流式细胞术的原理与应用.ppt

流式细胞术原理和应用 王秀莉 2011.9.30 一一 简介简介 二二 构造及工作原理构造及工作原理 三三 FCMFCM的数据分析的数据分析 四四 FCM FCM的应用的应用 五五 实例实例 一 简 介 流式细胞仪流式细胞仪( (Flow Flow CytometerCytometer): ):是集激光技是集激光技 术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技 术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为 一体的高科技细胞分析仪。一体的高科技细胞分析仪。 流式细胞术流式细胞术( (Flow Flow CytometryCytometry，FCMFCM): ):利用利用 流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞 或亚细胞结构进行多参数、快速的定量分析和或亚细胞结构进行多参数、快速的定量分析和 分选的技术。分选的技术。 流式细胞仪的特点 =单个细胞或微粒分析 =同时多参数分析 =速度快：10000个细胞(微粒)/秒 =统计学意义：提供细胞群体的均值和 分布情况 =分选感兴趣的细胞或微粒 举例：细胞周期分布检测 流路 (液流系统） 流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/ml 光路（光学系统） 光源 滤片 电路（检测系统） 光电倍增管PMT 放大电路HV及GAIN 增益 A/D转换 统计 （分析系统） 计算机 二二 构造及工作原理构造及工作原理 流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激 光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻 璃中央开一个孔径为430m180m的长方形孔 ，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种 流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受 照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广 角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精 度。 液流系统 流动室 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 液流系统 激光光源：目前台式机FCM，大多采用 氩离子气体激光器。激光(laser)是种 相干光源，它能提供单波长、高强度及 稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速 分析的理想光源。由于细胞快速流动， 每个细胞经过光照区的时间仅为1s左右 ，每个细胞所携带荧光物质被激发出的 荧光信号强弱，与被照射的时间和激发 光的强度有关，因此细胞需要足够的光 照强度。 光学系统 信 号 散射光信号 FS 细胞大小 SS 细胞颗粒性 荧光信号 FL1 FITC FL2 PE FL3 ECD FL4 PC5 光学系统 散射光信号 细胞大小及颗粒性 FS SS 光学系统 光路 （滤片特性） 光学系统 流式细胞仪光路图 Air-cooled Argon Ion Laser Beam Shaping Lenses High Sensitivity Quartz Flow Cell Forward Scatter Detector Side Scatter Detector 525BP FL1 (FITC) 575BP FL2 (PE) 620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5) 488DL 488BK 550DL 600DL 645DL 光学系统 电路 电压调节 光电倍增管 电压 volts 增益 Gain 信号放大方式 检测系统 电信号输入到放大器放大，放大器分两 类：线性放大和对数放大。 细胞DNA含量、RNA含量等的测量一般 选用线性放大测量。 在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜 表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚 至几万倍，通常使用对数放大器。 检测系统 常用荧光染料介绍 FITC： 绿色 525nm PE： 橙黄色 575nm ECD： 橙红色 610nm PECY5： 深红色 675nm PerCP： 深红色 675nm PECY7： 深红色 755nm 7AAD： 深红色 675nm PI(碘化丙啶）： 橙红色 620nm 488nm波长的氩离子激光激发 光路补偿 FITC/PE/ECD/PC5 三三 FCMFCM的数据分析的数据分析 1. 单参数一维直方图 纵坐标表示细胞数，横坐标表示相对荧光 信号或散色光信号值，单位是道数。 2. 双参数二维点图 显示来自同一细胞的两个参数与细胞数量间的关系。 横、纵坐标分别表示两个参数的相对含量。通过分别 计算两坐标所表示参数的阳性率来得到实验结果。 3. 等高线图 4. 密度图 白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验 1 流式细胞术的临床应用 四四 FCMFCM的应用的应用 细胞大小 细胞的颗粒度 细胞表面分子：CD 系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测：细胞周期、凋亡 2 流式细胞术的科研应用 荧光信号的定量可以用 平均荧光强度（mean值 ），荧光信号面积（Area，A）来表示。 1） 蛋白表达的检测 2）DNA Analysis PI Ethidium Bromide Acridine Orange DAPI (UV excitable) Hoechst 33342 (viable, UV excitable) 不能主动进 入细胞，需 要固定打孔 488nm激发 为脂溶性，主 动进入细胞 UV激发 常用的DNA 染料 0 200 400 600 8001000 GG 0 0 GG 1 1 s s GG 2 2 MM DNA AnalysisDNA Analysis Count 2 2N N 4 4N N GG 2 2 MMGG 0 0 GG 1 1 s s 0 200 400 600 8001000 PI Fluorescence 2 2N N 4 4N N DNA Analysis 3） Apoptosis 检测 A） DNA片断化检测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50300kbp长的DNA大片 段, 或180200bp整数倍的寡核苷酸片段 B） Caspase-3活性的检测 Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用， 其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多 途径中发挥功能。 C） Annexin V Assay 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内 侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞 膜的表面，暴露在细胞外环境中 , Annexin-V是一种分子量为 3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异 性结合 Annexin V Assay能够区分死亡与凋亡 D） TUNEL 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素 、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而 可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为