致癌的关系【1 “。 倾i 。论文复合物理场对微牛物的涛变作用 化学涛变剂存微生物育种中的应用较多，有的诱变效果也较为弹想。仙凶其对人 体的致畸致癌作用，实际应用中也受到一定的限制。 1 2 2 3 复合冈子诱变 复合凼子处理是指两种或两种以卜的诱变因了诱发菌体突变。各种诱变因子的作 用机制不一样，主要是d n a 分子上的不同基因位点对各种诱变剂吸收阈值有较人差 异，即不同两变剂对基因作用位点有一定的专一性，有的甚至具有特异性，刚此多因 子复合处理，可以取长补短，动摇d n a 分予上多种基因的遗传稳定性，能导致较大 的突变，得到更多的突变类型。复合凶子诱变包括以下几种处理方式：两种或多种 诱变剂先后使用；同一诱变剂的重复使用；两种或多种诱变剂同时使用。现在诱 变育利，巾广泛使用复合处理，根据不同实验目的而使用不同的处理方式。普遍认为， 复合诱变具有协同效应，如果两种或两种以上诱变剂合理搭配使用，诱变效果要比单 一诱变效果好 1 卅。在具体使用时应注意诱变剂处理的先后和协同效应| u j 题，对1 i 同 的菌种，在诱变前应作预备实验或参考前人的经验米决定。 李乃强等( 33 对一株宇佐美曲霉进行紫外、微波的逐级诱变，使酸性蛋门酶产量从 2 8 0 0 u m l 提高到7 2 0 0 u m l ，突变株传代多次，广：酶性能保持稳定；对突变株1 j 出 发株的发酵过程进行比较研究，发现突变株最大产酶时问提前1 0 h 。李永泉等 3 4 】采用 激光和微波两种物理因了，对去甲基金霉素生产菌一金霉素链霉菌进行诱变处理，选 育到一株产量提高了6 5 4 的突变株。 复合因子较单一因子诱变效果有很大优势。但因目前大多微生物尤其是抗生素产 生菌的遗传背景不清楚，往往对诱变剂，特别是复合诱变剂的选择使用，带有很大的 盲目性。 1 2 3 杂交育种 杂交育 r p ( h y b r i d i z a t i o nb r e e d i n g ) - - 般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准 性生殖，或原核微生物的接合、f 因子转导、转导和转化等过程，促使两个具有不同 遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。这也是一类重要的微生 物育种手段，比起诱变育种，它具有更强的方向性和目的性。 1 2 4 原生质体融合 原生质体融合是通过人i ：方法，使遗传性状不同的两个细胞的原牛质体发生融 合，并产生重组子的过程，亦称为”细胞融合”( c e l lf u s i o n ) 。原生质体融合技术是在1 9 7 6 年发展起来的一种育种技术。应用原生质体融合技术后，细胞间基因重组的频；簪大大 提高，在某些例子中，原生质体的重组频率已大于1 0 1 ( 而诱变育种一般仅为l o 8 ) 。 原生质体融合技术具有以下优点：去除了细胞壁的障碍，亲株基冈组直接融合、交 流，实现重组，h i 需要有已知的遗传系统。原生质体融合后两亲株的基凶组之i = l j 有 机会发生多次交换，产生各种各样的基冈组合而得到多种类型的重组子。重组频率 顺1 论文复含物耻场对微生物的西变作川 特别高。 由于以上优点利用原生质体融合来培育工业新菌株己受到困内外重视，并在一些 研究中有所突破。如令，能借助原生质体融合技术进行基冈重组的细胞极其“泛，包 括原核微生物、真核微生物以及动植物和人体的细胞。发生基因重组亲本的选择范围 也更大了，原来的杂交技术般只能在同种微牛物之间进行，而原生质体融合可以在 不同种、属、科，甚至更远缘的微生物之间进行，这为利用基因重纽技术培育更多、 更优良的生产菌种提供了可能。但微生物原生质体融合技术用于菌种选育仍属于一利t 半理化筛选，冈为尽管所采用的两亲株的特性足已知的，但他们基因组的交换、重组 是非定向的 i - - 4 。 1 2 5 基因重组育种 基因重组育种是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质d n a 分了提取 出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的d n a 分子连接起来，然后导入某一 受体细胞中，让外来的遗传物质在其巾进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一 种崭新的育种技术。2 0 世纪7 0 年代出现的基因重组技术给微生物育种带来了革命， 它不同于传统的育种方法，所创造的新物种是自然演化中不可能发牛的组合，这是一 利咱觉的、能像工程一样事先设计和控制的育种技术，可以完成超远缘杂交，是最新 最有日u 途的育种方法。虽然基凼重组的操作有着非常强的方向性，但是，最终获得的 并非是f 1 标重组体的纯培养物，冈为还有许多其它的细胞存在，如：日标基因u 。能没 有被重组、重组的目标基凼可能是反向的、重组d n a 无法稳定存在于受体细胞叶l 等。 所以，筛选仍然是基因工程育种工作中的重要内容【l “。 綦因重组育种在国内外都有着较为广泛的应用，但仍存在着很大的局限性，冈为 基因重组的实施首先需要对生物的基因结构、序列和功能有充足的认谚 ，而目f i 口x , j 基 因的了解还十分有限，蛋白质以外的发酵产物( 如糖类、有机酸、核苷酸及次级代谢 产物) 产生往往受到多个基凶的控制，尤其是还有许多发酵产物的代谢途径还没有被 确证，所以对于这些产物，基因重组育种方法还难以完全取代传统的菌种选育方法。 但随着第三代基因工程( 途径工程) 技术的问世，基因重组育种将会有新的突破。 1 3 孬变育种的步骤【3 i 诱变育种具有方法简单、投资少、收获人等优点，但缺乏定向性，因此，诱变育 种过程中必须注意山发菌株、诱变剂及诱变剂量的选择，诱变处理方式的应用，以及 选择有效的筛选方法，以弥补不足，提高诱变育种的效率。 1 3 1 出发菌株的选择 出发菌株的选择是决定诱变效果的重要环节，用来进行诱变的出发菌株的性f l g x , j 提高诱变效果和育种效率有着极为重要的意义，选择时应注意以卜几点：诱变山发 菌株的遗传f 牛状应当是纯的，并且比较稳定。应具有一定的目标产物的生物合成能 f i i ； i 论文复合物耻场对微牛物的诱变韵 力，使育种工作处丁较高的起点。对诱变剂敏感，易获得高产突变株。还应考虑 菌株的生产性能，如牛欧快、营养要求低、产孢子多且早、周期短等性状，且要尽量 符合育种所需要的牛物学和代谢的特性，最好为生产上自然选行的菌株。 1 3 2 出发菌株的纯化 确定出发茼株后，就需要进j ? 纯化，因为微生物容易发生自然突变和混杂，这些 都会造成细胞内遗传物质的不纯，使遗传性状不稳定。因此菌种选育前的出发两种需 要进行自然分离，即菌种纯化。通过自然分离，从单荫落中挑选到所需的遗传性状基 本一致的并j 二l 稳定的优良菌株。 纯种分离方法常有划线分离法和稀释分离法，这种方法一般只能达到荫落纯的水 平。有时还达不到育种的要求，就需要采用更精细的单细胞或单孢予分离方法，如用 “分离小室”进行单细胞分离，或用显微操纵器分离单细胞等，然后培养形成单菌落， 这样可以得到完全真实的纯菌株，分离得到的菌株可以达到细胞纯水平。 1 3 3 单孢子悬液的制备 菌悬液是直接供诱变处理的，它由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或缓冲 液制备而成，其质量将直接影响诱变效果。 进行诱变处理的菌悬液要求绌胞生理活性既要同步，又要处于最旺盛的对数期， 这样突变率高，重现性也好。菌悬液中的菌体应该是分散均匀的单细胞或单孢子，这 样有利于均匀地接触诱变剂。为了达到生理状态一致的目的，可采取调整生理条件或 分离细胞的方法实现同步 二氏，并在诱变前进行培养，保证细胞菌龄在对数生长期。 制备的细胞或孢子悬浮液，常用生理盐水调整霉菌孢子的浓度大约为1 0 6 个m l ，放 线菌或细菌的为1 0 6 1 0 8 个m l 为宜。如果用化学诱变剂处理时，心采用相应的缓冲 液配制，以防处理过程中p h 值变化而影响诱变效果。 1 3 4 诱变剂及诱变剂量 诱变剂的选择首先决定于诱变剂对基因作用的特异性，同时也决定于出发菌株的 特性。首先根据羼变剂的作用机理，再结合菌种特性和遗传稳定性束考虑选用何种诱 变剂进行诱变。对遗传性状稳定的，常采用以往未使用过的、突变谱较宽的、诱变率 高的强诱变剂进行复合处理，使d n a 结构发生f “重损伤，造成大的变异，继后采用 1 些缓和的诱变剂处理。划遗传性状不稳定的常采用缓和诱变剂或对该类菌在诱变史 上曾经是有效的诱变剂进行处理，使d n a 结构发生微小损伤，从中筛选突变体，并 结合自然分离和环境的改变使有效地菌落类型不断增加，成为f 常型菌落。 不同的微生物对同种诱变削敏感性有很大的区别，这不仅是细胞通透性的差 异，也与诱变剂进入细胞后相瓦问作用不一致有关，诱变效果也不一样。凶此诱变育 种无法做到在诱变：j ：作巾采用某利一诱变剂来达到定向改变某一性状的目的，所以要成 功的选育具有某种特性的菌种，常通过事先做预备实验来选择最佳的诱变剂。 硕f 论史复台物胖场对微生物的诱变作用 诱变的最适剂量应该是所希望得到的突变株在存活群体中占有最人比例，这样可 以减少以后的筛选工作量。由_ j 二各种微生物阳j 遗传特性的差异，小同微生物或同一微 生物的各个菌株对同一诱变剂的最适剂量是有筹别的。诱变剂量的大小常以致死率和 变异率来确定，一般认为处理剂量人，杀菌率高( 9 0 9 9 ) ，在单位存活细胞中负 变菌株多，正变菌株少，但可能筛选到产量提高幅度大的突变株；而用小剂量进行诱 变处理时，杀菌率低( 5 0 8 0 ) ，在单位存活细胞中j 下变菌株多，但产量提高幅度大 的突变株较少。诱变剂剂量的选择是个复杂的问题，不单纯是剂量与变异率间的关系， 而是涉及到很多冈素，需要根据实际情况具体分析，在实践中加以确定。 1 3 5 诱变处理的方法 诱变处理的方法有译一诱变剂处理和复合处理。散来说，复合处理要比竹一处 理的效果好。但当一种诱变剂对某个菌株确实是有效的诱变凶子，那单凶子诱变处理 的效果也同样不错。同时，币一诱变剂处理，还可以减少菌种遗传背景复杂化、菌落 类型分化过多的缺点，使筛选： 作趋于简化。 复合因子处理可以取长补短能导致较大的突变，容易获得产量提高幅度较大的突 变株。在具体使用复合因子处理时应注意诱变剂处理的先后和协同效应问题，对) i 同 的菌种，在诱变前应作预备实验或参考前人的经验来决定。 1 4 突变株的筛选与分离【3 l 经诱变处理后，存活细胞中只有少量的细胞发生了突变，而能使生产性状提高的 细胞又只是突变细胞中的极少数，要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就像是人 海捞针，工作量很大。对菌株的产量性能来说，高产突变株和负突变株都能在同培 养基l 生长，在菌落形态上也几乎没有明显差异，难以采用选择性培养基进行筛选， 因此简洁而有效的筛选方法无疑是育；f 十- i l 作成功的关键。 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选i ：作分为初筛和复筛两步进行。 初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下 来，使优良的茼种不致漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次，初 筛的手段应尽可能快速、简单，绝大部分采用平板筛选法。复筛的目的是确认符合生 产要求的菌株，所以，复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标，多通过连续 发酵培养筛选出高产突变株。 1 4 1 般变异菌的筛选方法 在诱变育种初筛中，常根据特定代谢产物的特性，在琼脂平板上设计许多筛选方 法和活性半h 测方法，大量菌落通过平板初筛可保留5 1 0 的菌株供复筛。j 卜板筛选 种类很多，有的根据菌落形态淘汰低产菌株，有的利用菌落产生的代谢产物弓培养基 中底物或指示性物质作用后，在其周围形成水解圈或其他特异性反应圈，通过测晕反 应圈直径与菌落直径之比来衡量突变株产量的高低。常用的筛选方法有以下儿种： 坝l 沦殳复物理场对微生物的畴娈作用 ( 1 ) 从菌体形态变异分析：有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存存着一定 的相关性，这就能很容易地将变异菌株挑选出来。尽管相当多的突变菌株并1 i 存在这 种相关性，但是在筛选j ：作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然， 这种罄别方法具有很人的随机性，只能用于初筛。 ( 2 ) 平阻快速检测法：平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板l ：的生 理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的”形态”变化。具体的有纸j l 培 养显色浊、变色圈法、透明幽法、牛长圈法s u 4 q j , | i 0 罔法等。这些方法较卡h 放，一般只 能定性或半定量用，常用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于 培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很人的差 别，有时会造成两者的结果不一致。平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散， 形成单茼落，以避免多菌落混杂起，引起”形态”大小测定的偏筹。 ( 3 ) 摇瓶培养法：摇瓶培养法是将待测菌株的单葡落分别接种到摇瓶培养液。h 振荡培养后，对培养液进行分析测定。摇瓶l j 发酵罐的条件较为接近，所测得的数据 更有实际意义。但是摇瓶培养法需要较多的劳力、设备和时间，所以，摇瓶培养法常 用于复筛。但若某些突变性状无法用简便的形念观察或平吼快速检测法等方法检测 时，摇瓶培养法也町用于初筛。初筛的摇瓶培养一般是个菌株只做一次发酵测定， 从大量菌株中选出1 0 2 0 较好的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3 瓶，选出3 5 个较好的菌株，再作进一步比较，选山最佳的菌株。 1 4 2 特殊变异菌的筛选方法 上述菌株筛选力。法的处理量仍然很大，为了从大量的细胞巾筛选出几株高产菌 株，要进行大量的稀释分离、摇瓶和测定工作。虽然甲川l 陕速检测法作为初筛手段可 减少摇瓶和测定的工作量，但稀释分离的亡作仍然非常繁重。而有些高产变异菌株的 频率很低，在几 可个单细胞中并不一定能筛选到，所以，建市特殊的筛选方法是极其 重要的。例如营养缺陷型和抗性突变菌株的筛选有它们的特殊性，营养缺陷型或抗性 突变的性状就象一个高效分离的”筛子”，以它为筛选的条件，可以大大加伙筛选的进 程并有效地防止漏筛。在现代的育种中，常有意以它们作为遗传标记选择亲本或在 d n a 巾设置含这些遗传标记的片段，使菌种筛选工作更具方向性和预见性。 ( i ) 营养缺陷型突变株的筛选：经诱变处理后的菌悬液在筛选前一般应先进行诱 变后培养，以促使变异细胞发生分离，防止出现袁型延迟现象，筛选出不纯的菌株。 营养缺陷型的筛选一般包括浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。浓缩是为了 淘汰大量的野生型，提高营养缺陷型的浓度。常用的浓缩方法有抗生素法、菌丝过滤 法、差别杀菌法和饥饿法等。浓缩后的菌液中营养缺陷型的比例较大，但并非全部都 足，并且营养缺陷型巾也有不同的类型，还需要进步检出所需要的营养缺陷型。这 样就需要采用逐个检出法、夹层培养法和限量补给法等方法进一步检出所需要的营养 坝1 论文复合物理场剥微牛物的诱堂作j 缺陷喇。获得的营养缺| j f 型菌株还应进一步确认其牛i 吏的所需物。菌株较少时叮h 牛 氏谱法，若菌株较多时，常采用组合补充培养皋法。 ( 2 ) 抗性突变菌株的筛选抗性突变株的筛选相刈比较容易，只要有1 0 。6 频率的 突变体存在，就容易筛选出来。抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛 选法两种手段。次性筛选法就是指在对出发菌株完仝致死的环境中， 。次。陀筛选出 少量抗性变异株。但是在相当多的情况卜| ，无法知道微生物究竟能俐受多高浓度的药 物，这时，药物抗性突变株的筛选就需要应用阶梯性筛选法。经过由低到高的”驯化” 或诱变处理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。阶梯筛选法h 梯度甲板或纸片扩 散在培养皿的空问中造成药物的浓度梯度，可以筛选到耐药浓度不等晌抗性变异菌 株，使暂时耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗漏，所以说，阶梯性筛选法 较适合于药物抗性菌株的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以接受的药物浓度情 况f 。 ( 3 ) 组成酶变异株的筛选：许多水解酶是诱导酶，只有在含有底物或底物类似物 的培养环境中，微生物才会合成这些酶类，所以，诱导酶的生产不仅需要诱导物，而 且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。能迅速利用的碳源( 如葡萄糖) 往 往会引起酶合成的减少，诱导物有时又比较昂贵。这些都可能造成这些水解酶工业生 产的波动以及生产成本提高。如果控制这些酶合成的调节基因发生了变异，诱导酶就 可能转变成组成酶，它的合成与细胞的其它组织蛋门一样，不再需要诱导物的存在。 山诱导型的出发菌株诱变筛选出组成型变异株对于水解酶的丁业生产具有重要的现 实意义。具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法。 1 5 本论文研究的主要内容 纤维素的高效降解利用和生物表面活性剂均是当前国内外生物技术领域的 研究热点，具有非常重要的实用价值。现在纤维素酶应用已扩展到医药、纺织、 同用化工及饲料等各个领域，其应用前景十分广阔。专家预测针对扮演绿色化学品的