一株稻田土壤分离青霉降解纤维素活性的研究.doc

一株稻田土壤分离青霉降解纤维素活性的研究生物科学专业 学生：彭娅萍 指导教师：李玉中摘 要：本文以衡阳市稻田土壤分离筛选到的一株青霉（编号：1-4）为对象，进行了鉴定和纤维素降解活性的研究。采用三点接种法和平板插片法将其接种到鉴定培养基（cya）上进行形态鉴定，然后对该菌进行液体发酵，取发酵液的离心滤液作为粗酶液，采用滤纸酶活法测定其降解纤维素的能力。依据菌落形态以及显微形态确定该菌为冬克青霉（penicillium donkii）。酶活测定结果表明该菌在第8天酶活力达到最大，为16.69u/ml。本研究结果对冬克青霉的纤维素降解能力做了初步探究，为其开发利用的进一步研究提供了理论依据。关键词：冬克青霉；鉴定；纤维素降解酶；酶活力测定农业稻草秸杆是一种非常丰富的多糖资源，但目前利用率非常低。在降解时，生物降解方法相对化学、物理方法而言是最具前景的降解方法，此法具有降解率高，安全环保，成本低等优点。因而纤维素降解菌分离、筛选和酶活性的测定成为当前研究的一大热点1-6。其中，纤维素酶的研究是纤维素降解的关键。测定纤维素酶的活性，筛选高活力的酶是该领域研究的一大重点。目前，由国际理论和应用化学联合会（iupac）创立和推广的以whatman no.1号滤纸（日本用东洋1号）作为底物的滤纸酶活测定法是测定纤维素酶组分总活力最普遍的方法7，8。近年来，国内许多人对纤维素酶的测定方法及影响因素做了深入研究9-13，并有文章报道该酶可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、石油、勘探、中药成分提取等众多领域 14。由此看来，纤维素酶的研究具有重要的应用价值。本文目的在于对从衡阳市农村稻田土壤中分离筛选出来的一株编号1-4的青霉进行鉴定并测定其酶活力，为该菌可否作为高效纤维素降解菌提供理论依据。1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 样品来源菌株是从衡阳市祁东县水稻田土壤中分离筛选出的一株青霉编号为1-4，现保存于衡阳师范学院生命科学系生物基础实验室。1.1.2 主要试剂及培养基配方dns试剂配制参考林金秀的方法13。柠檬酸缓冲液(0.05mol/l，ph=5.0)：取柠檬酸5.2535g，定容到250ml，为a液；柠檬酸三钠7.3525g，定容到250ml，为b液；取51.25ml a液和73.75ml b液混合后，定容到250ml。pda培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉20g，水1000ml，自然ph。种子培养基：cmc-na10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，kh2po4 2.0g，(nh4)2so4 1.5g，蒸馏水1000ml。液体发酵培养基：cmc-na 5g，蛋白胨3g，牛肉膏1g，蒸馏水1000ml，自然ph值，121下高压灭菌20min。鉴定培养基（cya）配制参考孔华忠的方法15。1.2 试验方法1.2.1 实验菌种的纯化从前期试验的初筛培养基上挑取目的菌用无菌水稀释，涂布到新倒好的3个pda平板上，用保鲜膜封好，置于28的恒温培养箱中培养4d，每天注意观察其生长情况。为确保菌种为纯种，再次从涂布接种的平板上挑取长成散状小点的目的菌划线接种到新的平板上。1.2.2 菌株鉴定利用三点接种法将菌株接种到鉴定培养基（cya）上，平板置于30恒温箱中培养一周，根据得到的单个菌落的颜色、形态、大小、以及菌落边缘和表面质地等做出初步判断。用接种环挑取菌种孢子，在新的平板培养基的一侧进行划线接种，然后在接种处斜插入无菌盖玻片，培养5-7d，用镊子小心取出盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦净。然后将盖玻片无菌丝体的一面放在洁净的载玻片上，在显微镜下观察菌丝、孢子梗、孢子形态，参阅中国真菌志第三十五卷15对青霉1-4进行鉴定。1.2.3 制作标准曲线取50mg葡萄糖，加蒸馏水溶解，定容至50ml，为1mg/ml葡萄糖标准液。取5支试管，按表1往试管加入葡萄糖标准液和蒸馏水，再加入1.5mldns试剂，沸水浴5min，自来水立即冷却，蒸馏水定容到10ml，540nm比色。表1 3,5-二硝基水杨酸法定制葡萄糖标准曲线的制作试管编号01234葡萄糖标准液（ml）00.20.40.60.8蒸馏水（ml）2.01.81.61.41.21.2.4 fpaase测定粗酶液制备：将纯化到的菌株接种到种子培养基中，28，180 r/min培养23d制成种子液。取6个250ml的锥形瓶，每个锥形瓶里装入100ml的发酵液。接2ml种子液，于28，180 r/min的摇床中培养，4d后每天测定其fpaase。吸取发酵液8ml于10ml离心管，平衡后于4000rmin下离心10min，上清液即为粗酶液。滤纸处理：使用前将其用1%的醋酸溶液浸泡一昼夜以除去淀粉，用碘液检验，再用2%的nahco3溶液洗至中性，晒干。酶活测定：采用3,5-二硝基水杨酸(dns法)测定总纤维素酶活力一滤纸酶活(fpaase)。滤纸酶活：在4支试管中分别加入50mg经去淀粉处理后的定性滤纸，加1ml柠檬酸-柠檬酸钠液冲液(ph值5)，置于50c水浴中预热5min，再加入1ml粗酶液，其中一支不加酶液做为空白管，轻轻摇匀，使滤纸完全浸泡在液体中。50水浴反应60min，立即向各管加入1.5ml的dns试剂，再于空白管中加入粗酶液1ml，摇匀，将4支试管同时煮沸5min后取出，迅速冷却至室温，定容至10ml。于540nm波长下测od值16-17。以上酶活力单位(u/ml)定义为：在测定条件下，1ml酶液每分钟水解底物生成1g葡萄糖所需的酶量，按照下面公式计算。酶活力= (1)sd1000vt公式（1）中，s：由样品的平均吸光值在标准曲线上相对应的葡萄糖含量(mg)； d：定容到的体积； 1000：mg与g之间的换算系数； v：参与反应的粗酶液体积(ml)；t：反应时间(min)。2 结果与分析2.1菌株形态学鉴定青霉1-4在pda培养基上第4天表现为菌落颜色灰绿色，呈粉末状（图1a），边缘粗糙，反面为橙黄色。在鉴定培养基查氏酵母膏琼脂（cya）上，菌丝起初为白色，第45天颜色稍微转暗，到第7天直径26-32mm，具放射状皱纹或有脐状突起，但菌核较少；质地绒状兼絮状（图1b）；分生孢子结构产生较少，分生孢子面灰蓝色，近于淡灰橄榄色；菌丝体白色至淡黄色；边缘长成暗绿色，呈现辐射状沟纹，辐射沟中有少许渗出液；反面中部橘褐色，边缘淡黄色。在1040倍显微镜下可见菌株营养菌丝体无色、有横隔，分生孢子梗亦有横隔。其分生孢子梗发生于基质或气生菌丝，孢子梗（40）70200（250）2.03.0m，壁平滑，顶端膨大达4.5m；帚状枝单轮生，偶有梗基状分枝；瓶梗每轮512个，8.010.52.23.0m，瓶状，梗颈短（图1c）；油镜下可以看到分生孢子呈现近球形至椭圆形或宽椭圆形，小，2.53.22.02.5m，壁平滑；分生孢子链呈现较疏松的圆柱状。（图1d）。由以上特征，参照中国真菌志第三十五卷描述，鉴定该菌株为类曲霉亚属的冬克青霉（penicillium donkii）。图1 青霉1-4的菌落形态a pda; b cya; c 分生孢子穗及菌丝结构; d 油镜下的孢子结构2.2标准曲线按照表1以od值为x轴，以葡萄糖浓度c为y轴在excel上做标准曲线如下，方程式为y=0.185x+0.0713，其线性相关系数r2=0.9952(图2)，线性较好，可以作为吸光值与浓度的线性方程。图2 葡萄糖标准曲线2.3 总纤维素酶活的测定分别接种一定量种子液到以纤维素作为唯一碳源的液体发酵培养基上，置于28，180 r/min的恒温震荡器上培养，菌株在液体培养基中培养2d后菌丝球开始增多，45d后数量达到最大。培养5d后隔24h测量一次发酵液的总纤维素酶活（fpaase），分别在540nm波长处测得一个od值，根据绘制的葡萄糖标准曲线计算相应的葡萄糖浓度，又由式(1)算出粗酶液的总纤维素酶活力，酶活力随着发酵天数增大，在8d后开始减小，最大值为16.69u/ml(见图3)。 图3 培养时间对青霉1-4酶活性的影响3 结论与讨论3.1 经形态学鉴定该青霉1-4为类曲霉亚属的冬克青霉（penicillium donkii），关于它的报道非常少，中国真菌志上描述冬克青霉为罕见菌种，难以分离到，我国上海和湖北神农架有分布15。本研究表明冬克青霉在衡阳地区也有分布，为我国的真菌资源调查增加了参考资料，具有一定的资料参考价值。3.2 试验得出该种菌的总纤维素酶活力在第8天出现最高值为16.69u/ml。国内有很多关于纤维素降解酶活力的研究1,2,9-11，但对于冬克青霉降解纤维素活性的研究还未见报道。本文结果扩大了产纤维素酶菌株资源的筛选范围，有助于纤维素资源的开发利用，具有一定经济价值。3.3 本研究得到的酶活力为16.69u/ml比较理想，说明冬克青霉对纤维素有较好的降解能力，具备可开发的潜力，但要用于工业生产尚需对其进行更深入的研究，因此，有必要在诸如发酵条件的优化、紫外光诱变、纤维素酶基因等方面对该菌株进行研究，来提高其纤维素的降解能力。以期更好的为秸秆资源的利用做出应有的贡献。【参考文献】1 胡亚林,冼亮,刘果,段承杰,冯家勋. 两株纤维素降解真菌的分离鉴定及其产纤维素酶酶学性质的初步研究j. 广西农业科学,2008,04:425-428. 2 马宁. 纤维素降解的筛选鉴定及降解能力评价d.西北农林科技大学,2012. 3 王洪媛,范丙全. 三株高效秸秆纤维素降解真菌的筛选及其降解效果j. 微生物学报,2010,07:870-875. 4 殷中伟,范丙全,任萍. 纤维素降解真菌y5的筛选及其对小麦秸秆降解效果j. 环境科学,2011,01:247-252. 5 黄宁珍,付传明,何金祥,唐凤鸾,区婵,何成新. 纤维素降解真菌分离筛选、产酶特性及高效水解菌系的初步构建j. 西南农业学报,2010,05:1489-1496. 6 李方正,唐亮,赵建文,王文娟,赵宏坤. 一株高效秸秆纤维素降解真菌的分离、鉴定及系统发育分析j. 山东农业科学,2011,07:5-8.7 hilden l,johansson g. recent developments on cellulases and carbohydrate-binding modules with cellulose affinityj. biotechnol let,2004,26(22):1683-16938 ghose t k. measurement of cellulase activityj. pure and appl chem,1987,59(2):257-2689 赵玉萍,杨娟. 四种纤维素酶酶活测定方法的比较j. 食品研究与开发,2006:116-11810 姜心,陈伟,周波,等. 纤维素酶活测定影响因素的研究j. 食品工业科技,2010(5):65-6811 张瑞萍. 纤维素酶的滤纸酶活和cmc酶活的测定j. 印染助剂.2002(05):51-5312 刘晓晶,李田,翟增强. 纤维素酶的研究现状及应用前景j. 安徽农业科学,2011,39(4): 1920-1921,192413 林金秀. 纤维素降解菌的筛选及其发酵条件研究d. 福建农林大学.201014 李大婧,刘春泉.王振宇. 纤维素酶及其在天然产物开发中的应用j. 江苏农业科学,2005,6: 140-14215 孔华忠. 中国真菌志m. 北京:科学出版社,2007.54-5616 coward-kelly g, aiello-mazzari c, kim s, et al. suggested improvements to the standard filter paper assay used to measure cellulase activityj. biotechnology and bioengineering,2003, 82(6):74574917 许玉林,郑月霞,叶冰莹,等.一株纤维素降解真菌的筛选及鉴定j.微生物学通报.2013(02): 220-227research on cellulose-degradation activity of a strain of penicillium separated from paddy soilbiological sciences: peng yaping tutor: li yuzhongabstract: in this text, a strain of penicillium(numbered 1-4)，separated from a paddy in hengyang area, was identified and measured its cellulose degradation activity. it was inoculated on the identification culture medium(cya) by three inoculation method and cultured on another plate with inserted cover glass. then the strain was inoculated to liquid fermentation cultivation for 5 to 9 days and took its centrifugal filtrate as crude enzyme li