2005级开题报告-邓岩ppt.ppt

硕硕 士 研 究 生 开题报题报 告 5-氮杂脱氧胞苷联合放疗对 鼻咽癌 RASSF1A基因甲基化和表达的影响 硕士研究生开题报告硕士研究生开题报告 研究生 ：邓岩 导 师：姚运红 副教授 时 间：2005年8月19日 02 硕士研究生开题报告 开题报 告 一、立题依据与研究现状 二、实验目的 三、技术路线 四、主要实验方法 五、预期结果 六、经费预算 七、时间安排 03 立题依据立题依据 第一部分第一部分 04 硕士研究生开题报告 立题依据 RASSF1A基因 RASSF1A蛋白 RASSF1A基因的高甲基化与肿瘤 5-氮杂脱氧胞苷 05 硕士研究生开题报告 RASSF1A基因 很早以来，医学研究人员就发现肿瘤患者3p 染 色体出现等位缺失的现象,（常见肺癌患者）, 于是推测该区域可能存在某种抑癌基因。 1998 年,Sekido 等在肺癌及乳腺癌细胞系的研 究中发现3p21. 3 存在一个120kb长的最小纯 合缺少区。 2000 年,Dammann 等4 使用酵母双相杂交筛 选的方法自该区分离出一种能与DNA 修补蛋白 (XPA) 相互作用的候选cDNA(互补DNA) ,其核苷 酸序列的羧基端与鼠RAS 效应蛋白Nore1 和 Maxp1 高度同源,遂命名为RAS 区域相关家族1 ,即RASSF1 基因 06 硕士研究生开题报告 RASSF1A基因 Ras 基因除了具有促进细胞生长、增殖的作用 外还具有一个非常重要的功能抑制细胞生 长、促进细胞凋亡和衰老。RASSF1A 基因可能 是Ras 激活信号传导通路中一个非常重要的负 向调节基因,在肿瘤的发生、发展、预后等方面 具有重要意义。该基因主要存在3 种不同的转 录本，共同编码与Ras 相关的同源区 (RalGDS/AF26 ,RA)。这三个转录本分别是： RASSF1A 、RASSF1B 、RASSF1C 07 硕士研究生开题报告 RASSF1A RASSF1A 含外显子1和2,其cDNA 全长1 873 bp ,含340 个氨基酸的开放读码框,编码产物为相 对分子质量为38 800 的蛋白多肽,其N端与富含半 胱氨酸的甘油二酯或佛波酯结合区高度同源,也被 称作蛋白激酶C 保守区1 (protein kinase C conserved region 1 ,PKCC1)。在正常组织中都 有表达,但在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌、肾 癌等肿瘤中存在较高的表达缺失。 08 硕士研究生开题报告 RASSF1B RASSF1B 也含外显子2,但其外显子1 与转录本A 不同,该转录本cDNA 全长1 664 bp ,可能仅编码Ras同源区(RA)。主要表达 于造血系统的组织细胞,在肿瘤中的表达缺 失率不高,约37.13 % 09 硕士研究生开题报告 RASSF1C RASSF1C 外显子起自1,无2,全长117 kb ,编码含270 个氨基酸的蛋白,但不含 PKCC1 区, 相对分子质量为32 000。正常 组织和肿瘤中都有较好的表达 因此，RASSF1A基因可以成为一种研究的重 要候选抑癌基因。表达产物是RASSF1A 蛋 白 10 硕士研究生开题报告 RASSF1A蛋白 RASSF1A 蛋白作为Ras 效应蛋白家族中的一员 ,主要以GTP 依赖的方式结合Ras 传导通路上 游的Ras/ GTP 而被激活发挥抑制细胞生长、 促进细胞凋亡和衰老的功能。 研究发现,RASSF1A 蛋白的氨基酸序列除了包 含RA 区、PKCC1 区外还包含了一个 ATM(ataxia telangiectasia mutated) 蛋白 的磷酸化位点，ATM参与细胞周期调控、有丝 分裂中染色体重组、端粒长度监测及DNA 损伤 细胞学反应。 RASSF1A 蛋白通过磷酸化ATM 蛋白的PI3K位点 活化来发挥抑制肿瘤的作用。 11 硕士研究生开题报告 RASSF1A蛋白 1、RASSF1A 蛋白通过抑制Ras 激活生长效应信号的传 导途径而发挥作用;另一种可能机制则是RASSF1A 蛋白 的失活导致Ras 作用的失衡,使其主要发挥促进生长的 作用。 2、RASSF1A 蛋白可能是细胞周期蛋白D1 (cyclin D1) 的抑制蛋白。cyclin D1 对RASSF1A 蛋白的活性非常敏 感,活化RASSF1A 蛋白能明显的抑制cyclin D1 在细胞 内积聚从而抑制细胞由G1 期进入S 期,对细胞增殖起负 性调节作用。 12 硕士研究生开题报告 RASSF1A蛋白 3、RASSF1A 蛋白在分裂间期分布在细胞微 管,在有丝分裂期分布在细胞中心体和纺锤 体, 并最终通过细胞分化周期调控蛋白20 ( cell division cycle control protein20 ,cdc20) 作用到促后期复合物 (anaphase promoting complex ,APC) 上, 抑制APC 磷酸化活性使细胞有丝分裂停滞 在中后期 13 硕士研究生开题报告 RASSF1A基因高甲基化与肿瘤 现已明确RASSF1A 基因在肺癌等癌症中表达失活 的机制是由于其启动子区CpG岛的特异性高甲基化 所致。 虽然抑癌基因的失活还可由突变所致,但对该基因 的研究结果表明,RASSF1A 基因的突变率在肺癌中 还不及10 %,而RASSF1A 启动子区发生高甲基化的 比率在小细胞肺癌、非小细胞肺癌系中分别高达 100 %和63 %,非恶性肺组织中无一例发生甲基化 。 研究表明：不表达RASSF1A 蛋白的A549 肺癌细胞 系经甲基化抑制剂处理并重新表达RASSF1A 蛋白 后,可减少其细胞克隆形成, 抑制非贴壁性细胞生 长; 而表达RASSF1A 蛋白的裸鼠移植肿瘤较对照 组的肿瘤生长明显减慢。 14 硕士研究生开题报告 RASSF1A基因高甲基化与肿瘤 邵康,赫捷,程邦昌,等RASSF1 基因不同转 录本在肺癌组织中的转录表达及临床意义 . 中华肿瘤杂志,2003 ,25 (2) :1492153.研究还发现RASSF1A 与淋巴结 转移及TNM分期相关,伴淋巴结转移者或病 期较晚的病例癌组织者RASSF1A 的表达缺 失均显著高于无淋巴结转移者( P 0. 05)及病期较早者( P 0. 01) 15 硕士研究生开题报告 5-氮杂脱氧胞苷 DNA甲基化修饰有多种方式，其中DNA胞嘧 啶C-5位甲基转移酶(DNA甲基化酶)识别DNA 的5-CG-3序列(CpG),把S腺苷甲硫氨酸 (SAM)的甲基转移到胞嘧啶的5位,生成5甲 基胞嘧啶(5mC)2。DNA甲基化抑制剂能逆 转甲基化效应,包括防止甲基化CpG的突变, 重激活因甲基化抑制的基因等。 16 硕士研究生开题报告 5-氮杂脱氧胞苷 这些抑制剂及其作用靶点较多。其中胞苷类似物5 氮杂脱氧胞苷的作用机制已很清楚,目前已进入临 床实验阶段，用于白血病治疗。其他化合物大多 停留在临床前实验阶段。 5氮杂胞苷、5氮杂脱氧胞苷和胞苷结构类似,它 们能与DNA甲基化酶共价结合,降低酶的生物 活性。但此类化合物体内体外实验均有细胞毒和 致突变作用。 17 鼻咽癌是一种多因素参与的多基因遗传 性疾病。然而，研究RASSF1A 基因的甲 基化与鼻咽癌的转移关系的文章不很多 ，因此，本研究旨在从一个新的角度反 映鼻咽癌的本质 研究现现状 18 硕士研究生开题报告 研究现现状 Lo KW, Kwong J , Hui AB , et al. High frequency of promoter hypermethylation of RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res ,2001 ,61 :387723881.：分析了4 例鼻咽癌移植瘤标本、4 株鼻 咽癌细胞系和21 例原发性鼻咽癌标本,发现RASSF1A 基 因5Cp G 岛的完全甲基化率在移植瘤中为100 %(4/ 4) ,在鼻咽癌细胞系中为75 %(3/ 4) ,在原发性鼻咽癌 中为66.17 %(14/ 21) ,在正常鼻咽上皮没有甲基化,基 因突变只在原发性鼻咽癌中发现2 个, 19 硕士研究生开题报告 研究现现状 在有高度甲基化的细胞系和移植瘤中发现有 RASSF1A 基因的高表达缺失, 在用甲基化抑制剂 5氮杂脱氧胞苷(52aza22 ,deoxycytidine)处 理后,RASSF1A 基因重新表达并显著抑制细胞的生 长和增殖。 Chow 等将野生型RASSF1A 基因转染到RASSF1A 基 因缺陷型的鼻咽癌细胞C66621 中,发现重新表达 RASSF1A 蛋白的鼻咽癌细胞C66621 能显著减少其 细胞克隆形成, 抑制非贴壁性细胞生长。 20 以上资料表明： 1. RASSF1A 基因是鼻咽癌的一个非常重 要的候选抑癌基因,启动子区的高度甲 基化至少是其失活的主要机制之一。（ 当然，基因缺失的作用不可忽视。） 2. RASSF1A基因表达低下是鼻咽癌的晚 期转移的重要事件，可能是伴随性改变 ，甚至是鼻咽癌发生转移的主导因素 21 第二部分第二部分 实验实验 目的 22 实验目的 1. RASSF1A 基因的高甲基化和 RASSF1A 基因的表达在鼻咽癌转转移 方面有无统计统计 学意义义 23 实验目的 2.通过过5-氮杂杂脱氧胞苷联联 合放疗对疗对 RASSF1A 基因的 表达的影响，研究该药该药 物 、放疗疗各自的疗疗效和联联合 疗疗效 24 第三部分第三部分 技术术路线线 25 鼻咽癌细胞系接种裸鼠 RASSF1A基因甲基化水平及其在 鼻咽癌细胞系表达 5-氮杂脱氧胞苷处理 检测RASSF1A基因甲基化水平 分析比较其差异性 RASSF1A基因及蛋白表达 放疗空白对照 5氮杂脱氧胞苷联合放疗 鼻咽癌组织正常组织 免疫组织化学 检测RASSF1A蛋白 26 主要实验实验 方法 v （一）甲基化特异性PCR（MSP） v MSP法原理:单链DNA的胞嘧啶(C)可被亚硫酸氢盐脱氨基 转变为尿嘧啶(U),而5 甲基胞嘧啶(5 mC)则不能被修饰,仍保持 为5 甲基胞嘧啶(5 mC),根据5 甲基胞嘧啶与胞嘧啶修饰后的不 同,发生甲基化与未发生甲基化DNA的上游引物之间的差别为 胞嘧啶(C)变为胸腺嘧啶(T),下游引物的差别为鸟嘌呤(G)变为 腺嘌呤(A)。据此设计甲基化(p16m)等位基因特异引物和非甲 基化(p16u)引物,用这两对引物对同一模板进行扩增来检测待 扩增片段的甲基化状况。能用p16m引物扩增的,说明了该扩增 片段已发生了甲基化,能用p16u引物扩增的,说明了该扩增片段 没发生甲基化,如用两对引物都能扩出,则说明了该扩增片段存 在部分程度的甲基化。本研究所扩增的片段位于启动子和第一 外显子,其引物序列见表 v - 27 硕士研究生开题报告 （一）甲基化特异性PCR（MSP） v 引物引物序列 bp v p16m(上游)5 TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC 3150 v p16m(下游)5 GACCCCGAACCGCGACCGTAA 3 150 v p16u(上游)5 TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT 3 151 v p16u(下游)5 CAACCCCAAACCACAACCATAA 3 151 vPCR:反应总体积50l,包括经亚硫酸钠修饰后的模板DNA约50ng,引物 各300dNTP1.25mmol/L,1.25UDNA聚合酶,1* v PCR缓冲液(16.6mmol/L硫酸铵、67mmol/L Tris HClpH8.8、 10mmol/L2-巯基乙醇67mmol/LMgCl2)反应条件为95热启动15m, 然后于9530s、6030s、7230s各循环35次,最后于72延伸 10min,同时以正常人外周血淋巴细胞(PBI)DNA作为阴性对照3,以水 作为空白对照。取扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳,凝胶成像系统观察 ,拍照。 28 主要实验实验 方法 v （一）逆转录转录 PCR v1、 抽提鼻咽组织和鼻咽癌细胞株总RNA，42oC完成 v2、引物Oligo（dT）15：正义引物5- TCTGGGGCGTCGTGCGCAAA-3;反义产物5- GAACCTTGATGAAGCCTGTG-3 v3、 内对照：甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH） v4、 扩增产物在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙啶（小心， 强烈致瘤剂）染色 v5、 测定RASSF1A和GAPDH基因产物条带吸光度的相对比 值。该比值表示RASSF1A基因的相对表达强度。 - 29 主要实验方法 v5氮杂脱氧胞苷 5 aza CdR1.0mol/L（可以采 用的浓度分别为0.1,0.5,1.0,2.0,5.0mol/L） v免疫组织化学技术 v放疗 v DT36Gy/18次 30 第四部分第四部分 预预期结结果 31 1. 未用5 氮杂脱氧胞苷与放疗前测甲基化 正常组织程度低，鼻咽癌组织甲基化程度 高，能与转移能力正相关 32 2. 未用5 氮杂脱氧胞苷与放疗前测RASSF1A 表达正常组织高，鼻咽癌组织低，表达能 力与转移能力负相关 33 3.用5 氮杂脱氧胞苷与放疗后 34 5 氮杂脱氧胞苷与放 疗组 5 氮杂脱氧胞 苷组 放疗组空白对照组 RASS F1A较高较高较高低 甲基化 较低较低较低高 35 第五部分第五部分 经费预经费预 算