2012.4.19PCR标准化意义(福州).ppt

CML患者定量PCR国际标准化 意义及展望 目 录 CML分子学监测标准化的背景及挑战 分子学监测标准化的解决方法 国内目前的PCR报告及国际标准化PCR报告范例 2 随着格列卫治疗时间的延长疾病负荷呈现下降趋势 n 检测MRD需要高度灵敏的检测技术 Radich JP. Blood. 2009;114:3376-3381. Dx,诊断；FISH, 荧光原位杂交 疾病负荷与检测 BCR-ABL 转录本 (log10) Dx 降低5 Log 降低1 2-log 细胞遗传学 FISH RT-PCR 治疗时间（月） 时间 分子学监测的优势 n 采用实时定量聚合酶链反应PCR（RQ-PCR）进行分 子学反应的检测 该检测与常规细胞遗传学反应检测相比更灵敏，超过3个对数级 对外周血样进行RQ-PCR检测，相对于骨髓样本检测更方便 Radich JP. Blood. 2009;114:3376-3381. 分子学反应对疾病预后的意义 n分子学反应的程度、持续时间及早期获得 与长期疗效的改善相关 n获得MMR与较高的EFS率、PFS率相关 1. Branford S, et al. Leukemia. 2003;(17):2401-2409; 2. Quintas-Cardama A, Blood. 2009;113:6315-6321; 3. Mller MC, et al. Blood. 2008;112(11):129; 4 Hughes TP, et al. Blood. 2008;112(11):129-130; 5. Press RD, et al. Blood. 2006;107(11):4250-4256; 6. Iacobucci I, et al, Clin Cancer Res. 2006:12,3037-3042: 7. Cortes J, et al, Clin Cancer Res;2005;11:3425-3432; 8. Paschka P, et al. Leukemia; 2003;17:1687; 9. Press RD, et al. Clin Cancer Res. 2007;13:6136-6143; 10.Kantarjian H, et al. Cancer. 2008;112:837-845. 分子学是未来CML治疗的监测趋势 分子学监测需要统一标准（国际标准，IS）： IRIS研究：3个参与实验室采用BCR作为对照基因，将30例 CML患者的平均BCR-ABL水平定义100% 国际标准（IS）：将每一个实验室测定值与IRIS基线相比如减 少3-log（0.1%），定义为获得MMR CML分子学监测的标准化：背景 6 Hughes et al., Blood. 2006 Jul 1;108(1):28-37. BCR-ABL的国际标准（IS）的定义 IRIS 基线 IRIS MMR；减少3-log 当地测定 0.1% 1% 0.01% 10% 0.001% 100% 转换因子/ 对照样本 国际标准BCR-ABL转录 本水平高 （其他对照基因？） 不同的引物/探针 7 已经制定 了一套国际标准（IS），来统一不同实验室获得的BCR- ABL值1,2 分子学监测的标准化 1. Branford S, et al. Blood. 2008;112:3330-3338. 2. Hughes T, et al. Blood. 2006;108:28-37. IRIS：国际随机干扰素和STI571研究 IRIS研究涉及实验室 阿德莱德实验室 曼海姆 伦敦 其他实验室 国际标准（IS） 样本送检 其他实验室 标准化后 比较不同实验 室获得的分子 学结果 获得转换因子 IS标准化 转换因子 8 未进行基线标准化严重影响患者疗效的正确评估 0.001% 0.1% 0.01% 1% 10% 100% 107 108 109 1010 1011 1012 BCR-ABL比率(IS) 白血病细胞数 MMR 标准化基线 未获得MMR 2例患者与各自的基线值相比均减少3-log ，但是仅有患者A获得MMR 单个患者的基线 9 缺乏转换因子导致实验室无法准确报告 患者的疗效 0.001% 0.1% 0.01% 1% 10% 100% 107 108 109 1010 1011 1012 BCR-ABL 比率 (IS) 白血病细胞数 MMR 标准化基线 0.11% x 0.83 (cf) = 0.09% IS MMR 0.1125% IS 未获得MMR x 1.25 (cf) 0.09% 没有CF，实验室无法报告患者是否获得了MMR 10 目 录 CML分子学监测标准化的背景及挑战 分子学监测标准化的解决方法 国内目前的PCR报告及国际标准化PCR报告范例 11 如何正确定义分子学反应 ELN recommendations, Baccarani M, et al. J Clin Oncol. 2009; 27(35): 6041-6051. 完全分子学反应（CMR） 对连续两次收集到的高质量的血液样本进行实时 定量或巢式PCR检测（灵敏度10-4） ，检测不到 BCR-ABL mRNA转录本 主要分子学反应（MMR） 在国际量表中BCR-ABL与ABL（或其他管家基因 ）的比率0.1%* *国际量表的标准是： 100%作为标准的基线; 0.1%为比较基线下降3-log 12 BCR-ABL/BCR比率 (%) 100 自获得CCyR开始的时间（月） CCR3691215 澳大利亚英国美国 0.001 0.01 0.1 1 10 各个实验室的中位BCR-ABL值 采用标准化使各中心接近MMR水平的 BCR-ABL结果可比（IRIS研究） 13 102 BCR-ABL / ABL K56210-210-310-410-510-6 对照 1 2 9 14 16 21 22 19 实验室 101 100 10-1 10-2 10-3 10-4 对BCR-ABL/ABL K562 RNA样本 采用标准化后结果可比较 14 参照方法与区域法在转化为IS前后的平均差异 和95%一致性限度 采用目前分析系统中的验证方 法来比较19个区域法 转换前：平均差从低于7.7倍到 高于8.1倍不等 转换后：大多数区域法的平均 差为1.2倍 Branford S. et al., Blood 2008;112:3330-3338 1.0的差值表明无差异 (A) 转换前 (B) 转换后 转换前与参照方法相比的 差值 转换后与参照方法相比的 差值 区域法数 区域法数 0倍 5倍 3倍 1倍 3倍 5倍 0倍 0倍 5倍 3倍 1倍 3倍 5倍 0倍 15 国际标准化的意义 是测定CML患者残留疾病的常见标准，适用于科学文献中 或者在临床研究中作为治疗终点 准确测定CML的关键分子学治疗目标 测定的是残留疾病的绝对值，而不是相对值 16 中国PCR标准化展望 北京大学人民医院 实验室 实验室 1 实验室3 实验室2 实验室4 实验室n 国际参照 实验室 CF CF1 CF2 CF3 CF4 CFn 17 目 录 CML分子学监测标准化的背景及挑战 分子学监测标准化的解决方法 国内目前的PCR报告及国际标准化PCR报告范例 18 国内某医院RQ-PCR报告 BCR-ABL融合基因mRNA分型定量报告单 姓名： 性别：男 年龄：45岁 编号：345 样本：骨髓 送检日期：2011/07/25 科室：30-05 报告日期：2011/07/28 基因结果阴性对照质控-1质控-2检测下限单位 BCR-ABL- 210 2.28E+065.0E+022.98E+053.13E+045.0E+02拷贝/毫升 内参ABL2.25E+055.0E+02 个有核细胞 /毫升 BCR- ABL/ABL 1.0E+01 拷贝/个有 核细胞 报告者： 19 CML 国际标准化PCR报告1 来自不同实验室的实时定量聚合酶链式反应（RQ-PCR）报告的组织方 式不同，可能包含不同的信息。一些实验室正致力于使用国际标准（IS ）将检测和报告方法进行标准化，以便在不同实验室之间进行结果比较 。 无论报告的形式如何，也不管是否使用了国际标准 ，报告应提供以下信息 医师：检测医师地区：检测地区联系电话 #：xxx-xxx-xxxx 患者姓名：张三出生日期：03/06/1947年龄：64岁 样品ID #：xxx-xxxx日期：09/30/2011接收日期：10/01/2011 报告日期：10/07/2011 采样日期和送达实验室的日期 1 11 20 检测：方法：样品：样品质量： 1. BCR-ABL QUANTQRT-PCR外周血良好 检测 1 结果：BCR-ABL（ IS%）： BCR-ABL (raw %) ABL拷贝BCR-ABL 拷贝 0.028%0.034%3478512 对样品的质量和来源进行评价 2 本例中使用的为标准化基线（IS）计算出的BCR-ABL/ABL的比值 ，用百分比表示；但对某些实验室来说，可能是同在那家实验室 进行评估的未治疗患者的基线） 原始数据转换为IS（CF 0.83 x 0.034=0.02822） 3 原始数据（即实际数量） 4 本次随访时患者BCR-ABL与对 照基因的比值（BCR-ABL/ABL ） 5 2 3 4 5 对照基因拷贝的数量说明数据 是否可靠和可重复，并有助于 确定样品质量是否合格 6 6 CML 国际标准化PCR报告2 21 倍数改变：较最后一次分析：-0.1 较最低水平：N/A MMR：是 100 10 1 0.1 0.01 0.001 % BCR-ABL/ABL （IS ） MMR（基线下3个对数级）（0.10% IS ） 3/15/2010 6/15/2010 9/15/2010 12/15/2010 3/15/2011 6/30/2011 9/30/2011 说明：该检测能发现转录水平大于1/100,000（0.001%）的BCR-ABL易位 e13a2、e14a2、e1a2。主要断裂点（或者b2a2和b3a2 或者e13a2和e14a2） 和次要断裂点（e1a2）也可相应地称为p210和p190。所有结果应与相关的临 床表现以及细胞遗传学、组织病理学和免疫表型进行综合考量。 7 8 8 9 解释这两个比例如何进行比较 （本例是指距基线或最低水平 的倍数改变；有些实验室使用 的是距基线的对数级减少） 7 如何定义主要分子学缓解（ MMR）以及患者是否已满足 这一定义 8 此患者之前的检测结果显 示出随时间的变化趋势 9 RQ-PCR检测的灵敏度（对于 阴性结果） 10 10 11 11结果解读：100%是一个标准 化的