高效降酚菌的筛选及降酚性能的研究.doc

目录目录摘要.Abstract.目录. 目录第一章 绪论11.1 酚对水质的污染概况11.2 微生物降解法处理含酚废水的研究进展11.2.1 活性污泥法21.2.2 酶处理技术21.2.3 厌氧好氧生物处理法21.2.4 生物流化床法21.2.5 固定化法31.2.6 厌氧生物处理法31.3 高效苯酚降解菌株的研究现状41.4 苯酚降解菌的种类和代谢途径51.4.1 酚降解菌的种类51.4.2 微生物代谢苯酚的途径51.5 课题的来源与意义61.6 研究目的、主要内容与技术路线71.6.1 研究目的和主要内容71.6.2 研究的技术路线7第二章 苯酚降解菌的分离纯化和筛选82.1 实验材料82.1.1 实验主要仪器82.1.2 实验用培养基82.2 实验方法92.2.1 苯酚浓度的测定92.2.2 微生物生长量的测定102.2.3 样品的采集102.2.4 降酚菌的富集培养102.2.5 降酚菌的分离、纯化102.2.6 苯酚降解菌株的筛选112.2.7 高效降酚菌株的驯化112.3 结果与分析112.3.1 苯酚标准曲线的绘制112.3.2 微生物生长量的测定122.3.3 降酚菌的富集培养132.3.4 降酚菌的分离与纯化132.3.5 苯酚降解菌株的筛选142.3.6 苯酚降解菌株的驯化152.4 小结15第三章 菌株HC7的初步鉴定163.1 实验材料163.1.1 实验仪器163.1.2 实验用培养基、主要试剂及染色液163.2 实验内容183.2.1 细菌培养特征观察183.2.2 菌株形态特征观察193.2.3 菌株生理生化特性研究203.2.4 HC7菌株的生长特性研究203.2.5 菌株的保藏213.3 结果与讨论213.3.1 细菌培养特征213.3.2 菌株形态特征213.3.3 菌株生理生化特性233.3.4 HC7菌株的生长特性研究233.3.5 HC7 菌株的保藏243.4 小结24第四章 HC7菌株降解苯酚特性的研究254.1 实验材料254.1.1 实验仪器254.1.2 培养基种类及组分254.2 实验内容264.2.1 主要环境生存因子对HC7菌株降解苯酚的影响264.2.2 培养基主要成分对HC7菌株降解苯酚的影响264.2.3 接种量对苯酚降解的影响274.2.4 不同苯酚浓度下HC7菌株的降解274.2.5 单一菌株、混合菌株降解苯酚能力比较274.3 结果与分析274.3.1 主要环境生存因子对HC7菌株生长及降解苯酚的影响274.3.2 培养基主要成分对HC7菌株生长及降解苯酚的影响304.3.3 接种量对苯酚降解的影响324.3.4 不同苯酚浓度下HC7菌株的降解334.3.5 单一菌株、混合菌株降解苯酚能力比较334.4 小结34结论35致谢36参考文献37附件.381.茂名学院毕业论文选题表2.茂名学院毕业设计(论文)任务书3.毕业论文开题报告4.毕业论文文献综述5.毕业论文外文翻译及原文 第一章 绪论第一章 绪论1.1 酚对水质的污染概况酚是原浆毒物，属于高毒物质，它可以通过与皮肤粘膜的接触、吸收和经口服而侵入体内，与细胞原浆质蛋白形成不溶物，使细胞失去活力，高浓度酚可使蛋白质凝固及引起组织损伤、坏死，而且，酚还能继续向深部渗透，引起深部组织损伤、坏死，直至全身中毒1。水中含低浓度(0.1 mg/L0.2mg/L)酚时，可使其中生长的鱼带有异味，高浓度(5 mg/L)则造成其中毒死亡，甚至绝迹。酚还可大大抑制水体中其他生物(如细菌、海藻、软体动物等)的生长。用未经处理的含酚废水(50 mg/L)直接灌溉农田，会使农作物枯死和减产。特别是在播种期和幼苗发育期，幼苗因抵抗力弱，酚水会使其霉烂。当饮用水中含酚0.002 mg/L 0.015mg/L时，加氯消毒会产生毒性更大的氯酚，具有恶臭味，严重影响饮用水的质量。此外，由于含酚废水的的耗氧量高于普通水，会造成水体的氧平衡受到严重破坏。随着世界经济的飞速发展，工农业对酚的需求量也迅速增加，由于许多不达标的含酚废水直接排入江河等水体中，导致环境污染日益严重。含有酚类物质的废水来源广泛，它主要来自于石油、炼焦、木材加工及化学合成等工业排放的废水，除工业废水外，生活污水和粪便在分解过程中产生的酚类化合物也是水体中酚污染的主要来源。茂名建市前,小东江清澈见底、鱼虾成群。1958年建市以后,市区以下的小东江河水,受到工业污染,己无法食用,造成沿江两岸群众饮水困难。根据1999年和2002年两次调查的结果,小东江水质已被严重污染,情形不容乐观2，其中，每年流入小东江的酚类物质就高达2.454吨，这些酚类物质主要来自于茂名石油化工公司、热电厂、柴油机发电厂及市区生活污水，因此，除酚是污水处理工程的一项重要内容。1.2 微生物降解法处理含酚废水的研究进展目前，清除废水中酚的方法主要有化学法、物理法和生物法，与物理、化学法相比，生物法不仅经济、安全,而且处理的污染物阈值低、残留少、无二次污染,其应用前景看好，它是我国含酚废水无害化处理的主要方法。当废水中含酚量在5mg/L500mg/L时,适用于生物法处理,生物法处理所用的微生物主要有细菌、真菌和藻类等。它是利用微生物新陈代谢的作用,使废水中的酚类物质被降解并转化为无害的物质。生物法具有应用范围广、处理能力大、设备简单等优点，但生物处理过程中受废水的pH值、温度、含酚量等因素的影响较大,所以对操作条件要求比较严格。目前，处理含酚废水的生物处理技术有以下方面：1.2.1 活性污泥法由于许多好氧菌及微生物可利用苯酚作为生长的碳源，因此，活性污泥法是常用的除酚方法，因为它有较高的处理效率，同时又易于操作，但该法同时也存在运行管理要求高、对毒物承受能力低、不适应冲击负荷、曝气池容积负荷低、污泥产生量大等不足之处，对组成复杂、浓度较高的含酚废水处理效果不理想。活性污泥中含有大量的细菌和原生动物，这些微生物通过自身的新陈代谢，分解和降解水中的有机物，使有机物转化为无机物。污水中溶解的有机物(如酚、苯)，渗透过细菌的细胞膜为细胞所吸收，固体和胶体的有机物则是在细菌细胞外由细菌所分泌的酶分解成溶解物质，然后渗透入细菌细胞，细菌通过自身的生命活动(氧化还原、合成等)把有机物分解、氧化，部分合成自身细胞物质。酚类在微生物分解下最终氧化成二氧化碳和水。宋波3等对南充市郊炼油厂活性污泥进行富集、驯化，筛选得到2株能以苯酚作为唯一碳源和能源生长的菌株,在苯酚质量浓度500mg/L)过去一直采用物理回收处理，但由于存在溶剂损失、吸附剂再生困难等原因而不经济，并且还会产生二次污染，因此，当今的研究已建议放弃这种回收而倾向于推行更为完整的处理系统。而传统的生物法大多是对自然界生长的微生物群体经驯化、繁殖后利用，但对酚类等毒性物质，仅靠从自然界获得的菌株，往往降解活性有限，不能较好地适应冲击负荷的变化等，因此投加经过筛选的具有特殊分解能力菌株的投菌法受到了人们的青睐13。吴培诚14等从被含酚废水污染的土壤中分离筛选到一株苯酚琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii )，能以苯酚为唯一碳源生长，16h内可完全降解600 mg/L；徐玉泉，张维15等从工业废水中分离到一株高效降解苯酚菌株醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus )，其最高苯酚降解率为394nmo1/(mg. min)；杨光、向阳16等从化工废水污染的土壤中筛选分离到一株假单胞菌(Pseudomonas sp. )，在24h内可完全降解浓度为600 mg/L；陈明，张维17等从炼油厂污水中分离的醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)在24h内完全降解苯酚的浓度为300mg/L；高平平，陈迎春18等用未经处理的含酚焦化工业废水为基础培养基，采用平板涂布法分离到Alcaligenes faecalis、Arthrobacter mcotianae、Klebsiella sp.和 Ochrobactrum sp等四株菌，均能在苯酚浓度为500mg/L800 mg/L的唯一碳源的培养基上生长；周群英19等人从焦化废水中筛选出了12株高温降酚菌株，在温度为6068下，含酚量为1000mg/L的情况下进行实验研究，它们的降酚率从12%100%不等；钟文辉等20从土壤中分离到两株能以2, 4二氯酚为唯一碳源和能源生长的、具有降解2, 4二氯酚能力的假单胞菌属细菌GT241-1和GT141-2，在最适温度2530下,能将60100mg/L的2, 4二氯酚分别降解到812mg/L和2530 mg/L；向述荣等21对分离筛选到的一株高效苯酚降解菌phen8(假单胞菌)的降解特性进行了分析,结果表明,在苯酚初浓度为0mg/L588 mg/L时,苯酚降解菌phen8的菌体密度和降解率与培养基中的苯酚初浓度成正比。通过筛选菌株，引入高效降解活性菌株能提高含酚废水的降解率，但如何使这些优良菌株长期在生物处理系统中占优势，并保持其高降解性是研究者们要解决的主要问题，而且提高降解速率是生物处理含酚废水的一个关键问题，因此有必要进行高效降解菌株的筛选培养，研究这些高效菌株的降解特性，确定其最佳的生长条件。但是，已报道的各种降解苯酚菌的降解时间较长，耐苯酚浓度较低(最高1000 mg/L)，因此有必要继续寻找降解时间短而耐酚浓度高的高效降酚菌，为有效、经济处理含酚废水打下基础。1.4 苯酚降解菌的种类和代谢途径1.4.1 酚降解菌的种类近几十年来,研究者们已从该类物质长期污染的环境中或相应的活性污泥中分离到大量的能降解酚类化合物的微生物。这些微生物主要包括: (1)细菌类，如根瘤菌(Rhizobia)、醋酸钙不动杆菌(A. calcoaceticus)、假单胞菌(Pseudonomonas. sp)、真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)、反硝化菌(Denitrifiying bacteria)、黄杆菌(Flavobacterium )、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepaciaps )、罗尔斯通菌(Ralstonia)、红球菌(Rhodococcus)等，其中假单胞菌是降解酚类化合物最常见的微生物,不仅能降解多种氯酚,而且能降解氯苯、多氯联苯、硝基苯和多环芳烃等近100种有毒物质； (2)丝状真菌类，如镰刀菌(Fusarium)、白腐真菌(Phanerochaete)、青霉菌(Penicillium )等；(3)酵母菌类，如假丝酵母菌(Candida)、麦芽糖假丝酵母(Landidamaltosa)、皮状丝孢酵母菌(Trichosporon cutaneum)等。在以上的微生物中，主要以好氧微生物为主。1.4.2 微生物代谢苯酚的途径一般来说,细菌体内存在着分别编码两条苯酚代谢途径的基因,即编码间位途径酶的基因和编码邻位途径酶的基因。在好氧菌中，苯酚羟化酶基因是降解苯酚的关键基因，苯酚降解途径的第一个酶HO，将苯酚转化为邻苯二酚，在有氧情况下,邻苯二酚通过两个独立的代谢系统进行,如图1-1所示。邻位途径产生-酮基己二酸中间产物,间位途径产生-酮基己二酸中间产物,最后均形成三羧酸循环的中间物，通过三羧酸循环使苯酚最终降解为CO2和H2O。图1-1 微生物降解苯酚的代谢途径注：1.苯酚；2.邻苯二酚；3.2-羟基粘糠酸半醛；4.2-羟基粘酸；5.4-氧代二乙酸（-酮基二乙酸）；6.2-氧代戊乙酸；7.乙二酸；8.内酯；9.-酮基乙二酸；HO：苯酚羟化酶；C230：邻苯二酚2，3加氧酶；C120：邻苯二酚1，2加氧酶；HMSD：2-羟基粘糠酸羟化酶；4-OT：4-氧化丁烯酸变位酶；TE：顺粘糠酸内酯酶。1.5 课题的来源与意义炼油碱渣废水是在石油炼制过程中油品碱洗精制时产生的含有大量的硫化物和酚类等有毒有害污染物的碱性污水，该废水具有毒性、腐蚀性和恶臭气味，其处理是困扰我国炼油企业的一个难题，若将其中的酚类物质除去，将对环境保护产生重大的意义。1.6 研究目的、主要内容与技术路线1.6.1 研究目的和主要内容本研究的主要目的是：从含酚炼油碱渣废水生物处理装置污泥中富集、分离、纯化出高效降酚菌，进行细菌形态特征、生理生化特性鉴定和细菌降解特性及降酚能力进行研究，为生物处理含酚炼油碱渣废水的研究及实践提供理论依据。本研究的主要内容有：1从装置的反冲洗污泥中富集、分离、纯化出对苯酚有降解活性的菌株，并筛选出降解苯酚效率较好的菌株；2采用不断提高传代的驯化方法逐渐增强菌株的降解能力，使其降解能力达到在48h内将浓度为300mg/L的苯酚降解掉；3研究具有高效苯酚降解能力菌株的降解特性，找出最佳的降解条件，即从环境因子(温度、pH值、溶解氧等)、营养条件(氮源、碳源等)、苯酚浓度变化等方面来研究其降解特性，并考察混合菌株对降解苯酚的影响； 4对具有高效降解能力的菌株进行分类鉴定。1.6.2 研究的技术路线经查阅相关资料，结合本次研究的特点，确定技术路线如图1-2所示：样品富集培养资料收集采样实验方案设计主要环境因子的影响菌株分离纯化菌株筛选优势菌株驯化培养基主要成分的影响接种量的影响苯酚浓度的影响优势菌株的初步鉴定单一、混合菌株降酚能力的比较优势菌株降解苯酚特性的研究图1-2 研究的技术路线第二章 苯酚降解菌的分离纯化和筛选2.1 实验材料2.1.1 实验主要仪器本实验所用仪器见表2-1。表2-1 主要仪器设备编号 名称 型号 产地1 可见分光光度计 722s 上海精密仪器厂2 电子天平 AY120型 日本岛津3 精密PH计 PHS-3C 上海雷磁仪器厂4 生化培养箱 2RH-150-B 江阴滨江医疗设备厂5 手提式消毒器 B 江阴滨江医疗设备厂6 高温电炉 SRJX-4-9 江苏台东县电器厂7 振荡培养箱 SPX-250B-D型 上海博迅实业有限公司医疗设备厂8 无菌工作台 I类 B型 上海博迅实业有限公司医疗设备厂2.1.2 实验用培养基实验用培养基及其组分见表2-2。表2-2 实验用培养基种类及组分培养基组分及规格浓度（g/L）无机盐液体培养基KH2PO4 分析纯K2HPO4 分析纯MgSO4.7H2O 分析纯CaCl2 分析纯NaCl 分析纯MnSO4.H2O 分析纯10%FeCl2 分析纯NH4NO3 分析纯苯酚 优级纯蒸馏水0.50.50.20.10.2微量微量1.0待定1000 25第二章 苯酚降解菌的分离纯化和筛选（续表）培养基组分及规格浓度（g/L）斜面培养基固体培养基富集培养基蛋白胨 生化试剂酵母膏 生化试剂葡萄糖 分析纯琼脂 生化试剂K2HPO4 分析纯蒸馏水蛋白胨 生化试剂牛肉膏 生化试剂NaCl 优级纯琼脂 生化试剂苯酚 优级纯 蒸馏水牛肉膏 生化试剂蛋白胨 生化试剂苯酚 优级纯NaCl 优级纯蒸馏水551.0201.010001055200.51000510待定510002.2 实验方法2.2.1 苯酚浓度的测定采用4-氨基安替比琳分光光度法测定苯酚浓度22。酚类化合物于pH10.00.2介质中，在铁氰化钾存在下，与4-氨基安替比琳反应，生成橙红色的吲哚酚安替比琳染料，其水溶液在510nm波长处有最大吸收，浓度在0mg/L500mg/L的范围内符合比尔定律。2.2.1.1 苯酚标准曲线的绘制于一组8支50m1比色管中，分别加入0，0.50，1.00，3.00，5.00，7.00，10.00，12.50m1酚标准中间液，加水至50m1标线。加0.5m1缓冲液，混匀，此时pH值为10.0土0.2。加4-氨基安替比林溶液1.0ml，混匀。再加1.0ml铁氰化钾溶液，充分混匀后，放置10min立即用722S型分光光度计于510nm波长，用光程为20nm比色皿，以空白管（不加苯酚）为参比，测量吸光度。2.2.1.2 苯酚浓度的计算苯酚浓度的计算公式为：苯酚浓度（mg/L）=m/V上式中，m表示从标准曲线查得的苯酚含量（mg）；V表示测定液的体积（ml）2.2.2 微生物生长量的测定采用比浊法对微生物的生长量进行测定23。比浊法是用分光光度计测定培养液中微生物的浓度。2.2.2.1 最大吸收波长的确定在50ml苯酚浓度为500mg/L的无机盐培养液中加入5ml的HC7菌悬液，培养12h24h，然后用722S型分光光度计在350nm460nm的波长范围测定吸光度，作出光密度OD值随波长变化的曲线，其最大吸收峰处的波长即为菌体的最大吸收波长。2.2.2.2 细菌生长曲线的测定将HC7菌接种到一定体积的、合适的新鲜无机盐液体培养基中，在适宜的条件下进行培养，每隔4h测定培养液中的菌量，以无机盐液体培养基为空白，用分光光度计测定其OD400值，以培养时间为横坐标，以OD值为纵坐标做作图。2.2.3 样品的采集样品采自炼油碱渣污水处理中试系统装置中，将刚经过反冲洗的活性污泥装入广口棕色瓶中,尽快置于4的冰箱中保存。采样环境及样品的物性如表2-3所示。表2-3 采样环境及样品的物性样品编号 采集地点 温度（） PH 样品颜色 气味1 一级生物反应器 30.8 9.86 黑褐色 臭鸡蛋味2 二级生物反应器 30.2 8.39 灰黄色 刺激性气味2.2.4 降酚菌的富集培养从一、二级生物反应器中分别取若干经反冲洗的活性污泥，静止一段时间，分别用己灭菌的1 ml移液管吸取上清夜1ml加到苯酚浓度为500mg/L的富集液体培养基中，在30 , 150r/min的摇床上振荡培养，48h后取5 ml再次接入新鲜的液体富集培养基中，在相同的条件下振荡培养48h后，测定苯酚浓度，计算苯酚降解率。苯酚降解率（%）=100%上式中，表示培养液中苯酚的初始质量浓度（mg/L）；A表示吸光度；V表示测定时所取培养液的体积（ml）2.2.5 降酚菌的分离、纯化采用涂布平板法和平板划线法进行菌株分离。取经过两次富集培养后的菌悬液1 ml依次制成10-1、 10-2、 10-310-9稀释度的稀释液，然后分别取最后3个稀释度的稀释液0.2m1接到琼脂平板上，涂布均匀后倒放置于30的恒温培养箱中培养。待其长出菌落后再用接种针挑取其中清晰可见的单菌落，利用平板划线分离法反复划线分离，每两天划线分离一次，连续分离15次左右，得到纯菌株。2.2.6 苯酚降解菌株的筛选从长出明显单菌落的各纯菌株平板内用接种环分别刮取一环于10ml无菌水中，用离心机充分混匀，制成菌悬液。分别取5m1接入50m1无机盐液体培养基中，置入30，150r/min的摇床上振荡培养24h，取样测定苯酚浓度并计算苯酚的降解率，筛选出高降酚率的菌株。2.2.7 高效降酚菌株的驯化采用多次传种的方法对筛选出的高效降酚菌HC7菌株进行驯化。首先取一环斜面上的HC7的菌体制成菌悬液，再移取5ml接种到50m1苯酚浓度为300mg/L的无机盐液体培养基中，置于30, 150r/min的摇床上振荡培养，至液体培养基变浑浊大约六小时后取样测苯酚浓度并计算苯酚降解率。一代传种：取以上菌液5m1接种到50m1苯酚浓度为300mg/L的无机盐液体培养基中，在相同的条件下进行培养和测定苯酚浓度并计算苯酚降解率。二次及多次传种：取上一代传种实验的菌液5m1，接种到苯酚浓度为300mg/L的无机盐液体培养基中，在相同的条件下进行培养和测定苯酚浓度，并计算苯酚降解率。2.3 结果与分析2.3.1 苯酚标准曲线的绘制以吸光度为纵坐标，苯酚含量（mg）为横坐标，绘制的苯酚标准曲线见图2-1。图2-1苯酚标准曲线由图2-1得知，在所测定的苯酚浓度范围内，吸光度随浓度变化符合比尔定律，其相关系数r=0.9988，表明所测数据准确可靠，此曲线可用于未知苯酚浓度的求解。2.3.2 微生物生长量的测定前人的研究经验表明，一定范围，菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知其密度。2.3.2.1 菌体最大吸收波长的测定以筛选出的高效降酚菌株HC7为实验对象，绘制菌体的吸收曲线，绘制的吸收曲线如图2-2所示。图2-2 HC7菌体的吸收曲线从图2-2可以看出，HC7菌体在400nm处有最大吸收，即为400nm。2.3.2.2 细菌生长曲线的测定细菌接种到均匀的液体培养基后，当细菌以二分裂法繁殖，分裂后的子细胞都具有生活能力。在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变的条件下，以时间为横坐标，以菌体数为纵坐标，根据不同培养时间里细菌数量的变化，可以做出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线，这种曲线称为生长曲线。微生物的生长曲线不仅可以作为控制微生物生长发育及环境因素对微生物影响的理论基础，而且在水污染控制的生物处理法中也具有重要的指导作用24。在最大吸收波长处（即=400nm）每隔4h测定培养液中的光密度OD值，以OD对培养时间作图，作出的生长曲线如图2-3所示。从图2-3可以看出，HC7细菌的对数生长期为8 h 24h，它的生长规律基本符合一般细菌的生长曲线，即分为停滞期、对数期、稳定期、衰亡期。图2-3 HC7菌生长曲线2.3.3 降酚菌的富集培养富集培养是筛选高效降解菌株最强力的技术手段之一25。主要是利用不同细菌间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的细菌旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，成为优势菌种。富集条件可根据所需分离的细菌的特点从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、pH、光照、氧气、营养等。本实验采用含有苯酚的液体培养基作为富集培养基，从而抑制或淘汰那些不适应该条件下生长的细菌，而所需要的细菌经富集培养后在数量上占优势。经过48h的振荡培养之后，液体培养基的颜色由原来污泥和培养基的混合颜色转变成浑浊的浅黄色，培养基中苯酚的刺鼻气味有很大程度的减轻，其霉腐的气味很浓，推测为细菌降解的中间产物或终产物的气味。接入新鲜的培养基振荡培养48h后，培养基由原来黄色逐渐变成浑浊的浅黄褐色，苯酚的刺鼻气味基本消失，在培养的三角瓶底出现团状物，其颜色有白色、乳白色、淡红色等多种颜色，推测可能是细菌的菌胶团。经过两次富集培养，测定苯酚浓度，结果如表2-4所示。 表2-4 两次富集培养的苯酚降解率样品名称 苯酚初始浓度（mg/L） 培养后酚浓度（mg/L） 苯酚降解率（%）一级活性污泥 500 388 22.4二级活性污泥 500 243 51.4对照培养 500 500 0从表2-4可知，经过两次富集培养，两个样品对苯酚的降解率不同，二级活性污泥的降酚率大于一级活性污泥的降酚率，因此，实验选用二级活性污泥的菌悬液做菌种分离纯化实验。2.3.4 降酚菌的分离与纯化菌种在正常条件下是与各种菌混杂生长在一起的，富集培养只是抑制或淘汰了那些不适应培养条件的细菌，不能得到细菌的纯种，所以有必要进行分离纯化。以第二次的富集培养液为母液进行降酚菌的分离纯化。培养两天后发现每种稀释度的平板上均长出了数目极多的菌落，菌落的直径在1mm5mm左右，其中，稀释度越高的平板长出的菌落越少。菌落的形状主要是圆形，多数是单菌落，颜色则有多种。根据菌落特征分为7种，结果见表2-5及图2-4所示。表2-5 7种菌落的形态特征编号 纯菌种编号 菌落形态观察1 HC1 白色、菌体厚、表面有褶皱、边缘不规则2 HC2 乳白色、周边圆滑、表面湿润3 HC3 橙红色、周边薄而不平、油性4 HC4 无色、透明、周边光滑、菌体较薄5 HC5 浅灰色、油性、周边形状不规则6 HC6 黄色、表面湿润、周边光滑、菌体较厚7 HC7 浅红色、中间稍隆起、菌体较薄且光滑图2-4 各种颜色的纯菌株2.3.5 苯酚降解菌株的筛选把分离到的7株菌分别在无机盐培养液中培养24h，取样测定苯酚浓度，结果见表2-6。从表2-6可以看出，7个菌株中，HC7菌株的苯酚降解率最高，说明HC7菌株对苯酚的降解起到关键作用，其余菌株可能对苯酚的降解起到协同作用。因此，选用HC7菌株作为本次实验中纯菌株性质研究的对象。表2-6 7菌株的降酚能力比较菌株编号 初始苯酚浓度（mg/L） 培养后苯酚浓度（mg/L） 苯酚降解率（%）HC1 500 451 9.8HC2 500 398 20.4HC3 500 348 30.2HC4 500 418 18.4HC5 500 373 25.4HC6 500 454 9.2HC7 500 308 38.42.3.6 苯酚降解菌株的驯化把筛选出的HC7菌株进行传代驯化，结果如表2-7所示。 表2-7 HC7菌株驯化结果传种菌代时间（h）苯酚初浓度（mg/L）苯酚降解率（%）123454848484848300 300 300 300 300 66.1 70.3 78.3 85.9 98.3 从表2-7可知，HC7菌株经过五代驯化，在苯酚初始浓度相同的条件下， 48h内可以将苯酚的降解率从66.1%提高到98.3%，基本达到了本课题拟订的目标。同时还说明在一定范围内增加传种的次数可以提高HC7菌株降解苯酚的酶的活性。2.4 小结从含酚炼油碱渣二级生物处理装置的污泥中采集菌源，经液体培养基两次富集培养后分离纯化得到七株菌，用苯酚浓度为500mg/L的无机盐培养液进行高效降酚菌的筛选，结果表明，HC7菌株是污泥中主要的酚降解微生物。经过24h的培养，HC7菌株对浓度为500mg/L的苯酚的降解率达38.4%。采用不断传种的方法驯化HC7菌株，经过五代驯化，HC7菌株可以在48h将苯酚的降解率从66.1%提高到98.3%，达到了生物处理污水的微生物法降解酚的要求。第三章 菌株HC7的初步鉴定3.1 实验材料3.1.1 实验仪器实验所用仪器见表3-1。表3-1 主要仪器设备编号 名称 型号 产地1 数码摄影显微镜 NiKonE200型 日本岛津2 可见分光光度计 722s 上海精密仪器厂3 电子天平 AY120型 日本岛津4 精密PH计 PHS-3C 上海雷磁仪器厂5 生化培养箱 2RH-150-B 江阴滨江医疗设备厂6 手提式消毒器 B 江阴滨江医疗设备厂7 双门无霜电冰箱 BCD-148W 广州市万宝电器工业公司8 高温电炉 SRJX-4-9 江苏台东县电器厂9 振荡培养箱 SPX-250B-D型 上海博迅实业有限公司医疗设备厂10 电热恒温鼓风干燥箱 GZX-9070MBE 上海博迅实业有限公司医疗设备厂11 无菌工作台 I类 B型 上海博迅实业有限公司医疗设备厂12 托盘天平 JYT-10型 上海医用激光仪器厂3.1.2 实验用培养基、主要试剂及染色液实验所用培养基、主要试剂及染色液见表3-2。表3-2 培养基、主要试剂及染色液的组成名称组分及规格质量或体积固体培养基牛肉膏 生化试剂蛋白胨 生化试剂琼脂 生化试剂蒸馏水 NaCl 优级纯苯酚 优级纯5g10g20g1000ml5g0.5g第三章 菌株HC7的初步鉴定（续表）名称组分及规格质量或体积无机盐液体培养基半固体培养基M.R./V.P.实验培养基斜面培养基吲哚实验培养基KH2PO4 分析纯K2HPO4 分析纯MgSO4.7H2O 分析纯CaCl2 分析纯NaCl 优级纯MnSO4.H2O 分析纯10%FeCl2 分析纯NH4NO3 分析纯苯酚 优级纯蒸馏水牛肉膏 生化试剂蛋白胨 生化试剂琼脂 生化试剂蒸馏水NaCl 优级纯葡萄糖 分析纯蛋白胨 生化试剂K2HPO4或NaCl 分析纯蒸馏水蛋白胨 生化试剂酵母膏 生化试剂琼脂 生化试剂K2HPO4 分析纯蒸馏水葡萄糖 分析纯胰蛋白胨 生化试剂NaCl 优级纯蒸馏水0.5g0.5g0.2g0.1g0.2g微量微量1.0g0.2g1000ml5g10g4g1000ml5g5g5g5g1000ml5g5g20g1.0g1000ml1.0g10g5g1000ml（续表）名称组分及规格质量或体积甲基红试剂 Leifeson染液石炭酸复红染色液结晶紫染色液碘液番红染色液甲基红 分析纯95%乙醇 分析纯蒸馏水单宁酸 分析纯15%甲醛 分析纯水FeCl3 分析纯1%NaOH 分析纯AgNO3 分析纯碱性品红 分析纯95%乙醇 分析纯石炭酸 分析纯水结晶紫 分析纯95%乙醇 分析纯草酸铵 分析纯水碘 分析纯碘化钾 分析纯水番红花红 分析纯水0.1g300ml200ml5g2ml100ml1.5g1ml2g0.3g10ml5g95ml2.5g25ml1g100ml1g2g300ml2g 100ml3.2 实验内容3.2.1 细菌培养特征观察3.2.1.1 平板菌落特征观察（1）制备培养基平板。将牛肉膏蛋白胨融化后冷却至50左右，无菌操作倒平板，凝固后成琼脂平板，为有利于单菌落的形成，待平板表面无水珠后再使用。（2）平板划线。在斜面培养基上挑取少许HC7菌，平板划线，以便长出单菌落。（3）培养观察。将培养皿倒置，于30条件下培养3d。观察单菌落的下列特征：大小和形状、表面的粗糙情况、边缘状况、隆起、颜色、透明度及黏度等。3.2.1.2 培养液中的生长特征观察（1）接种。将配好的无机盐培养液灭菌冷却后，取少量HC7菌体接入培养液中。（2）培养观察。在30条件下培养3d，观察培养液的浑浊、结膜和气味等现象。3.2.2 菌株形态特征观察3.2.2.1 细菌的简单染色 (1)菌体准备。将HC7菌株在斜面培养基中培养24h备用。(2)涂片。在干净的载玻片中央滴一小滴蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种到玻片上的水滴中，涂布成一均匀的薄层。(3)干燥。在空气中自然凉干。(4)固定。将已干燥的涂片正面向上，在微小的火焰上通过23次，由于加热使蛋白质凝固而固着在载玻片上。(5)染色。在载玻片上滴加石炭酸复红染色液，使染液铺盖在涂有细菌的部位，作用约1 min。(6)水洗。倾去染液，斜置载玻片，用小股水流冲洗，直至水呈无色为止。(7)吸干。将载玻片倾斜，用吸水纸吸去涂片边缘的水珠。(8)镜检。用显微镜观察细菌形状。3.2.2.2 革兰氏染色 (1)用接种针挑取少量培养了24h 的HC7菌苔，均匀涂布在干净玻片上，滴一小滴蒸馏水，风干固定。(2)用结晶紫的混合液