《灭菌steriliza》PPT课件.ppt

第三章 灭菌(sterilization) n灭菌的原理及方法 n培养基和发酵设备的灭菌工艺 n 空气除菌 n灭菌：指用化学或物理的方法杀灭 或去除物料及设备中所有生命物质 的技术或工艺过程。 第一节 灭菌的原理及方法 n一 几种常见的灭菌方法 1 化学物质灭菌 原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使 蛋白质变 性酶失活。 常用的灭菌剂: 使用范围： 器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌， 不能用于培养基灭菌 常用的灭菌剂 化学物质名称有效浓度化学物质名称有效浓度 新洁尔灭(苯扎溴铵)0.25%甲醛37% 杜灭芬0.25%戊二醛2% 高锰酸钾0.1%-0.25%苯酚0.1%-0.15% 漂白粉5%过氧乙酸0.02%-0.2% 酒精75%焦碳酸二乙酯0.01%-0.1% 煤酚皂（来苏尔）1%5% * 2. 辐射灭菌 n原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸 的光化学反应造成菌体死亡。 n常用：紫外线、X射线和射线。 n使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌 3干热灭菌 n原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变 性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。 n常用方法：灼烧和电热箱加热，140-180 1-2小时 n 使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌 4湿热灭菌 n原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力 ，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。 n常用方法： 水煮常压灭菌：100 饱和蒸汽灭菌：一般121，30分钟 n使用范围：培养基和发酵设备灭菌。 5过滤除菌 n原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。 n方法: 0.010.45 m孔径滤膜， n使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他 不耐热化合物溶液除菌。 二. 湿热灭菌原理 n1.生物热死动力学（对数残存定律） dN / dt =- K N N：菌体个数（个） t : 灭菌时间（min） k：反应速度常数（min-1） dN / dt: 菌受热死亡速率(个/min) Ln N/ N0 = - K t N= N0 e- K t 以菌的残留数Ln N/ N0的对数与时间t 作 图，得出一条直线，其斜率为- K （ P222 图14-1） 如何通过实验根据对数残存定律确定某一 温度,某一微生物的K ？ 1). K 与菌种的特性有关 相同温度下，微生物越耐热， k值越小。 相同温度下，微生物越不耐热，k值越大。 2 .反应速率常数K 2). K 与灭菌温度有关 K=A e E / RT （阿累尼乌斯方程） Ln K =Ln A- E/ RT A：比例常数 R：气体常数(J/ mol K) T：绝对温度( K) E：杀死细菌所需的活 化能（J/ mol） 121 118115 110 105 第二节 培养基和发酵设备的灭菌工艺 n一培养基灭菌时间的选择 t =1/ k * Ln( N0/ N) 其中 K：一般耐热的细菌芽孢的K值 N0 ：细菌及芽孢数之和 N：10 -3 二. 培养基灭菌温度的选择 选择即能达到灭菌要求， 又保证营养成分不被破坏的温度 n1.培养基营养成分破坏动力学方程 -dC/dt = K C -dC/dt :营养物降解速度 mol / L h C: 营养物浓度 mol / L K : 营养物降解反应速度常数 1 / s t ：时间( S ) Ln (C/ C0 ) = - K t K = A e- E/ RT Ln K =Ln A- E/ RT A：比例常数 R：气体常数(J/ mol K) T：绝对温度( K) E：营养物破坏所需的活化能（J/ mol） 2.根据实验结果灭菌活化能大于培养基破 坏活化能 E E P225 表14-11 3. 灭菌反应营养物破坏反应 T1 Ln K1 =Ln A- E/ RT1 Ln K1 =Ln A- E/ RT1 T2 Ln K2 =Ln A- E/ RT2 Ln K2 =Ln A- E/ RT2 Ln ( K2/ K1) = E/ R(1/ T1- 1/ T2 ) Ln ( K2 / K1 )= E/ R(1/T1- 1/T2) Ln( K2/ K1) = E Ln ( K2 / K1 ) E Ln ( K2 / K1) Ln ( K2 / K1 ) K2 / K1 K2 / K1 当温度升高时微生物死亡速度常数比营养物质降解速 度常数变化得大 4达到相同灭菌效果，T越高，K越大，所需t 越短，采用高温短时（HTST）灭菌效果好 n 三 影响灭菌效果的因素 n微生物种类：不同的微生物k值不同。 n初始菌量：在保持N值不变的前提下，t 与 初始菌量N0的对数成正比。 n培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐 热性。 n传热与混合状况：影响受热均匀度。 n培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。 n蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度 。 npH：酸性pH下可加快微生物热死速率 四. 培养基和发酵设备的灭菌方法 （一）实验室种子培养基灭菌方法 使用高压蒸汽灭菌锅 手提式灭菌锅。容量小。 立式或卧式灭菌锅。容量较大， 一般能装几十瓶或几百瓶。 灭菌柜。要和蒸汽锅炉配套， 用于大量种瓶培养基的灭菌， 一次能装几百至几千瓶(袋)。 四. 培养基和发酵设备的灭菌方法 n（二）分批灭菌(batch sterilization) n1定义： 将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽 加热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭 菌方式。 n 2操作过程： 空罐准备：清洗、检修和检测。 升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。 保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。 冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度 。 温度随灭菌时间的变化 三路进汽：直接蒸汽 从通风、取样和出料 口进入罐内直接加热 ，直到所规定的温度 ，并维持一定的时间 。这就是所谓的“三 路进气”。 * 四路出汽：直接蒸汽 从排气、接种、进料 和消沫剂管排气 分批灭菌设备示意图 n 三）连续灭菌(continuous sterilization) 1定义：将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连 续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌 方式。 2流程： 1)由热交换器组成的灭菌系统 2)蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统 3）由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统 由热交换器组成的灭菌系统工艺流程图 温度随时间的变化 蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统 温度随灭菌时间的变化 由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统 三）连续灭菌与分批灭菌的比较与选择 分批灭菌 优点： 1不需附加设备 2 蒸汽利用率高 3 节约劳动力 缺点 1 培养基质量比较差 2 罐的利用率低 3. 冷却水用量大 连续灭菌 优点： 1 采用高温快速灭菌法 2可以把培养基按其性质分开灭菌 3 有利于自动控制 4 节省冷却水 缺点 1 投资费用高 2 对物料要求高 3 蒸汽用量大 选择原则： 1 培养基成份（易降解成分、液化情况等） 2 设备状况（冷却面积、传动装置等） 3. 动力条件 四、高温对培养基成分的有害影响及其防止 消除高温有害影响的措施 n（1）采用特殊加热灭菌法(连续灭菌方法 ） n（2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时， 应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并 ； n（3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先 作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷 酸盐沉淀； n（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基 （如含糖组合培养基）可进行低压灭菌 第三节 空气除菌 n一、无菌空气的要求 n1 .空气中的微生物 空气中的微生物种类以细菌和细菌芽孢较多， 也有酵母，霉菌孢子和病毒。 这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰 尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为 103104个米3。 灰尘粒子的平均大小约0.6m左右，所以空气 除菌主要是去除空气中的微粒(0.6-1m ） 第三节 空气除菌 n一、无菌空气的要求 n无菌空气的标准 百分数：99.99 美国联邦宇航局等级标准： 100级（直径小于0.5微米粒子数少于3.5个/L ） 温度：25 40 湿度：30%45% 1. 纤维或颗粒介质填充床过滤器： 棉花、玻璃纤维、腈纶、涤纶、 维尼纶或活性炭等 2.折叠式硼硅酸超细纤维过滤器： 超细玻璃纤维 3.烧结金属、陶瓷过滤器 n二 介质除菌： 原理：过滤介质填充到过滤器中，空气流过时借助惯 性碰撞、阻截、扩散、静电吸附、沉降等作用将尘埃 微生物截留在介质中，达到除菌的目的。 主要设备：填充床过滤器 发酵生产中制备无菌空气的大致过程 空气空气介质除菌流程流程 高空取气管是远离地面几十米 的管子。一般而言，地面附近 空气中所含的 微生物和灰尘等 均比高空空气中含的多，据资 料介绍，每升高10米，空气中 杂菌可降低一个数量级，因此 从高空取气要比从低空取气有 利得多。 两级分离、冷却、加热的空气除菌流程 粗过滤器