基质金属蛋白酶9与2型糖尿病患者合并结核杆菌感染的关系.pdf

目 录 中文摘要-1 英文摘要-2 主要缩略语中英文索引-4 正文 前言-5 第一部分 前言-7 材料与方法-7 结果-14 第二部分 前言-18 材料与方法-18 结果-20 讨论-22 结论-25 参考文献-26 附录-31 综述-34 发表论文-46 致谢-47 1 基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶9与与2型糖尿病患者型糖尿病患者合并合并结核杆菌结核杆菌感染感染的的关系关系 中文摘要中文摘要 目的目的：探讨基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，mmp-9）与 2 型糖尿病患者合并结核杆菌感染的关系。 对象和对象和方法方法：选择 2004 年 6 月至 8 月确诊的 154 例无并发症的 2 型糖尿 病患者为研究对象， 无菌采集他们的血清， 采用半定量明胶酶谱法 （zymography） 以及 western-blot 检测所有患者血清 mmp-9 的表达水平，按其表达水平分为 mmp-9 低表达组和高表达组， 采用流行病学前瞻性列队研究方法追踪随访 5 年， 比较两组患者感染结核杆菌及慢性并发症的情况，计算相对危险度。另外，从 2008 年 1 月至 10 月采集 76 例合并结核杆菌感染的 2 型糖尿病患者以及 89 例无 并发症的 2 型糖尿病患者的血清，采用上述方法检测 mmp-9 表达水平，并进行 比较。 结果结果：列队研究的研究结果显示，5 年失访 6 人，其中 mmp-9 低表达组失 访 2 人，mmp-9 高表达组失访 4 人。mmp-9 低表达组 5 年内感染结核杆菌 11 人，5 年感染率为 13.9 %（11/79），mmp-9 高表达组感染结核杆菌 23 人，5 年 感染率为 33.3%（23/69），相对危险度为 2.4。两组结核杆菌感染率具有显著性 差异（p0.05）。同时，mmp-9 高表达组心脑血管疾病、肾病等并发症发生率 显著高于 mmp-9 低表达组（p0.05）。mmp-9 在合并结核杆菌感染的 2 型糖 尿病患者和无并发症的 2 型糖尿病患者中都有表达，而且前者的 mmp-9 表达水 平显著高于后者（p0.05）。 结论结论：1、2 型糖尿病患者存在不同的 mmp-9 表达水平；2、mmp-9 高表 达的 2 型糖尿病患者更容易发生结核杆菌感染及发生慢性并发症。 关键词关键词：基质金属蛋白酶 9；2 型糖尿病；结核杆菌；队列研究 2 the relationship between matrix metalloproteinase 9 and type 2 diabetes mellitus patients infected with tubercle bacillus abstract objective: to investigate the relationship between matrix metalloproteinase 9(mmp-9) and type 2 diabetes mellitus(t2dm) patients infected with tubercle bacillus(tb). subjects and methods: 154 t2dm patients without complications were recruited from june to august in 2004. their serum was collected aseptically, and the expression of mmp-9 in serum was detected with semi-quantitative zymography and western-blot. all patients were divided into two groups according to the expression of mmp-9: low expression group and over expression group. we followed up them 5 years by prospective study, then compared the infection rate of tb and incidence of other complications, and calculated the relative risk (rr). meanwhile, we collected the serum of 76 t2dm patients infected with tb and 89 t2dm patients without complications from january to october in 2008, tested the expression of mmp-9 with the same methods, and compared the expression difference of mmp-9. results：the results of cohort study showed that six subjects were lost to follow up, two in the low expression group and 4 in the over expression group. there were 11 patients infected with tb in the low expression group in five years and the infection rate was 13.9 %（11/79）. there were 23 patients infected with tb in the over expression group in five years and the infection rate of low group in five years was 33.3%（23/69）, significantly higher than that of the low expression group (p0.05). the rr is 2.4. meanwhile, the incidence of other complication such as cardiac and cerebral vascular diseases, nephrotic complication in the over expression group was higher than that in the low expression group (p0.05). the expression of mmp-9 3 was detected in the serum of t2dm patients infected with tb and simple t2dm patients. and the expression level of mmp-9 in t2dm patients infected with tb was significantly higher than that of in simple t2dm (p0.05). conclusion: the expression of mmp-9 in t2dm patients was different. t2dm patients with high levels of mmp-9 are prone to be infected tubercle bacillus and suffer chronic complications. key words: matrix metalloproteinase 9(mmp-9); type 2 diabetes mellitus(t2dm); tubercle bacillus (tb); cohort study 4 主要缩略语主要缩略语中中英文索引英文索引 缩略词缩略词 全全 称称 中中 文文 名名 称称 mmp-9 matrix metalloproteinase 9 基质金属蛋白酶9 tb tubercle bacillus 结核杆菌 t2dm type 2 diabetes mellitus 2 型糖尿病 rr relative risk 相对危险度 pbs phosophate-buffered saline 磷酸盐缓冲液 od optical density 光密度 rpm revolutions per minute 每分钟转数 ddt dl-dithiothreitol 二硫苏糖醇 dna deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 bp base pairs 碱基对 ecm extracellular matrix 细胞外基质 5 基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶9与与2型糖尿病患者型糖尿病患者合并合并结核杆菌感染的关系结核杆菌感染的关系 前前 言言 基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，mmps）属于金属蛋白酶类，由 于能消化细胞外基质（extracellular matrix，ecm）而得名1-4。mmps 最早在肿 瘤组织中发现5-7，后来发现它在炎症8、多发性硬化病9、心脑血管疾病10-12、 自体免疫性疾病13、新生血管形成14以及肿瘤浸润和转移中15-18起重要作用。 迄今为止发现的28个mmps家族成员具有一定的基因相似性19,20， 大多数mmps 的一个重要作用是参与结缔组织的重建21。 许多研究表明，机体感染细菌后，mmps 表达上调。目前，导致体内 mmps 表达增高的细菌主要为革兰氏阴性菌，如鼠伤寒沙门氏菌22,23、小肠结肠炎耶尔 森菌24、大肠杆菌25、幽门螺杆菌26、绿脓杆菌27和泌尿生殖道衣原体28。 另有研究已经证实，在结核性脑膜炎、结核性胸膜炎以及肺结核患者的血液 中检测到 mmp-9 的表达水平升高， 而且， mmp-9 在肺结核的发展和临床表现中 起主导作用29-31。最新的研究表明，人 mmp-9 基因启动子 1562c/c 基因型与 肺内结核杆菌的传播有关32。但是，mmp-9 的表达水平增高是否是结核杆菌感 染的病因还有待进一步研究！ 糖尿病是一种常见的代谢性疾病，它的危害除了糖尿病本身，更严重的是随 着疾病的发展而发生的糖尿病并发症33，其中，糖尿病合并肺结核比较常见34。 目前， 全球范围内糖尿病并发肺结核病的发病率和患病率均呈逐年上升趋势，糖 尿病患者并发肺结核病的发病率和患病率是普通人群的 3 至 6 倍35。由于糖尿 病患者体内脂肪代谢障碍、肝脏糖原减少、血糖与组织内糖量增高，有利于结核 杆菌的繁殖36。而结核病也是慢性消耗性疾病，它的中毒症状和对身体的消耗 使胰腺的内分泌功能下降，加重了糖尿病的代谢紊乱37。 然而， 是什么原因导致糖尿病患者容易合并结核杆菌感染？其机理目前还不 清楚。目前已经在结核性脑膜炎、结核性胸膜炎以及肺结核患者的组织中发现 mmp-9 的表达升高，而且，mmp-9 在肺结核的发展和临床表现中起主导作用。 为探讨 mmp-9 与糖尿病患者感染结核杆菌的关系，本研究选择无并发症的 2 型 糖尿病患者为研究队列，在入组时检测他们血清中 mmp-9 的表达水平，根据表 达水平将研究对象分为 mmp-9 高表达组和低表达组，随访观察 5 年内两组并发 6 结核杆菌感染的人数，计算并比较两组结核杆菌感染率。同时，再横断面调查 2 型糖尿病合并结核杆菌感染者和无并发症的 2 型糖尿病患者的 mmp-9 表达水 平，并进行比较。 7 第一部分第一部分 无并发症的无并发症的 2 型糖尿病患者型糖尿病患者 mmp-9 表达水平表达水平 与与结核杆菌感染结核杆菌感染关系关系 前言前言 mmp-9 属于型胶原酶或明胶酶类，可降解基底膜型胶原和变性的间质 胶原（明胶）。型胶原酶主要有两种形式，一种被糖化，分子量为 92kd，命 名为 mmp-9，另一种非糖化，分子量为 72kd，被称为 mmp-2。目前有一种非 常成熟而且简单易行的方法明胶酶谱法（zymography）可以同时检测 mmp-2 和 mmp-9 的表达。 本部分研究采用半定量 zymography 和 western-blot 同时检测 mmp-9 在 2 型糖尿病患者血清中的表达，根据其表达水平的高低将他们分成 mmp-9 高表达 组和低表达组，采用流行病学前瞻性队列研究的方法研究 mmp-9 与 2 型糖尿病 患者合并结核杆菌感染的关系。 1、实验材料、实验材料 1.1 研究对象研究对象及标本采集及标本采集 以 2004 年 6 月至 8 月在湖南省衡阳市南华附二医院确诊的 154 例无并发症 的 2 型糖尿病患者为研究对象， 所有患者符合 who1999 年 2 型糖尿病的诊断及 分型标准。 其中男性 89 例， 平均年龄 45.7 3.7 岁， 女性 65 例， 平均年龄 46.1 3.9 岁， 所有研究对象平均年龄 45.9 3.8 岁， 男性、 女性年龄比较没有统计学差异 （p 0.05）。所有研究对象排除糖尿病各种急慢性并发症、感染、肝肾疾病、心、 脑、肺部疾病等。结核病采用 1999 年中华医学会结核分会的诊断及分型标准。 无菌采集每个研究对象 5ml 血液，室温放置 30min，1000rpm，离心 15min 分离血清，-70保存备用。 1.2 主要试剂主要试剂及配方及配方 1.2.1 主要试剂主要试剂 瓷珠 beads（gelatin sepharose tm 48）购自 ge healthcare 公司（美国）。 羊抗人 mmp-9 一抗，兔抗羊二抗购自 santa cruz biotechnology 公司（美国）。 丙烯酰胺（30%acrylamide/bis solution，29：1（3.3% c） ）购自 bio-rad 公司（美 8 国）。 蛋白质浓度测定液 （protein assay dye regeant concentaste） bio-rad 公司 （美国） 。 mmp-9 标准品购自 sigma 公司（美国）。 蛋白质浓度测定标准品购自 sigma 公司（美国）。 aps 购自 sigma 公司（美国）。 gelatin 购自 sigma 公司（美国）。 temed 购自 bio-rad 公司（美国）。 蛋白质 marke bio-rad 公司（美国）。 溴酚蓝染料购自 sigma 公司（美国） 。 triton x-100 购自 bio-rad 公司（美国）。 pbs 购自 gibco 公司（美国） 。 dmso 购自 emd 公司（法国） 。 ddt（dl-dithiothreitol solution）购自 sigma 公司（美国）。 sds 购自 bio-rad 公司（美国）。 tris-hcl 购自 bio-rad 公司（美国）。 甲醇、乙醇、醋酸等购自公司 硝酸纤维素膜（pvdf）bio-rad 公司（美国）。 1.2.2 主要配方主要配方 10 lscb： 0.5 m tris ph 7.6 2.0 m nacl 0.05 m cacl2 0.2% (w/v) brij-35 tbst： 900ml h2o 100ml 10 tbs 0.5ml tween 10 电泳缓冲液电泳缓冲液（runing buffer） （1l） ： 30.3 g trizma base (= 0.25 m) 144 g glycine (= 1.92 m) 10 g sds (= 1%) 最后加 h2o 至 1l 10 转膜液转膜液（transfer buffer） （1l） ： 30.3 g tris base 144.1 g glycine 阻断阻断 buffer： 500ml tbst milk 25g 9 脱色剂：脱色剂： 50ml 甲醇+50ml 醋酸+400ml 水 1.3 主要仪器设备主要仪器设备 生物安全柜 美国 baker 公司 co2细胞培养箱 美国 nbs 公司 恒压恒流电泳仪 美国 bio-rad 公司 蛋白浓度测定仪 molecular devices 德国 spectromax 公司 摄像仪及图像分析系统 日本 kodak mi application 电泳槽 美国 bio-rad 公司 离心机 5415d 德国 eppendorf 公司 ph 计 delta 320 瑞士 mettler toledo 公司 milli-q 超纯水系统 美国 millipore 公司 微量可调移液器 德国 eppendorf 公司 电子分析天平 ab204-n 瑞士 mettler toledo 公司 360转头（labquake） 美国 barnstead/thermolyne 公司 制冰机 美国 scotsman 公司 10 2、实验方法、实验方法 2.1 血清中血清中 mmp-9 的提取的提取 1）按每个样品取 50l beads，8000rpm，4离心 2min，弃上清； 2）加入等体积的 pbs，8000rpm，4，离心 2min，弃上清；重复 3 次； 3）每个样品取 100l 血清，加入 50l beads，4，倒转旋转 1h； 4） 8000rpm， 4， 离心 5min， 弃上清， 尽量弃干净上清， 但不要吸到 beads； 5）加入含 10%dmso 的 pbs 50l，轻轻混匀，立即置于 4摇床，缓慢摇 匀 30min； 6）8000rpm，4，离心 10min，吸上清置于干净的 ep 管中； 7）尽量立即使用，否则置于-80保存。 2.2 血清总血清总蛋白浓度测定蛋白浓度测定 1）蛋白浓度测定液与去离子水 1：4 混合； 2）96 孔板中按样品数多少每个样品孔中加入 100l 混合液；另外 1 个空白 对照和 4 个标准品的孔中也加入 100l 混合液； 3）每个孔中对应加入标准品或样品 1l，空白对照不加任何东西； 4）放入仪器中读数，设光波为 595nm； 5）仪器自动计算标准曲线，根据标准曲线计算出样品浓度； 6）根据样品浓度，计算每个样品加入相同总蛋白的量所需要的血清体积。 2.3 zymography 及其半定量及其半定量测定测定 2.3.1 zymography 1）配制分离胶和堆积胶 分离胶（分离胶（8%） ：） ： 水 4.04ml 丙烯酰胺 2.66ml 1.5m tris ph 8.0 2.50ml gelatin (15mg/ml) 600l 11 10%sds 100l 10%aps 100l temed 5l 堆积胶：堆积胶： 水 2.98ml 丙烯酰胺 660l 0.5m tris ph 6.8 1260l 10%sds 50l 10%aps 50l temed 5l 2） 根据蛋白浓度测定结果取含有相同总蛋白量的血清， 加入 10l 上样 sds 点样； 3）电泳 150v，75min； 4）用去离子水清洗胶块 4 次； 5）2.5%triton-100 洗胶 20min； 6）1lscb 50l 中加入 2%n2na100l，混合后加入胶块； 7）37细胞培养箱内培养 48h； 8）70rpm，室温，染色 30min； 9）70rpm，室温，脱色 10min； 10）胶扫描成像。 2.3.2 zymography 半定量半定量测定法测定法 1）选定最大条带，并圈定； 2）复制固定大小的圈，圈定其它条带； 3）设置最小条带的值为 1，计算其它条带与之比值。 2.4 western-blot 及其半定量及其半定量测定测定 2.4.1 western-blot 1）配制分离胶和堆积胶 分离胶分离胶（8%） ：） ： 12 水 4.60ml 丙烯酰胺 2.70ml 1.5m tris ph 8.0 2.50ml 10%sds 100l 10%aps 100l temed 6l 堆积胶：堆积胶： 水 2.98ml 丙烯酰胺 660l 0.5m tris ph 6.8 1260l 10%sds 50l 10%aps 50l temed 5l 2） 根据蛋白浓度测定结果取含有相同总蛋白量的血清， 加入 10l 上样 sds 点样； 3）电泳 150v，75min； 4）转膜 300ma，75min； 5）tbst 洗膜，40rpm，室温，5min； 6）含 5%脱脂奶粉 tbst 阻断 1h； 7）一抗 1：500 稀释，4摇床过夜； 8）tbst 洗一抗，室温，40rpm，5min，3 次； 9）二抗 1：500 稀释，室温，40rpm，1h； 10）tbst 洗一抗，室温，40rpm，5min，3 次； 11）加等体积显色液 a、b，充分混合，胶扫描成像。 2.4.2 western-blot 半定量半定量测定测定 1）选定最大条带，并圈定； 2）复制固定大小的圈，圈定其它条带； 3）设置最小条带的值为 1，计算其它条带与之比值。 2.5 流行病学队列研究流行病学队列研究 13 2.5.1 队列定义队列定义 根据 zymography 和 western-blot 半定量结果，以 mmp-2 作为内部参照，根 据电泳条带的明暗度以及与 mmp-2 的灰度比值确定，mmp-9 高表达的条带亮， mmp-9 低表达的条带暗。mmp-9 高表达其与 mmp-2 的灰度比值显著高于 mmp-9 低表达。 按统计学显著性差异划分， 将研究对象分成 mmp-9 高表达组和 低表达组。 2.5.2 随访观察随访观察 从 2004 年 8 月 15 日开始，每 6 个月追踪访问每个研究对象 1 次， 详细询问 病史，体格检查，进行痰检、胸片、血沉、血糖、尿蛋白、肾功能、血脂、心电 图、心脏 b 超（有症状、体征时） 、头颅 ct 或 mri（有症状、体征时）等检查。 出现症状、体征，尿蛋白阳性或肾功能异常，排除其它原因所致肾功能损害，可 诊断糖尿病肾病；出现症状、体征，血压、心电图、心脏 b 超或头颅 ct、mri 异常，可诊断并发心脑血管疾病；出现症状、体征，胸片、血沉异常，痰检阳性， 可诊断并发结核杆菌感染。连续随访 5 年，直到 2009 年 8 月 14 日。 2.5.3 资料统计资料统计和统计学分析和统计学分析 将资料统计汇总成表 1-1 的形式。计算统计量。 表 1-1 不同 mmp-9 表达水平糖尿病患者 5 年 tb 感染率 tb 感染 无 tb 感染 合 计 mmp-9 高表达组 a b a+b mmp-9 低表达组 c d c+d 合 计 a+c b+d 23.84，p0.05，具有统计学意义；23.84，p0.05，无统计学意义。 mmp-9 低表达组的低表达组的 5 年年 tb 感染率：感染率： mmp-9 高表达组的高表达组的 5 年年 tb 感染率：感染率： 相对危险度：相对危险度： 统计学检验：统计学检验： 14 3、结、结 果果 3.1 蛋白浓度测定标准曲线蛋白浓度测定标准曲线及及血清总蛋白值血清总蛋白值 德国 spectromax 公司的专用蛋白浓度测定仪应用 softmaxpro 软件会自动 生成标准曲线，并给出标准曲线的的方程（图 1-1） ，本研究结果显示，标准曲线 的质量较好。根据标准曲线计算的每个研究对象血清总蛋白值相对恒定（附 1） 。 图 1-1 血清总蛋白测定标准曲线 3.2 zymography 检测结果检测结果 将所有研究对象按 8 个一起点样进行 zymography 检测 mmp-9 的表达，在 每一张胶上按 mmp-9 的表达水平将 8 个对象分为高表达者和低表达者 （图 1-2） ， 高表达组共计有 73 例， 低表达组共计 81 例， 它们 mmp-9 表达水平 zymography 半定量的统计分析结果见图 1-3。 15 图 1-2 154 例无并发症 2 型糖尿病患者 mmp-9 zymography 检测结果（显示部分） 注：图中显示 3、4、6、111、112、114、116 号为 mmp-9 高表达者，其他为低表达者 st 为 mmp-9 和 mmp-2 的标准品 图 1-3 2 型糖尿病患者 mmp-9 zymography 检测结果的直方图 注：与 mmp-9 低表达组比较，* p0.05 3.3 western-blot 检测结果检测结果 将所有研究对象按 8 个一起点样进行 western-blot 检测 mmp-9 的表达，其 检测结果与 zymography 检测结果一致，在 zymography 检测表达高的 3、4、6、 111、112、114、116 号患者其 western-blot 检测表达也高（图 1-4） 。高表达组和 低表达组 mmp-9 表达水平 western-blot 半定量统计分析结果见图 1-5。 图 1-4 154 例无并发症 2 型糖尿病患者 mmp-9western-blot 检测结果（显示部分） 注：图中显示 3、4、6、111、112、114、116 号为 mmp-9 高表达者，其他为低表达者 16 图 1-5 2 型糖尿病患者 mmp-9 western-blot 检测结果的直方图 注：与 mmp-9 低表达组比较，* p0.05 3.4 2 型糖尿病患者不同型糖尿病患者不同 mmp-9 表达表达水平的水平的 tb 感染率感染率 3.4.1 随访人数和失访人数统计随访人数和失访人数统计 5 年中因患者电话改变共计失访 6 人，其中低表达组失访 2 人，高表达组失 访 4 人（表 1-2） 。 表 1-2 154 例 2 型糖尿病患者 5 年随访人数统计 随访人数 失访人数 失访率(%) mmp-9 低表达组 79 2 2.47 mmp-9 高表达组 69 4 5.48 3.4.2 两组患者两组患者 tb 感染率感染率 mmp-9 低表达组 5 年内感染结核杆菌 11 人， 5 年感染率为 13.9 % （11/79） ， mmp-9 高表达组感染结核杆菌 23 人，5 年感染率为 33.3%（23/69），相对危险 度为 2.4，两组结核杆菌感染率比较具有显著性差异（p0.05）。结果见表 1-3。 表 1-3 不同 mmp-9 表达水平 2 型糖尿病患者 5 年 tb 感染率 例数 非 tb 感染 tb 感染 感染率(%) mmp-9 低表达组 79 68 11 13.9 mmp-9 高表达组 69 46 23 33.3* 注：与 mmp-9 低表达组比较，2=7.841，*p0.01 17 3.4.3 两组患者其它并发症发病率两组患者其它并发症发病率 5 年中 mmp-9 高表达组心脑血管疾病发生人数 14 人，5 年发病率为 20.3% （14/69），而 mmp-9 低表达组只发生 6 人，5 年发病率为 7.6%（6/79），相对 危险度为 2.7。5 年中 mmp-9 高表达组和低表达组肾病 5 年发病率分别为 11.6% （8/69）和 2.5%（2/79），相对危险度为 4.6。结果见表 1-4 和表 1-5。 表 1-4 不同 mmp-9 表达水平 2 型糖尿病 5 年患者心脑血管疾病发病率 例数 无心脑血管疾病 心脑血管疾病 发病率(%) mmp-9 低表达组 79 73 6 7.6 mmp-9 高表达组 69 55 14 20.3* 注：与 mmp-9 低表达组比较，2=5.079，* p0.05 表 1-5 不同 mmp-9 表达水平 2 型糖尿病患者 5 年糖尿病肾病发病率 例数 无糖尿病肾病 糖尿病肾病 发病率(%) mmp-9 低表达组 79 77 2 2.5 mmp-9 高表达组 69 61 8 11.6* 注：与 mmp-9 低表达组比较，2=4.801，* p0.05 18 第二部分第二部分 无并发症无并发症 2型糖尿病患者和型糖尿病患者和合并合并结核杆菌感染结核杆菌感染的的 2 型糖尿病型糖尿病患患者者 mmp-9 表达水平表达水平 前言前言 在第一部分研究中，发现无并发症 2 型糖尿病患者存在 mmp-9 表达水平的 差异，而且，mmp-9 高表达者发生结核杆菌感染以及慢性并发症的几率增加。 为进一步验证第一部分的结果，我们从 2008 年 1 月至 10 月采集了 76 例临床确 诊的感染结核杆菌的 2 型糖尿病患者以及 89 例无并发症的 2 型糖尿病患者的血 清，同样采用半定量 zymography、western-blot 检测 mmp-9 在两组患者血清中 的表达，并进行了统计学比较分析。 1、实验材料、实验材料 1.1 研究对象及标本采集研究对象及标本采集 以 2008 年1月至 10月在湖南省衡阳市 3 个三甲医院 （南华大学附属一医院、 南华大学附属二医院、市中心医院）以及市结核病防治院确诊的 76 例感染结核 杆菌的 2 型糖尿病患者以及 89 例无并发症的 2 型糖尿病患者，两组患者男女性 别构成分别为 43/33 和 55/34，两组平均年龄分别为 49.2 4.1 岁，49.7 4.8 岁， 两组在性别构成和平均年龄均不存在统计学差异（p0.05）。两组糖尿病的病 程分别为 4.3 5.1 年，4.5 4.8 年，差异无统计学意义（p0.05）。糖尿病、结 核病诊断标准、排除标准同前。 无菌采集每个研究对象 5ml 血液，室温放置 30min，1000rpm，离心 15min 分离血清，-70保存备用。 1.2 主要试剂及配方主要试剂及配方（同第一部分）（同第一部分） 1.3 主要仪器设备主要仪器设备（同第一部分）（同第一部分） 19 2、实验方法、实验方法 2.1 血清中血清中 mmp-9 的提取的提取（同第一部分）（同第一部分） 2.2 血清总蛋白浓度测血清总蛋白浓度测定定（同第一部分）（同第一部分） 2.3 zymography 及其半定量及其半定量（同第一部分）（同第一部分） 2.4 western-blot 及其半定量及其半定量（同第一部分同第一部分） 20 3、结、结 果果 3.1 zymography 检测结果检测结果 取相同蛋白总量的血清进行 zymography 检测 mmp-9 表达，发现合并结核 杆菌感染的 2 型糖尿病患者 mmp-9 的表达水平显著高于无并发症的 2 型糖尿病 患者（ p0.05） 。结果见图 2-1 和图 2-2。 图 2-1 无并发症 t2dm 和合并 tb 的 t2dm mmp-9 zymography 检测结果（显示部分） 注：st 为 mmp-9 和 mmp-2 的标准品 图 2-2 无并发症 t2dm 和合并 tb 的 t2dm mmp-9 zymography 检测结果的直方图 注：与 mmp-9 低表达组比较，* p0.05 3.2 western-blot 取相同蛋白总量的血清进行 western-blot 检测 mmp-9 表达，发现合并结核 杆菌感染的 2 型糖尿病患者 mmp-9 的表达水平显著高于无并发症的 2 型糖尿病 患者（ p0.05） ，与 zymography 的检测结果一致。结果见图 2-3 和图 2-4。 图 2-3 无并发症 t2dm 和合并 tb 的 t2dm mmp-9western-blot 检测结果（显示部分） 21 图 2-4 无并发症 t2dm 和合并 tb 的 t2dm mmp-9western-blot 检测结果的直方图 注：与 mmp-9 低表达组比较，* p0.05 22 讨讨 论论 基质金属蛋白酶是一类结构中含 zn2+和 ca2+的蛋白水解酶类，主要参与细 胞外基质的代谢。它们在血管形成、伤口愈合、肿瘤浸润和纤维化等方面起着重 要的作用，近年来备受关注。目前已发现的基质金属蛋白酶已达到 28 种38，主 要分为五类， 1）间质胶原酶类，这类 mmp 可降解间质胶原（、型胶 原），主要包括 mmp-1、mmp-13 和 mmp-8。2）型胶原酶或明胶酶类，可 降解基底膜型胶原和变性的间质胶原（明胶），主要包括 mmp-2 和 mmp-9， 因为目前有一种非常成熟而且简单易行的方法-zymography 检测 mmp-2 和 mmp-9 的表达，因此，这一类酶目前研究最多。3）基质分解素类，可降解蛋白 多糖、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和型胶原，主要包括 mmp-3、mmp-7 和 mmp-10。4）膜型金属蛋白酶类（membrane-type mmps，mt-mmps)，主要包 括 mmp-14、mmp-15、mmp-16 和 mmp-17，是最近克隆出来的 mmp 家庭新 成员，具有双重功效，它们既能激活 mmp-2 酶原（pro-mmp2），又能降解细 胞外基质。 5）结缔组织重建类，作用于脂肪组织和结缔组织，主要包括 mmp-11 和 mmp-12。基质金属蛋白酶类有许多共同的特性：第一，其催化机制依赖于含 锌离子的活化中心；第二，以酶原形式分泌出细胞；第三，酶原需经蛋白酶等水 解和修饰后才有活性；第四，结构相似，cdna 序列上显示同源性；第五，能裂 解一种或多种细胞外基质；第六，可被金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloprotein-ase，timps）或螯合剂 edta 所抑制。 人 mmp-9 又叫做明胶酶 b，基因位于 20 号染色体 q11.113.1，具有 13 个 外显子和 9 个内含子，cds 全长 2124bp，编码蛋白质分子量为 92kda。哺乳类动 物mmp-9mrna的同源性约为80%， 小鼠mmp-9分子量略大于100kda。 mmp-9 的启动子区内含有活化蛋白 ap-1、ap-2 和刺激蛋白 sp-1 因子结合位点，人的 mmp-9 启动子区还有核因子(nf)b、ets 结合位点和转化生长因子(tgf)- 抑 制元件。mmp-9 是明胶酶中的一种，天然 mmp-9 经过糖基化，除了含有 mmps 的原型结构外，mmp-9 的催化区还包括 3 个重复的纤维连接蛋白结构域，一个 位于前体域 （prodomain） 中， 另外两个位于酶的活性中心区。 这种结构为 mmp-9 和 mmp-2 所独特， 它与明胶或弹性蛋白有高度的亲和力39。 mmp-9 包含一个 v 型的胶原蛋白结构域， 这个结构域有高度的糖基化作用，它影响底物的特异性以 23 及有抗衰变的作用。mmp-9 有许多作用底物，如 iv、v、vii、x、xi 型胶原、 蛋白聚糖的核心蛋白、明胶、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白等，细胞因 子及其受体也是 mmp-9 作用的底物。 细胞外基质由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质组成，构成复杂的网 架结构，对细胞的形状、结构、功能、存活、增殖、分化、迁移等一切生命活动 具有全面的影响，因此，它在维持机体结构与功能完善，维护机体的免疫应答和 抵抗外界微生物的侵入等方面具有非常重要的作用。 本研究包括两部分研究，在第一部分研究中发现 2 型糖尿病患者之间存在 不同的 mmp-9 表达水平，采用流行病学队列研究的方法发现 mmp-9 表达高水 平者并发结核杆菌感染率显著高于 mmp-9 表达低者，其相对危险度为 2.4，同 时，mmp-9 高表达组心脑血管疾病以及肾病等并发症的发病率都显著高于 mmp-9 低表达组，相对危险度分别为 2.7 和 4.6，可见 mmp-9 高表达的 2 型糖 尿病患者更容易发生结核杆菌感染及发生慢性并发症； mmp-9 表达增高可能是 2 型糖尿病患者易于感染结核杆菌的因素。第二部分的研究结果显示并发结核杆 菌感染的2型糖尿病患者其mmp-9表达水平显著高于无并发症2型糖尿病患者， 证实了第一部分的研究结果。 糖尿病患者长期受高血糖刺激,致细胞外基质中终末期糖化终产物(age) 增加，age 可激活核因子(nf)b，促进了内皮细胞 mmp-mrna 和蛋白的表达， 使 mmp-9 表达增强40。mmp-9 表达增高如何导致 2 型糖尿病患者发生结核杆 菌感染、心脑血管疾病以及肾病等并发症的机制尚不清楚。增高的 mmp-9 可能 通过其生物学效应来发挥作用。mmp-9 高表达可能消化较多的细胞外基质，破 坏机体的平衡，降低机体对外界环境的抵抗力，加上在糖尿病的发展进程中机体 的免疫力本来就低，导致外源细菌的侵入，因为广泛存在的结核杆菌在外界环境 中存活能力强，存活时间长，因此，那些 mmp-9 表达水平高的糖尿病患者更易 感染结核杆菌。 有研究表明，糖尿病患者（尤其合并大血管病变者）血浆和动脉壁中有较 高的 mmp-9 表达41。mmp-9 被认为在动脉粥样硬化和血管重建过程中起着相 当重要的作用42。mmp-9 通过降解血管壁 ecm，有利于血管平滑肌细胞突破周 围组织屏障，从中膜向内膜迁移进行增殖，摄入脂质分泌更多 ecm，形成动脉 24 粥样硬化（as）斑块；其次可破坏斑块表面的纤维帽，使斑块易于发生破裂， 继发血栓形成和机化，导致 as 损伤进展和斑块扩大；第三，mmp-9 还可破坏 细胞与基质间的相互作用， 诱导血管平滑肌细胞发生凋亡， 从而加速 as 进程43。 而糖尿病心脑血管病与 as 有关。 mmp-9 过度降解 ecm 并诱导外周 t 细胞、 nk 细胞等多种细胞因子迁移， 促进肾脏组织的炎症细胞浸润，加剧肾脏固有细胞的损伤，导致系膜基质堆积 44。其次，mmp-9 降解基底膜，破坏细胞与基质间的正常连接，致肾小球基底 膜正常结构破坏，影响肾小球基底膜的重塑，促进蛋白尿的发生45。肾小球基 底膜增厚、系膜区 ecm 积聚是糖尿病肾病病理特征。 因此，本研究结果提示，mmp-9 可能是 2 型糖尿病一个治疗新靶点，降低 机体 mmp-9 的表达可能有利于减少 2 型糖尿病并发结核杆菌感染及心脑血管疾 病、肾病并发症的产生。然而，mmp-9 在人体内的存在具有重要的生理作用， 比如在血管形成、 伤口愈合以及血液粘度的平衡等方面具有重要作用46,47， 因此， 随意降低 mmp-9 的表达可能会带来其它的副作用。所以，如何正确控制和调节 mmp-9 在人体内的表达，是一个相当复杂的系统工程。 25 结 论 1）2 型糖尿病患者存在不同的 mmp-9 表达水平； 2） mmp-9 高表达的 2 型糖尿病患者更容易发生结核杆菌感染及发生慢性 并发症。 26 参考文献参考文献 1 nagase h , woessner jf. matrix metalloproteinases. j. biol. chem, 1999, 274(31):21491-21494. 2 gomis-ruth fx. structural aspects of the metzincin clan of metalloendopeptidases. mol biotechnol,2003, 24 (2): 157202. 3 gomis-ruth fx. catalytic domain architecture of metzincin metalloproteases.j biol chem,2009, 284(23):15353-15357. 4 polette m , birembaut p. membrane-type metalloproteinases in tumor invasion. int j biochem cell biol, 1998, 30(11):1195-120