栽培山楂自花不孕不育机理研究张金霞.doc

目录摘要1前言21 材料与方法31.1 材料31.2 方法31.2.1 花粉生活力的测定31.2.2 花粉发芽率及花粉管生长速度的观察31.2.3 胡萝卜素含量的测定31.2.4 花粉色素的分离31.2.5 POD 活性的测定31.2.6 POD 同工酶分析31.2.7 SOD 活性的测定32 结果与分析42.1 栽培山楂与野生山楂花粉生活力及发芽能力的比较42.2 栽培山楂与野生山楂花粉色素的比较42.2.1 栽培山楂与野生山楂花粉色素种类的比较42.2.2 栽培山楂与野生山楂花粉中胡萝卜素含量的比较52.3 栽培山楂与野生山楂花粉POD活性的比较62.4 栽培山楂与野生山楂花粉POD同工酶的比较62.5 栽培山楂与野生山楂花粉SOD活性的比较72.6 栽培山楂与野生山楂花粉营养物质含量的比较82.6.1 栽培山楂与野生山楂花粉氨基酸含量的比较82.6.2 栽培山楂与野生山楂花粉脯氨酸含量的比较82.6.3 栽培山楂与野生山楂花粉可溶性总糖含量的比较82.6.4 栽培山楂与野生山楂花粉可溶性蛋白质含量的比较93 讨论与结论910参考文献 1011致谢 11英文摘要 12栽培山楂自花不孕生理机制的研究张金霞（河北职业技术师范学院园艺系， 昌黎 066600 ）摘要:本试验对能自花结实的野生山楂与自花不孕的栽培山楂大金星、面楂、敞口三个品种花粉的部分生理生化指标进行了分析，结果表明，栽培山楂花粉生活力及花粉管生长速度低于野生山楂；野生山楂花粉中胡萝卜素、游离脯氨酸和可溶性蛋白质含量最高，POD活性最低，而花粉萌发最差的大金星中POD活性最高，胡萝卜素和可溶性蛋白质含量最低，游离脯氨酸含量较低；栽培山楂与野生山楂POD同工酶种类没有差异，但活性普遍较高；栽培山楂花粉中含有花色苷，而野生山楂花粉中没有。花粉管生长速度慢是栽培山楂自花不孕的主要原因。栽培山楂花粉中可溶性蛋白质与游离脯氨酸含量较低，POD活性较高是其发芽慢的部分原因。栽培山楂花粉中的花色苷可能与其自花不孕有关。 关键词：栽培山楂；野生山楂；花粉；自花不孕山楂是一种集观赏、营养、药用于一体的果树，也是我国的特有优势果树品种。栽培品种山楂种子一般比野生山楂种子含仁率低，有些栽培品种的种子即使完全没有种仁也能结出发育正常的果实。研究证明，山楂具有“单性结实”的特性1。栽培山楂90%以上是未经受精而结实2。但由于结实率低，形成的无仁果实发育差,难以构成较高的产量3。目前栽培的大山楂品种自花结实能力普遍较低，有的甚至自花不结实。栽培品种之间的授粉能力也差。这给山楂的杂交育种和苗木繁育带来困难，生产上一般采用野生山楂的实生苗作砧木嫁接来繁育。以往对栽培山楂自花结实率低的研究多是从形态指标上进行的，对其自花不孕生理机制的研究还不够深入。为此，本试验通过对自花不孕的栽培山楂与能自花受精的野生山楂花粉的部分生理生化指标进行分析比较，进一步探讨了栽培山楂自花不孕的生理机制。1 材料与方法1.1 材料 于气球期从昌黎小东山采集野生山楂花朵，河北职业技术师范学院园艺园林试验站采集大金星、面楂、敞口三个栽培山楂品种花朵，用刀片将花粉取下，于室温下阴干，花粉散出后，收集在小瓶中于-5箱保存。1.2 方法1.2.1 花粉生活力的测定 采用TTC染色法6，每个品种制三个片，每片调查60粒。1.2.2 花粉发芽率及花粉管生长速度的观察 分别取适量花粉于载玻片上，滴一滴10%的蔗糖液，用拨针将花粉涂匀。每个品种制三个片，在25下培养6小时。每片随机观察100个花粉粒，调查花粉发芽率。每片随机测量10个花粉管长度。1.2.3色素的分离 采用纸层析法7，推动剂分别为石油醚 ：丙酮= 1 ：1和Forestal（浓盐酸 ：醋酸 ：水=3 ：30 ：10），先用石油醚：丙酮分离类胡萝卜素，然后用Forestal分离花色苷和黄酮类色素，先将风干的层析纸依次在自然光下和紫外分析仪下观察,划出色斑。1.2.4胡萝卜素含量的测定6 称取花粉0.2克，加95%的乙醇2ml研磨，过滤于10ml容量瓶中。将残渣与滤纸反复冲洗，洗液过滤，最后定容至刻度,取滤液于440nm下比色，以OD值表示色素含量。1.2.5 POD活性的测定 采用联苯胺比色法8。1.2.6 POD同工酶分析 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法8。1.2.7 SOD活性的测定 采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法6。1.2.8氨基酸含量的测定 采用水合茚三酮显色法8，用氨基态氮含量表示。1.2.9脯氨酸含量的测定8 取花粉0.15克，加80%乙醇1ml研磨成母浆，用80%乙醇分次转移到刻度管中至10ml,在沸水浴中煮10分钟后取出，加0.25克活性炭，充分摇动，过滤于小烧杯中，用80%乙醇冲洗滤纸三遍，放置7080水浴中蒸去乙醇，用蒸馏水定容至50ml待用。吸提取液10ml加入1克沸石，摇动十分钟后滤去沸石，吸提取液0.8ml，加1.2ml水于具塞刻度管中，再加冰醋酸、酸性茚三酮各2ml，加盖在沸水中加热15分钟，取出冷却，在515nm下比色，记录OD值。1.2.10可溶性糖含量的测定 采用蒽酮法6。1.2.11蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝G250染色法8。2 结果与分析2.1栽培山楂与野生山楂花粉生活力及发芽能力的比较图1. 不同山楂花粉的生活力和发芽率及花粉管长度的比较由图1可以看出，野生山楂花粉生活力明显高于栽培山楂，三个栽培品种之间花粉生活力差异不明显。花粉的发芽率高低顺序依次为：野生山楂面楂敞口大金星，虽然栽培山楂品种之间花粉生活力相近，但其花粉发芽率相差很多，其中大金星花粉发芽率最低，仅为2. 3%；而面楂和敞口花粉发芽率却比大金星高约8倍。由此可见，栽培山楂花粉生活力与发芽率没有相关性。花粉管长度以野生山楂为最长，约为栽培山楂的2倍。说明栽培山楂自花不孕的主要原因是花粉管生长速度慢。2.2 栽培山楂与野生山楂花粉色素含量的比较2.2.1 栽培山楂与野生山楂花粉中色素种类的比较用石油醚 ：丙酮=1 ：1作为推进剂分离花粉色素结果表明，栽培山楂与野生山楂花粉中都含有胡萝卜素。花色苷不溶于石油醚和丙酮，因此留在原点。再用Forstal作为推进剂第二次分离花粉色素，在自然光照射下发现栽培山楂花粉中含有花色苷，颜色为粉红色，而野生山楂花粉中不含花色苷（图2）；经紫外光照射发现，栽培山楂与野生山楂花粉中都含有相同的三种黄酮类色素，在紫外光照射下分别发出黄色、暗绿色、和淡蓝色的荧光（图3）。 野山楂 大金星 面楂 敞口 野山楂 大金星 面楂 敞口 图2. 花粉色素自然光下的层析图谱 图3. 花粉色素紫外光下的层析图谱 2.2.2栽培山楂与野生山楂花粉胡萝卜素含量的比较图4.结果表明：野生山楂花粉中胡萝卜素含量明显高于栽培山楂，栽培山楂中敞口和面楂的含量相近，大金星的含量最低。图4. 栽培山楂与野生山楂胡萝卜素含量的比较 2.4栽培山楂与野生山楂花粉POD活性的比较栽培山楂花粉中POD活性明显大于野生山楂，其中发芽能力最差的大金星花粉POD活性最高，为野生山楂的29倍。其次是敞口，为野生山楂的19倍，再次是面楂，约为野生山楂的2倍（图5）。图5. 栽培山楂与野生山楂花粉的POD活性2.4栽培山楂与野生山楂花粉POD同工酶的比较对野生山楂和栽培山楂花粉中POD同工酶分离结果，共检测出9条酶带，Rf值分别为0.364，0.403，0.432，0.481，0.510，0.539，0.617，0.660，0.684。野生山楂与栽培山楂酶带数相同，但颜色较浅，说明野生山楂花粉POD活性比栽培山楂低。图6. 栽培山楂与野生山楂花粉POD同工酶谱2.5 栽培山楂与野生山楂花粉SOD活性的比较 图7. 栽培山楂与野生山楂花粉的SOD活性由图7可见，野生山楂花粉的SOD活性低于栽培山楂，其中大金星的活性最高，比野生山楂高37%，其次是面楂，再次是敞口。2.6 栽培山楂与野生山楂花粉营养物质含量的比较2.6.1栽培山楂与野生山楂花粉氨基酸含量的比较图 8结果表明，发芽能力最强的野生山楂与最差的大金星花粉中氨基酸含量相近，高于面楂和敞口，说明氨基酸作为营养物质不是影响花粉萌发的主要因素。图8. 栽培山楂与野生山楂花粉氨基酸的含量2.6.2 栽培山楂与野生山楂花粉脯氨酸含量的比较野生山楂花粉中游离脯氨酸含量高于三个栽培品种,分别比大金星高24%，比面楂高52%，比敞口高50%。图9. 栽培山楂与野生山楂花粉脯氨酸的含量2.6.3 栽培山楂与野生山楂花粉可溶性总糖含量的比较栽培山楂中，大金星花粉含有的可溶性总糖最高，其次是面楂，野生山楂与敞口的可溶性总糖含量相同，且均低于面楂。说明花粉中可溶性糖含量与花粉育性无关。 图10. 栽培山楂与野生山楂花粉可溶性总糖的含量2.6.4 栽培山楂与野生山楂花粉可溶性蛋白质含量的比较 野生山楂花粉中可溶性蛋白质含量明显高于栽培山楂，分别是大金星、面楂和敞口的1.8倍、3.4倍、1.3倍。说明花粉中可溶性蛋白质含量与花粉萌发有关。图11. 栽培山楂与野生山楂花粉可溶性蛋白质的含量3.讨论与结论3.1 讨论3.1.2本试验结果表明，栽培山楂的花粉萌发困难，花粉管生长缓慢与文献报道的结果相一致。这是栽培山楂自花不孕的主要原因。3.1.2花粉中的色素与育性有关6，栽培山楂花粉中的胡萝卜素含量低于野生山楂，且含有野生山楂花粉所不具有的花色苷，这说明栽培山楂花粉中的色素可能与其自花不孕有关。3.1.3 POD有诱导木质化和降解吲哚乙酸抑制生长的作用。栽培山楂POD活性明显高于野生山楂，尤其萌发困难的大金星花粉中POD活性更高。因此，POD活性高对花粉萌发不利，可能是栽培山楂花粉萌发困难的原因之一。3.1.4栽培山楂花粉的SOD活性高于野生山楂，它与栽培山楂自花不孕的关系有待与进一步研究。3.1.5栽培山楂花粉中氨基酸、蛋白质含量较低，可能是其发芽较难的部分原因。3.1.6花粉中的脯氨酸含量与育性有关6。花粉中积累大量的脯氨酸，一方面可转化成同族的谷氨酸、羟脯氨酸和精氨酸，另一方面为花粉萌发和花粉管生长提供能量和氮源，说明脯氨酸有促进花粉萌发和花粉管伸长的作用10。栽培山楂花粉中脯氨酸的含量低，可能是其自花不孕的部分原因。3.2 结论 3.2.1花粉管生长速度慢是栽培山楂自花不孕的主要原因。3.2.2栽培山楂花粉中含有野生山楂花粉所不具有的花色苷，但胡萝卜素含量较低。3.2.3栽培山楂花粉中POD活性高是其萌发难的原因之一。3.2.4栽培山楂花粉中氨基酸、可溶性蛋白质含量低不利于其发芽。3.2.5栽培山楂中脯氨酸含量低不利于花粉的萌发和花粉管的伸长。参考文献:1赵万图.山楂“单性结实”现象的初步探讨.烟台果树，1982，（2）20242李用泽,郇鲁玲. 山楂单性结实现象探讨. 烟台果树,1995,(3):33343李宝江.山楂授粉亲和性和结实性的研究4张锐,王敏. 山楂授粉问题研究进展. 河北果树.1991,(1):33345刘国成. 山楂花粉管发育过程的荧光观察方法. 北方果树，1993，（2）：306白宝璋，王景安，孙玉霞等编. 植物生理学测试技术. 中国科技出版社：19937马自超，庞业珍. 天然食用色素化学及生产工艺学. 中国林业出版社，19948基础生物化学实验指导. 河北职业技术师范学院生理生化教研室编：19919 莫开菊. 过氧化物酶在园艺植物研究中的应用. 四川果树，1993，（2）：252710褚孟湲，陆爱华. 梅树花粉数量与育性的研究. 落叶果树，1992（1）：2728-致谢：本文是在杨晓玲副教授的悉心指导下完成的，实验期间得到刘永军老师的大力支持和田辉同学的帮助，在此向他们表示衷心的感谢！THE STUDY ABOUT IMCOMPATIBILITY OF CULTURAL HAWTHRONJinxiazhang 9801 class of gardening department of Hebei Vocational and technical teachers collegeABSTRACTThis test analyzed a part of physiological indexes of pollen of self-fruit-bearing wild and self-imcompatibility cultural hawthorn which contains Dajinxing 、Mianzha、Changkou. The result showed that the pollens life and the pollens growth speed of cultural hawthorn is obviously lower than wild hawthorns .The pollen of wild hawthorn has the highest content of carotenoid pigment , free Pro and soluble protein among them , but the activity of POD is lowest . Dajinxing that its pollens sprout was worst has the highest the activity of POD , and the content of carotenoid pigment ，but the soluble protein was lowest , and the content of free Pro was lower . POD isozymal cagetrary was not obviously different from them . But the formers activity usually higher . The polle