粪便钙卫蛋白检测试剂盒（酶联免疫法） .docx

粪便钙卫蛋白检测试剂盒（酶联免疫法）货号ek-cal 96tek-cal2 192t 用途：瑞士bhlmann公司生产的粪便钙卫蛋白检测试剂盒（酶联免疫法）用于定量检测人粪便中的钙卫蛋白（mrp8/14; s100a8/s100a9）。产品原理 本试剂盒应用双抗体夹心法，基于不同位点的两种单克隆抗-人钙卫蛋白抗体。标准品、质控品和稀释后的待测样本加入到具有高亲和力的单克隆抗-人钙卫蛋白抗体包被的微孔板微孔内。在第一次孵育步骤中，样本中钙卫蛋白被固相抗体捕获。加入酶联物后第二次孵育时，形成以下复合体：捕获抗体-人钙卫蛋白-酶标抗体结合物。接着加入tmb底物进行显色，加入酸液终止液终止显色反应，溶液变成黄色。黄色亮度与样本中钙卫蛋白浓度成正比。最后在酶标仪450nm波长处测量吸光度。做出标准品浓度对相应od值的标准曲线，在其上计算出样本浓度。试剂成分：试剂量编号说明提取缓冲液3瓶，125mlb-cal-ex直接使用微孔板 （预包被钙卫蛋白单克隆抗体）12*8孔b-cal-mp直接使用封板膜3张浓缩洗涤液（10x）含防腐剂1瓶，100mlb-cal-wb用900ml去离子水稀释孵育缓冲液含防腐剂2瓶，125mlb-cal-ib直接使用标准品1,25支，1mlb-cal-caset直接使用质控品 高值/低值2支，1mlb-cal-conset直接使用酶联物1支，12mlb-cal-el 直接使用tmb底物b-tmb12 直接使用终止液b-sts12 直接使用1 钙卫蛋白标准品从a到 e的实际浓度为4,12,40,120和240ng/ml。使用低范围检测程序时（样本用提取缓冲液1:50倍稀释，提取物再用孵育缓冲液1:50倍稀释，共稀释250倍）标准品钙卫蛋白分析浓度分别为10,30,100,300,600ug/g。如使用扩展范围检测程序时（样本用提取缓冲液1:50倍稀释，提取物再用孵育缓冲液1:150倍稀释，共稀释750倍）标准品钙卫蛋白分析浓度分别为30,90,300,900,1800ug/g。2 标准品和质控品在检测时直接使用，无需稀释。根据需要可由供应商提供的试剂粪便提取设备smart-prep 50 支b-cal-rd schebo quick- prep50 支b-cal-sofi 1.3ml，直接使用试剂储存条件和效期未开封试剂2-8度储存，失效期标注在试剂盒标签上，不要使用超过失效期的试剂盒已开封试剂提取缓冲液2-8度储存，直至失效期微孔板未使用的板条立即重新放回装有干燥剂的铝箔袋中，并封上自封口。2-8度储存，直至失效期已稀释的洗涤液2-8度储存，最多6个月孵育缓冲液2-8度储存，直至失效期标准品质控品酶联物tmb底物终止液需要但没提供的材料抽提程序10ul一次性接种环(sarstedt: 86.1562.010)15ml带帽聚丙烯管(sarstedt: 62.554.502)层流工作站多管旋涡混合器精密天平(10 - 150毫克)小型离心机（3000 g）elisa程序10、100及1000ul移液器及配套吸嘴用于样本稀释的一次性试管用于稀释洗涤液的1000ml量筒用于洗板的洗板机或塑料挤瓶吸水纸酶标仪（450nm）注意事项：安全措施试剂盒内的微孔板、标准品和校准品还有人源性成分，尽管已经过检测，hbv表面抗原、hcv以及hiv1/2均为阴性，但仍然应视为有潜在传染性的物质对待，遵守实验室规程并采取适当的防护措施。底物和终止液：tmb底物还有联苯胺、h2o2以及二甲基甲酰胺，终止液含有硫酸（0.25m），这些试剂都会刺激眼睛、皮肤和黏膜，避免试剂接触眼睛、皮肤并穿着合适的防护服、手套、和眼镜。如试剂接触到眼睛和皮肤，应立即用清水冲洗。未使用的溶液必须按当地法规进行处理。技术措施试剂盒组件不要使用超过标签上所示有效期的试剂盒不要混合不同批号的试剂避免试剂、样本和孔间的交叉污染使用前将试剂恢复到室温并混匀微孔板不可重复利用提取为了获得准确的定量结果，必须将加入到提取缓冲液中的已称重的所有粪便样本变成匀浆。要避免样本残留在管帽处。样本提取时最短需要5分钟可获得有浑浊的液体，延长离心时间可以减少或消除浊度，但试验表明浊度对elisa的定量结果无影响。elisa过程为获取可重复的准确结果，清洗步骤是必不可少的。洗涤液加入到每个检测孔后，每次必须至少孵育20秒，洗板次数也要按照要求进行。如使用自动洗板机，强烈建议使用“板模式”，可缩短孵育时间。检测板震荡参数：400-600转/分（10hz）。建议标准品、校准品和标本做复孔，每次实验都必须使用本次新做的标准曲线。如果某个未知样本的检测到的浓度比最高的标准品浓度还要高，则需要将这个未知样本进一步稀释并重新检测，由此产生的稀释系数必须体现到计算结果中。样本采集和储存提取程序需要的粪便样本量为50-100mg将粪便样本放入试管中，在2-8度可储存6天粪便样本冷冻后，钙卫蛋白的浓度会略有上升。因此，如需长期保持，建议将提取物储存于-20度，可保存至少4个月。重要提示：样本收集装置不可含有其它生物或化学成分。试验过程提取标准提取程序1、 将接种环和贴上标签的空pe管称重2、 用接种环将50-100mg的粪便样本加入到pe管内3、 估算样本的净重4、 向管中加入提取缓冲液（样本净重的49倍），并盖紧管子。粪便重量（mg）提取液体积（ml）502.5552.7602.9653.2703.4753.7803.9854.2904.4954.71004.95、 将样本管放入多孔漩涡混匀器，用最高速充分震荡30分钟，使样本变成匀浆。6、 将匀浆转移到2ml的微量离心管，放入微型离心机，用3000xg离心5分钟。7、 将上清转移到干净的，贴有标签的管内，可直接用于后续的elisa试验或放入-20度或以下储存4个月以上。使用粪便提取装置进行提取粪便提取装置的操作请参见各装置的说明书。1、 罗氏粪便提取装置（产品代码10745804 322）或bhlmann smart-prep (产品代码: b-cal-rd)：提取时间（漩涡时间）可缩短到1分钟。2、 scheboquick-preptm（产品代码： b-cal-so50）：提取管已预装提取缓冲液，提取时间（漩涡时间）约10分钟。提取后，用3000xg离心5分钟，或先将匀浆转移2mlpe管后再用3000xg离心5分钟。 将上清转移到干净的，贴有标签的管内，可直接用于后续的elisa试验或放入-20度或以下储存4个月以上。elisa 过程根据样本中钙卫蛋白的预期浓度，试验可选择两种不同的程序：低浓度范围程序和扩充范围程序。样本浓度不超过600ug/g，选择低范围浓度程序，将样本1:50倍稀释，工作范围10-600ug/g；如果样本浓度超过600ug/g，选择扩充范围浓度程序，将样本1:150倍稀释，工作范围30-1800ug/g。低范围elisa程序工作范围 10-600ug/g使用前将试剂平衡到18-28度1、 将粪便提取物用孵育缓冲液1：50倍稀释（例如20ul提取物加980ul孵育缓冲液）并混匀，并保证在18-28度平衡至少5分钟再进行步骤4c的操作。2、 根据标准品、校准品和样本的数目取出足够的板条，将剩余板条立即放入铝箔袋中并密封后放入冰箱冷藏。3、 用洗涤液洗涤包被孔两次，每次每孔300ul，甩干并在在吸水纸上轻轻拍干。重要提示：必须确保洗涤液每次加入到检测孔后至少孵育20秒再进行下一步操作。4a、第1孔加入100ul孵育缓冲液（空白），将标准品a-e各取100ul依次加入到各自孔内。4b、取低、高值质控品各100ul依次加入到各自孔中。4c、将已1:50倍稀释的样本依次加入到后续孔内。5、 用封板膜将检测板密封，放在400-600转/分钟的水平振荡器上，于18-28度孵育30（+5）分钟。6、 移除封板膜，甩干并用洗涤液洗板三次（每孔至少300ul洗涤液），甩干并在吸水纸上轻轻拍干。7、 每孔加入100ul酶结合物。8、 用封板膜将检测板密封，放在400-600转/分钟的水平振荡器上，于18-28度孵育30（5）分钟。9、 移除封板膜，甩干并用洗涤液洗板五次（每孔至少300ul洗涤液），甩干并在吸水纸上轻轻拍干。重要提示：确认tmb底物已平衡到18-28度。10、 每孔加入100ultmb底物。11、 用封板膜将检测板密封，放在400-600转/分钟的水平振荡器上，于18-28度避光孵育15（2）分钟。12、 每孔加入100ul终止液，用吸嘴移除孔内气泡，并在30分钟内进行第13步操作。13、 将检测板用酶标仪读数（波长450nm）结果工作范围 10-600ug/g标准曲线：检测结果包含标准品和空白孔在450nm的吸光度（od），将标准品的吸光度减去空白的od，用半对数坐标纸（lin/log）绘制吸光度（y轴）和标准品钙卫蛋白浓度（x轴），得到最佳拟合曲线和采用四参数拟合方式计算标准曲线。标本和质控品：将样本和质控品在450nm的吸光度将去空白od，再根据标准曲线可求出标本或质控品的浓度。 使用低范围elisa程序时，标准品的分析浓度为10,30,100,300,600ug/g。如果额外稀释，必须将结果乘以稀释因子才能得到最终结果。性能特点试剂盒的性能特点根据重复试验确定工作范围 10-600ug/g批内精密性：4.7%批间精密性 15%检测极限：10 ug/g检出限：10 ug/g稀释线性：103%交叉反应性：0.1%扩充范围elisa检测程序工作范围 30-1800ug/g使用前将试剂平衡到18-28度通过将样本稀释倍数从1:50调整到1:150，工作范围可扩充3倍。如果样本的钙卫蛋白预期浓度很高，推荐采用此程序。1、 将粪便提取物用孵育缓冲液1：150倍稀释（例如20ul提取物加980ul孵育缓冲液）并混匀，并保证在18-28度平衡至少5分钟再进行步骤4c的操作。2、 根据标准品、校准品和样本的数目取出足够的板条，将剩余板条立即放入铝箔袋中并密封后放入冰箱冷藏。3、 用洗涤液洗涤包被孔两次，每次每孔300ul，甩干并在在吸水纸上轻轻拍干。重要提示：必须确保洗涤液每次加入到检测孔后至少孵育20秒再进行下一步操作。4a、第1孔加入100ul孵育缓冲液（空白），将标准品a-e各取100ul依次加入到各自孔内。4b、取低、高值质控品各100ul依次加入到各自孔中。4c、将已1:50倍稀释的样本依次加入到后续孔内。、5、用封板膜将检测板密封，放在400-600转/分钟的水平振荡器上，于18-28度孵育30 （+5）分钟。6、 移除封板膜，甩干并用洗涤液洗板三次（每孔至少300ul洗涤液），甩干并在吸水纸上轻轻拍干。7、 每孔加入100ul酶结合物。8、 用封板膜将检测板密封，放在400-600转/分钟的水平振荡器上，于18-28度孵育30（5）分钟。9、 移除封板膜，甩干并用洗涤液洗板五次（每孔至少300ul洗涤液），甩干并在吸水纸上轻轻拍干。重要提示：确认tmb底物已平衡到18-28度。10、 每孔加入100ultmb底物。11、 用封板膜将检测板密封，放在400-600转/分钟的水平振荡器上，于18-28度避光孵育15（2）分钟。12、 每孔加入100ul终止液，用吸嘴移除孔内气泡，并在30分钟内进行第13步操作。13、 将检测板用酶标仪读数（波长450nm）结果工作范围 30-1800ug/g标准曲线：检测结果包含标准品和空白孔在450nm的吸光度（od），将标准品的吸光度减去空白的od，用半对数坐标纸（lin/log）绘制吸光度（y轴）和标准品钙卫蛋白浓度（x轴），得到最佳拟合曲线和采用四参数拟合方式计算标准曲线。标本和质控品：将样本和质控品在450nm的吸光度将去空白od，再根据标准曲线可求出标本或质控品的浓度。 使用扩充范围elisa程序时，标准品的分析浓度为30,90,300,900,1800ug/g。如果额外稀释，必须将结果乘以稀释因子才能得到最终结果。性能特点试剂盒的性能特点根据重复试验确定工作范围 10-600ug/g批内精密性：4.0%批间精密性 1