化合物K通过CAMK-IVAMPK途径在HT-29结肠癌细胞诱导凋亡.docx

化合物k通过camk-iv/ampk途径在ht-29结肠癌细胞诱导凋亡do yeon kim,min woo park,hai dan yuan,hyo jung lee,sung hoon kim,and sung hyun chung生命和纳米医药科学学院，药学院，韩国庆熙大学，首尔130-701，韩国和预防癌症的材料发展研究中心，东方医药学院，庆熙大学，韩国首尔130-701。虽然人参人参二醇皂苷肠道代谢产物化合物k（ck）一直诱导各种癌细胞的细胞凋亡，但amp激活的蛋白激酶协会（ampk）对细胞在ht-29结肠癌细胞里的凋亡仍不清楚。我们推测，ck可能在ht-29细胞中通过调节ampk途径发挥抗癌活性。ck-诱导细胞凋亡是与的线粒体膜电位的破坏， 从线粒体释放裂解凋亡因子（细胞色素c和凋亡诱导因子）和蛋白酶9，蛋白酶3，蛋白酶8，bid蛋白，parp蛋白质的裂解有关。这种ck对结肠癌细胞凋亡的影响被发现通过激活ampk发起的，ampk激活是通过ca2+/ 钙调素活化蛋白激酶-iv（camk-iv）的磷酸化引起的。化合物c（ampk抑制剂）或sirna ampk对ht-29细胞的治疗彻底废除了ck-诱导细胞凋亡。 sto-609，camks抑制剂，也抑制ck-ampk的活化和诱导凋亡。总之，目前的研究表明，ck-介导的细胞死亡的ht-29结肠癌细胞是受camk-iv/ampk途径的调节，这些发现提供了ck分子基础的抗癌作用。关键词：k化合物；ampk； camk-iv；凋亡；ht-29大肠癌细胞引言癌症是一种在世界各地日益严重的健康问题，在发达国家结肠癌是癌症相关死亡的主要原因之一(1)。已经有许多团体研究了利用药用植物进行癌症化学预防，人参在预防人类致癌已被牵出，可能通过在细胞增殖或生存期对其抑制活性。化合物k（ck）是口服后在肠道内原人参二醇型皂苷的活性代谢产物，是在体内吸收原人参二醇皂苷的主要形式（图1）。在那些之前对一些抗癌药物产生耐药性的癌细胞中,ck显示出可以提高抗癌药物的疗效，从而在以苯并（a）芘（3）处理的大鼠中，呈现出抗遗传毒性和抗诱裂活性，并诱导细胞凋亡（4-6）。在这些研究报告，对照的抗肿瘤活性是归因于细胞凋亡的诱导。然而，ck-诱导的细胞凋亡的详细机制仍然是知之甚少。amp激活的蛋白激酶（ampk）属于托阿家庭丝氨酸/苏氨酸激酶，是一种监测amp/ atp比值维持细胞稳态的燃料传感器（7）。几个代谢压力，包括缺氧，运动和饥饿，导致激活ampk通路（8,9）。最近，一些组织已经证明了在例如aicar（ampk活化剂）处理细胞或组成性激活ampk（10）的突变体条件下，ampk的强大的促凋亡潜力。这些结果说明ampk信号可能是一个潜在的癌症治疗目标。在目前的研究中，我们问是否ampk与ck诱导的细胞凋亡相关。我们已经找到了ck在ampk活化和诱导细胞凋亡的影响，ck-诱导细胞凋亡迟钝是在ampk的抑制蛋白（化合物c）的存在下或小分子rna对ampk的干扰。另外，ck-诱导的ampk磷酸化被camks抑制剂，sto609阻止。这些发现表明，camk-iv/ampk通路与在ht-29细胞中的ck诱导细胞凋亡联合，探讨结肠癌的潜在目标。材料与方法化学品。ck是从中央研究中心，ilhwa药业有限公司（九里，韩国）获得，溶解于0.1的二甲基亚砜（dmso）。camk-iv的抗体，磷酸ampk，丝氨酸/苏氨酸磷酸化，乙酰辅酶a羧化酶（acc），ampk磷酸化acc，裂解的半胱天冬酶3，半胱天冬酶8的，和半胱天冬酶9购自细胞信令科技（富康，ma）；抗肌动蛋白，bid蛋白，bcl-2，parp，ampkr，rna干扰，对照sirna，核糖核酸酶，蛋白a/ g琼脂糖珠购自圣克鲁斯生物技术（加利福尼亚州圣克鲁斯）;sirna转染试剂是从公司（genlantis圣地亚哥，ca）。化合物c和sto-609自calbiochem购买（德国达姆施塔特）。蛋白质提取和ecl试剂盒是内含生物技术公司（富康，ma）提供的。其它试剂和化学品均为分析纯。细胞培养和全细胞裂解液的制备。人类结肠癌ht-29细胞系购自韩国细胞系银行（韩国首尔）。ht-29细胞培养于含10胎牛血清，100单位/毫升青霉素，100g/ ml的链霉素加入rpmi（gibcobl，大岛，ny），并保持在37下含有5co2，.95空气的气氛中。为了制备全细胞裂解物，以检测磷酸化，细胞用冰冷的磷酸盐缓冲液盐水（pbs）冲洗，并且用蛋白质提取试剂盒进行裂解。不溶性蛋白质通过在10000g的离心加速度下离心20分钟去除，细胞裂解液中的蛋白质浓度测定是使用bio-rad公司的蛋白质测定套件（大力士，ca）。细胞周期分析。后处理，通过低-速离心收集漂浮和贴壁细胞，并在pbs中洗涤，固定在70的乙醇于4下过夜。乙醇固定的细胞在37下重新悬浮于含0.1mg/ml的核糖核酸酶的pbs中30分钟。颗粒细胞随后用50g/ ml的碘化丙啶（pi）在室温下染色 30分钟。用bdfacscalibur流式细胞仪（bd biosciences公司的分析，加利福尼亚州圣何塞市）分析每个细胞的dna相对含量。免疫共沉淀。300微克细胞裂解液用蛋白a / g琼脂糖珠预处理，上清液在4下用camk iv抗体培养4小时。然后将反应混合物与蛋白a/ g琼脂糖珠混合，在4下培养2小时，并在1000g下离心1分钟，将沉淀收集。将沉淀物用pbs洗涤两次；加入1十二烷基硫酸钠（sds）的缓冲液煮沸1分钟，然后收集上清液。用免疫印迹检测磷酸化的camk-iv。亚细胞分离。准备细胞核和细胞质组分的方法从以前的报告（11）中做出了修改。ht-29细胞用冰冷的pbs洗涤，再悬浮在含250毫米蔗糖的冰冷的裂解缓冲液20mm的n-2-羟乙基哌嗪-no-2-乙磺酸（hepes）-koh，ph值为7.0，10mm的氯化钾，1.5mm的氯化镁，1mm的乙烯 - 二胺四乙酸（edta），1 mm的乙二醇双（2 - 氨基乙基醚）-n，n，no，n0-四乙酸（egta），1mm二硫苏糖醇（dtt），0.1mm的苯甲基磺酰氟（pmsf），10g/ ml的胃蛋白酶抑制剂和含亮肽素 30分钟。在此期间，用超声波处理细胞3次。在3500g的离心加速度下离心10分钟后，收集上清液（细胞质中）并储存在-70下以备分析。颗粒部分（细胞核）被一种蛋白质提取试剂盒增溶，并在4时在3500g的离心加速度下离心20分钟。收集上清液，并贮存于-70下以备分析。免疫印迹分析。等量蛋白（40微克/车道）是通过10sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）解决的，转移到聚偏二氟乙烯膜（millipore公司，比尔里卡，ma），用适当的小学和辣根标记二次抗体，如前面所述（12）。抗肌动蛋白抗体被用作装载控制。通过增强化学发光法，密度分析和量化，免疫反应带实现可视化。rna干涉。要打掉的内源性ampkr，根据制造商的建议，ht29细胞瞬时转染用10 nm靶向ampkr1/2的化学合成sirna，或与非沉默对照sirna。转染的细胞用于免疫印迹分析。统计分析。结果代表至少有三个独立的实验一式三份进行，并表示为平均标准误差（se）。使用学生的t检验进行组间比较分析，并且当p0.05，认为是显著不同的。图1. ck的化学结构式结果ck诱导ht-29细胞凋亡。要评估ck对人结肠癌细胞的增殖的效果，我们使用流式细胞仪定量分析其细胞周期分布来研究ck处理的人结肠癌细胞群的凋亡特征。ht-29细胞分别用ck在10，25，和50m下处理24小时，并且和未经处理的进行对照。如在图2a中所示，在ht-29细胞中细胞凋亡亚g1分数从10.33上升到36.48，而对照组中只有3.25的细胞处于亚g1阶段。这些结果表明，ck诱导ht-29细胞中的细胞凋亡。ck通过线粒体依赖性途径诱导细胞凋亡。在化学诱导的细胞凋亡中，线粒体在细胞凋亡保证通过细胞色素c依赖或独立的途径中发挥核心作用。为了阐明在ht-29细胞ck诱导细胞凋亡的分子机制，我们考察了与细胞凋亡相关的蛋白质的表达。ht-29细胞分别用50m ck处理24小时（图2b）或暴露于指定浓度的ck中24小时（图2c）。我们的数据表明，ck诱导从线粒体释放细胞色素c到胞浆，并且细胞凋亡诱导因子（aif）从细胞质向核有时间和浓度依赖性。胱天蛋白酶3，聚（adp-核糖se）聚合酶（parp），bid蛋白酶，细胞色素c的知名下游分子，也被贴上时间和浓度依赖性。与此相反，b-细胞cll/淋巴瘤2（bcl2基因）蛋白，即一种抗凋亡分子的表达的时间和浓度依赖性下降。这些数据表明，ck通过细胞色素c依赖和独立的途径诱导线粒体依赖性细胞凋亡。ck通过激活ampk诱导细胞凋亡。几份报告表明，ampk激活可导致在许多人类癌症细胞诱导细胞凋亡（13-15）。因此，我们调查ampk的磷酸化是否是ck诱导的。ht-29细胞用50m的ck处理长达24小时，并且暴露在特定浓度的ck中24小时。在与基础水平（0时间）的对照中，ck在时间和浓度的依赖性上显著刺激ampk的磷酸化（板a和b图3）。没有任何改变的ampkr内源性表达被利用ampkr2抗体指出用免疫印迹。acc磷酸化，即ampk主要下游蛋白磷酸化的时间和浓度依赖性，确定ampk的激活。如果ampk的活化与ck的细胞毒活性相关，用ampk抑制剂化合物c阻断ampk激活，应该会钝化ck的细胞毒作用。为了确认癌细胞中ck活化的ampk是否是负责诱导细胞凋亡的，ht-29细胞分别用化合物c处理（10-20m）。用化合物c预处理的ht-29细胞显着减弱ampk的磷酸化和acc的浓度依赖性（图3c）。如图3d所示，ck诱导的细胞凋亡被化合物c完全废止。这些结果表明，ampk的激活是与诱导细胞凋亡相关联的。ampk调节的ck-诱导的凋亡信号通路。接下来，我们检查是否是ck-诱导激活ampk与细胞凋亡蛋白的表达相关联。如图3中的e和f小组所示，ck-诱导激活的aif和细胞色素c-依赖的促凋亡分子，例如细胞色素c的半胱天冬酶3，半胱天冬酶8，半胱天冬酶9和parp，在化合物c的存在下被显著抑制。相反，ck-诱导降低bcl2和bid蛋白表达由化合物c治疗逆转。为了进一步证实ampk在细胞凋亡中的作用，我们用sirna撞倒在ht-29细胞内的ampk。ampk的sirna转染后或控制48 h后，用50m ck处理ht-29细胞24小时。与对照组相比，ampk的sirna转染显著降低ampk的表达（图4a）。正如预期的那样，用半胱天冬酶依赖和独立的途径调制凋亡信号击倒ampk表达的sirna（图4小组b和c）。图4d表明ampk基因敲除的细胞毒活性降低。因此，我们可以得出结论，ck通过在ht-29细胞中激活ampk诱导线粒体介导的细胞凋亡。图2. ck对在ht-29结肠癌细胞中细胞死亡的影响。细胞在ck浓度不断增加情况下培养24小时，然后用碘化丙啶染色，流式细胞仪分析dna含量。数据由30000个事件得到，并且被表示为在亚g1期细胞的百分比。数据取三个独立实验的平均值（*,p0.001与对照组相比 ）(a)。ht-29细胞分别用50m ck处理指定的时间（b），或者不同浓度ck（10-50微米）处理24小时（c），通过使用特定的抗体运用免疫印迹分析对细胞凋亡相关蛋白的表达进行了分析。该印迹重新检测抗肌动蛋白抗体以确认平等的蛋白质负荷。图3. ampk调节ck诱导ht-29细胞凋亡。细胞分别用50m ck处理指定的时间（a），或者不同浓度ck（10-50微米）处理2小时（b）, 细胞用50 ck处理24h，用免疫印迹分析检测凋亡相关的信号分子的表达。肌动蛋白被用来作为内部控制评价的相对表达蛋白（c，e和f）。细胞凋亡由荧光激活细胞分选（facs）分析碘化丙锭染色的核（d）的dna片段化决定。数据取三个独立实验的平均值（*,p0.001与对照组相比 ）。图4. ampk的激活在ht-29细胞中ck-诱导凋亡性细胞死亡是必需的。ht-29细胞转染用sirna控制或者sirna ampk 48小时，并且暴露到50m ck中24小时。然后执行在pampk 和pacc（a），细胞色素c-依赖性蛋白的（b）或aif（c）的免疫印迹分析；并且进行细胞存活率的比较（d）。d中所示的比例尺为100m。图5. camk-iv在ht-29细胞中是一个ck-诱导ampk磷酸化的上游激酶。细胞经50m ck处理指定的时间（a）并且在用ck（b）的刺激之前用sto-609进行2小时的预培养。样品用抗camk-iv的抗体进行免疫沉淀，进而用免疫印迹分析检测thr172磷酸化。在sto-609（c）存在下ampk和acc的磷酸化形式的浓度依赖性降低。讨论 对生存相关蛋白质或激活凋亡能力蛋白质具有较强的抑制性的有前途的抗癌物质进行检查以治疗,癌症，特别是那些从天然中起源的，因为天然化合物被认为是安全的，因为他们是来自经常食用的食品。人参根，p. 人参c.a. meyer的根，已作为一个在亚洲国家的传统草药，现在广泛地用于预防和治疗的目的。最近，人参已发现有许多生物学活性，包括抗炎，抗过敏，抗糖尿病，在细胞或动物中的抗肿瘤活性（18，19）。然而，几个小组提出，人参皂甙作为是肠道细菌代谢活性形式的一个前体药物。ck是由肠道细菌形成的原人参皂苷代谢产物。虽然有抗肿瘤作用的ck已经记录在各种癌细胞中（19,20），但是在结肠癌细胞中没有与camk-iv/ampk途径相关联的的凋亡ck作用。 流式细胞仪分析显示，ck以浓度依赖的方式升高细胞凋亡的亚g1分数。然而，于基础水平相比g0/g1分数无显着差异。此外，与g1期阻滞有关的p27kipi和p21waf1/cip1，长达24小时没有改变（数据未示出）。这些结果表明，ck展品的抗肿瘤活性，是通过诱导细胞凋亡而不是细胞周期阻滞。线粒体跨膜电位介导的细胞凋亡的崩溃，在于它使细胞凋亡介质释放到细胞质中，如细胞色素c和细胞凋亡诱导因子（aif）。细胞色素c常居住在线粒体内膜空间，并且在蛋白酶依赖的细胞死亡起着核心的作用（21）。以前的研究已经报道，ck在以半胱天冬酶为中央组件中的不同癌细胞线粒体介导的细胞凋亡途径中起着重要的作用（18，22）。如图2所示，ck扰动ht-29细胞的线粒体膜，导致其释放细胞色素c和箴半胱天冬酶9的裂解，箴半胱天冬酶8，箴半胱天冬酶3，parp蛋白，表明半胱天冬酶依赖细胞凋亡。bcl2及其同系物bcl-xl，双抗凋亡因子，通常有防止线粒体膜破坏和细胞色素c和其他前凋亡因子的释放的作用；与此同时，bax/ bak状蛋白质和bid，促凋亡因子，促进这些事件（23，24）。在我们的研究中，ck下调抗凋亡bcl2蛋白的表达，而bax蛋白的表达没有改变（数据未示出）。ck也通过激活半胱天冬酶8诱导bid蛋白的裂解。截断bid（tbid）搬迁到线粒体进而进一步扰乱线粒体膜;， tbid易位使线粒体放大线粒体通路的激活（25）。ck也诱导从线粒体释放aif到细胞质和从细胞质到细胞核中的aif易位。aif在半胱天冬酶独立细胞死亡中起着核心的作用，并且在大阵列的结肠癌细胞系中观察到aif介导的细胞凋亡。aif和cyclophlin a在细胞质中的相互作用，引起aif中的dna酶的活性（26）。在细胞核内，通过静电aif（带正电）和带负电荷的dna之间的相互作用，aif优先结合dna单链。此细胞死亡的关键分子parp-1，是在dna损伤网络一个关键的有核的酶。parp-1激活时，par聚合物在细胞核中合成 并释放到细胞质中，在那里它会导致释放 aif。ampk是一个因营养匮乏和病理应激（27）而被激活保守的调节细胞代谢的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。最近的研究显示，ampk抑制细胞的生长和增殖，也正向调控细胞凋亡（28）。然而，它在细胞增殖和细胞生存的作用有不良记录和几分争议。kim等人。最近报道，ampk执行某一功能对顺铂的细胞毒作用进行保护，从而意味着ampk是确定细胞对顺铂敏感性的细胞因子之一（29）。在目前的研究，我们已经检查是否ck诱导的细胞凋亡是与ampk的活化相关联的。我们已经证明，ck在ht-29cells中刺激ampk的活化。一致的是，ck对凋亡作用的影响通过ampk抑制剂（化合物c）或sirna ampk（图3和图4）抑制ampk活性而被完全废除。这些结果表明，ampk激活是和ck诱导的细胞凋亡相关的，而且是作为细胞凋亡的正调节。我们还观察到，ck诱导的磷酸化-iv camk，ampk的上游调节子，在一个时间依赖性和camks抑制剂sto-609存在下抑制ck-诱导的ampk的磷酸化（图5c）。总之，目前的研究表明，来自人参的ck揭示了在ht-29结肠癌细胞中的分子事件，包括抑制细胞生长，诱导细胞凋亡，激活camk-iv和ampk通路。我们已经确定了作为上游调节ampk的机构之一和激活ampk的camk-iv是ck诱导细胞凋亡的关键因素。这些发现提供了分子基础或防扩散活性的ck，这似乎是一个可能的化疗或化学预防剂。 使用的缩写 ck，化合物k;ampk，amp激活的蛋白激酶;acc，乙酰辅酶a;parp，聚（adp-核糖基 - 本身）聚合酶，bcl-2和b-细胞cll/淋巴瘤2;aif，凋亡诱导因子;camk-iv，ca2+/钙调素激活的蛋白激酶-iv。参考文献(1) ferlay, j.;autier, p.; boninol, m.; heanue, m.; colombet, m.;boyle, p. estimates of the cancer incidence and mortality in europe in 2006. ann. oncol. 2007, 18 (3), 581592.(2) lee, s. j.; sung, j. h.; lee, s. j.; moon, c. k.; lee, b. h. antitumoractivity of a novel ginseng saponin metabolite in human pulmonary adenocarcinoma cells resistant to cisplatin. cancer lett. 1999, 144,339343.(3) lee,b.h.;lee,s.j.;hur,j.h.;sung,j.h.;hur,j.d.;moon,c.k.in vitro antigenotoxic activity of novel ginseng saponin metabolites formed by intestinal bacteria. planta med. 1998, 64, 500503.(4) oh, s. h.; lee, b. h. a ginseng saponin metabolite-induced apoptosis in hepg2 cells involves a mitochondria-mediated pathway and its downstream caspase-8 activation and bid cleavage. toxicol.appl. pharmacol. 2004, 194, 221229.(5) oh, s. h.; yin, h. q.; lee, b. h. role of the fas/fas ligand death recep tor pathway in ginseng saponin metabolite-induced apoptosis in hepg2 cells. arch. pharm. res. 2004, 27, 402-406.(6) yim, h. w.; jong, h. s.; kim, t. y.; choi, h. h.; kim, s. g.; song,s. h.; kim, j.; ko, s. j.; lee, j. w.; kim, t. y.; bang, y. j.cyclooxygenase-2 inhibits novel ginseng metabolite-mediated apop-tosis. cancer res. 2005, 65, 19521960.(7) hardie, d. g.; carling, d.; carlson, m. the amp-activated/snf1protein kinase subfamily: metabolic sensors of the eukaryotic cell?annu. rev. biochem. 1998, 67, 821825.(8) hardie, d. g. the amp-activated protein kinase cascade: the keysensor of cellular energy status. endocrinology 2003, 144 (12), 51795183.(9) hardie, d. g.; sakamoto, k. ampk: a key sensor of fuel and energy status in skeletal muscle. physiology 2006, 21, 4860.(10) garcia-gil, m.; pesi, r.; perna, s.; allegrini, s.; giannecchini, m.;camici, m.; tozzi, m. g. 50-aminoimidazole-4-carboxamide ribo-side induces apoptosis in human neuroblastoma cells. neuroscience2003, 117 (4), 811820.(11) kim, h. j.; mun, j. a.; chun, y. j.; choi, k. h.; kim, m. y. bax dependent apoptosis induced by ceramide inhl-60cells.febslett.2001, 505, 264268.(12) kim, s.g.;jong,h.s.;kim,t.y.;lee,j.w.;kim,n.k.;hong,s.h.; bang, y. j. transforming growth factor 1-induces apoptosis through fas ligand-independent activation of the fas death pathway in human gastric snu-620 carcinoma cells. mol. biol. cell 2004, 15,420434.(13) sai, k.; yang, d.; yamamoto, h.; fujikawa, h.; yamamoto, s.;nagata, t.; saito, m.; yamamura, t.; nishizaki, t. a1 adenosine receptor signal and ampk involving caspase-9/-3 activation are responsible for adenosine-induced rcr-1 astrocytoma cell death.neurotoxicology 2006, 27, 458467.(14) hwang, j. t.; ha, j. h.; park, i. j.; lee, s. k.; baik, h. w.; kim, y.m.; park, o. j. apoptotic effect of egcg in ht-29 colon cancer cells via ampk signal pathway. cancer lett. 2007, 247, 115121.(15) gotlieb, w. h.; saumet,j.; beauchamp, m. c.; gu, j.; lau, s.;pollak,m. n.; bruchim, i. in vitro metformin anti-neoplastic activity in epithelial ovarian cancer. gynecol. oncol. 2008, 110, 246250.(16) woods, a.; johnstone, s. r.; dickerson, k.; leiper, f. c.; fryer, l.g.; neumann, d.; schlatttner, u.; wallimann, t.; carlson, m.;carling, d. lkb1 is the upstream kinase in the amp-activated protein kinase cascade. curr. biol. 2003, 13, 20042008.(17) hawley, d. a.; pan, d. a.; mustard, k. j.; ross, l.; bain, j.;edelman, a. m.; frenguelli, b. g.; hardie, d. g. calmodulin-dependent protein kinase kinase- is an alternative-upstream kinasefor amp-activated protein kinase. cell metab. 2005, 2, 919.(18) lee,s.j.;ko,w.g.;kim,j.h.;sung,j.h.;moon,c.k.;lee,b.h.induction of apoptosis by a novel intestinal metabolite of ginseng saponin via cytochromec-mediated activation of caspase-3 protease.biochem. pharmacol. 2000, 60 (1), 677685.(19) choi, h. h.; jong, h. s.; park, e. k.; park, s. y.; shin, h. y.; kim,d. h. a novel ginseng saponin metabolite induces apoptosis and down-regulates fibroblast growth factorreceptor 3in myelomacells.int. j. oncol. 2002, 23, 10871093.(20) wakabayashi, c.; murakami, k.; murata, j. an intestinal bacterial metabolite of ginseng protopanaxadiol saponins has the ability to induce apoptosis in tumor cell. biochem. biophys. res. commun.1998, 246, 725730.(21) li, p.; nijhawan, d.; budihardjo, i.; srinivasula, s. m.; ahmad, m.;alnemri, e. s.; wang, x. cytochrome c and datp-dependent formation of apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic pro-tease cascade. cell 1997, 91, 479489.(22) ming, y. l.; song, g; chen, l. h.; zheng, z. z.; ouyang, g. l.;tong, q. x. anti-proliferation and apoptosis induced by a novel intestinal metabolite of ginseng saponin in human hepatocellularcarcinoma cells. cell biol. int. 2007, 31 (10), 12651273.(23) gross, a.; mcdonnell, j. m.; korsmeyer, s. j. bcl-2 family mem-bers and the mitochondria in apoptosis. gene. dev. 1999, 13, 18991911.(24) kor