《中药发酵工艺条》word版.doc

第三章 中药发酵工艺条件 发酵技术是利用微生物的某种特性，通过现代化的技术手段进行工业化大规模生产的技术。目前由于我国人口过多，资源消费排在世界前列，加之资源短缺，所以应大力发展发酵技术。通过该项技术大规模地生产某种产品，将有助于解决我国资源短缺的问题。伴随着现代生命科学技术和分子生物学的迅猛发展，发酵技术及相关应用领域的研究也越来越活跃，已深入到食品、医药卫生、农业生产、轻工业等各领域中，特别是在中草药的发酵方面取得了很大的进展。例如，药用菌类植物是我国药用植物中的重要组成部分，在民间因其独特的防病、治病效果而有着悠久的历史；同时药用菌类植物还常常被作为中成药的原料药，所以具有非常广阔的应用前景。但目前我们已经注意到，野生型药用菌类植物已经被极度采集，致使资源愈来愈少，国内外市场资源紧缺。因此，如果单单通过野外采集等途径获得，很难满足医药市场的需求，而且价格十分昂贵。如采用发酵工程技术，给予适宜的条件来培养这些菌类植物，则可以达到快速、大规模生产的目的，这显然是一条非常好的技术路线。我国历史上早已有药用真菌的固体培养，如神曲的培养等。近几十年来，为适应市扬的需求，采用发酵技术生产药用真菌、菌丝体及其他代谢产物有了很大的发展。如传统名贵中药冬虫夏草、云芝、灵芝、蜜环菌等都已经投入到大规模的工业化连续生产中，发酵周期短，生产效益高。同时在发酵过程中，除了使菌丝体大量增殖，在发酵液中还可得到多糖、生物碱、酶、核酸等多种具有生物活性的次生代谢产物。通过研究表明，这些物质具有抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、调节免疫等多种功效。利用发酵技术生产这些药用活性成分，还可进一步使药品生产规范化，药源质量、数量稳定，有利于这些药物的相关制剂打入国际市场。可见发酵技术在中医药中的应用已经有了一个良好的开端，引起了人们的极大关注。第一节 培养基的选择和确定 培养基是按照微生物的生长、繁殖、代谢的需要，由各种营养物质按一定比例组合而成的混合体。微生物对培养基中营养物质的利用是通过向外界分泌大量的酶，将周围环境中大分子如糖类、脂肪、蛋白质等分解成小分子的营养物质，借助于细胞膜的跨膜物质转运功能从外界不断地吸收小分子的营养物质，一方面利用这些营养物质合成新的自身所需要的营养物质，另一方面利用这些营养物质获得所需要的能量。可见，培养基的构成及其配比是否恰当对生产菌种的生长、繁殖及代谢产物的合成，甚至对代谢产物的分离、提取、纯化及最终成品的产量和质量都将产生相当大的影响。一个良好的培养基，必须能够提供微生物生长、繁殖所需的各种营养成分，充分发挥生产菌种的生物合成能力，获得最佳的生产效果，从而提高发酵生产水平；一个好的培养基，其营养物质的配备比例，要通过长期的生产实践摸索，不断调整才能完善；一个好的培养基，其组成成分不是一成不变的，要根据不同菌种的特征、发酵生产中的不同阶段和菌种细小的变化情况加以适当调整。如种子生产中就常常通过调整培养基组成的方法来获得优质的孢子，提高发酵生产水平。一、培养基的组成 在工业生产和科研工作中，无论哪一种培养基，都应满足微生物的生长、繁殖和发酵所需要的各种营养物质，而这些营养物质也就是培养基的组成。培养基中的原材料归纳起来有碳源、氮源、无机盐、水、生长因子和前体物质等几大类。其中碳源是组成培养基的主要成分之一，它是碳水化合物合成的原料，为微生物生命活动提供所需要的能量；氮源也是组成培养基的主要成分之一，是蛋白质和核酸合成的主要原料。但在实际工作中，由于微生物细胞的种类不同，同一生产过裎的阶段不同、培养目的的不同，故所选用的培养基成分还是有一定差异的。二、培养基的类型 根据微生物生长、繁殖和发酵的不同要求，培养基的成分和各成分的含量也是不同的，所以培养基的种类很多。据估计目前约有数千种培养基。随着生物科学的飞速发展，培养基的种类也在不断增加。一般来说根据培养基成分、物理状态、不同的使用目的以及生产工艺的要求等可分为以下若干类型。1根据培养基的成分进行分类分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基。(1)合成培养基 合成培养基是利用化学成分和数量完全清楚的物质配制而成的。由于微生物对营养要求的不同，它可以完全由无机盐或无机盐加有机化合物（氨基酸、糖、嘌呤、维生素等）组成。这种合成培养基的配方成分都是已知的，所以只要配制过程操作严格，各批培养基的质量可做到稳定一致。由于这种培养基的化学成分清楚、组成成分精确、重复性强，所以可以减少不能控制的因素，适用于某些定量工作的研究。但合成培养基的成本较高、价格较贵，其价格相当于同类天然培养基的几倍甚至几十倍，因此，合成培养基一般只能在研究工作中使用。同时，一般微生物在合成培养基上生长较慢，有些微生物营养要求复杂，在合成培养基上是不能生长的。(2)天然培养基 由天然物质制成，对于这些天然物质的化学成分还不完全了解，如蛋白胨、普通牛肉汤、玉米浆等。这就造成了用此类物质配成的培养基很难做到在不同批次之间质量上的稳定性，因此，在选用原料时务必标明其名称及批次。同时对不同来源的商品均应先做小试。虽然天然培养基存在这些缺点，但其成本较低，配制方便，营养丰富，适合于各类异养微生物的生长，而一般自养型微生物则不能生长。 (3)半合成培养基 在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其特点是能充分满足微生物的营养需要，大多数微生物都能在此培养基上生长、繁殖。因此，在微生物工业生产和科学研究中半合成培养基被广泛地应用。 2根据培养基的物理状态分类 分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。 (1)固体培养基 是在培养基中加入凝固剂，如琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基大多用于微生物分离、鉴定、计数、菌种保存、抗菌药物的效价试验以及生物制品生产中的菌、疫苗制造等方面。如肉汤琼脂、营养琼脂等均属此类。 (2)液体培养基 液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理方面研究。由于发酵率高，操作方便，也常被用于发酵工业大量生产和增菌培养。 (3)半固体培养基 是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于细菌动力学试验、菌种传代、菌种鉴定、测定噬菌体效价和保存及贮运标本等方面。如双糖铁培养基的高层部分，用以观察细菌有无动力。3根据培养基用途分类 分为加富培养基、选择性培养基、鉴别培养基和厌氧菌培养基。(1)加富培养基 是在普通培养基中加入血、血清、动植物组织提取液或其他营养物质的一类营养丰富的培养基，用以培养营养要求比较苛刻的某些异养微生物。 (2)选择性培养基 是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。在这类培养基中含有营养物（增菌剂）和抑菌剂（选择剂）。菌体接种于这类培养基后，由于抑菌剂的选择性抑制作用，使所要分离的目标菌能够得到较好的繁殖，而其他菌被抑制。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。例如，利用以纤维素或石蜡油作为唯一碳源的选择性培养基，可以从混杂的微生物群体中分离出能分解纤维素或石蜡油的微生物。(3)鉴别培养基 是在普通培养基中加入某种试剂或化学药品，微生物在培养基中生长时，可以产生某种代谢产物，随后代谢产物与培养基中加入的试剂或化学药品发生反应，产生非常明显的特征性变化，这样我们就可以利用这种特征性变化来鉴别不同类型的微生物了。 (4)厌氧菌培养基 厌氧菌体内缺乏有氧代谢所需要的各种酶如细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等，无法进行有氧代谢，因而在代谢过程中会导致自身代谢缺陷，并且厌氧菌在无氧酵解时所产生的能量不足，所以一般的培养基是无法满足厌氧菌正常生长的。为使厌氧菌能够正常生长、繁殖，必须制备氧化还原电势较低、具有特殊生长因子、营养成分丰富的培养基。这就是厌氧菌培养基。厌氧菌培养基是专供厌氧菌分离、培养和鉴别用的培养基。4根据生产工艺要求分类 分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。(1)孢子培养基 孢子培养基是供制备孢子用的固体培养基。要求这种培养基能使孢子迅速萌发和生长，能形成大量的优质孢子，但不能引起菌种发生变异。所以，一般对孢子培养基的配制有以下几个要求：营养不要太丰富（特别是有机氮源要低些），否则影响孢子的形成，如灰色链霉菌（链霉素产生菌）在葡萄糖一硝酸盐培养基上生长良好，并能形成丰富的孢子，但若加入0. 5%酵母膏或酪蛋白，就只长菌丝而不长孢子了。无机盐的浓度要适量，浓度过高或者过低都将影响孢子的数量和质量。要注意孢予培养基的pH值和湿度。孢子培养基的组成要因菌种不同而异。工业生产中常用的孢子培养基有麸皮培养基，大（小）米培养基，用葡萄糖、无机盐、蛋白胨等配制成的琼脂斜面培养基等。上述培养基中的各种原材料的质量要稳定。(2)种子培养基 种子培养基是供孢子萌发和菌体生长繁殖用的培养基，这种培养基能够使菌体长得粗壮，得到活力强的“种子”。所以种子培养基的营养成分要比较丰富与完整，同时其营养成分也应易被菌体吸收利用。一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。无机氮源容易被利用，有利于菌体迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机及无机氮源。其中氮源和维生素的含量应略高些，但总浓度以略稀薄为宜，这样可达到较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖。种子培养基的成分还要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的培养基pH值，其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。由于在发酵中种子质量对发酵水平的影响很大，为使培养的种子能较快地适应发酵罐内的环境，所以在设计种子培养基时一定要考虑与发酵培养基组成的内在联系，一般最后一级种子培养基的成分最好能较接近发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应周围环境，快速生长。(3)发酵培养基 发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物用的培养基。一方面该培养基能使种子接种后迅速生长达到一定的菌丝浓度，另一方面又要使长好的菌体能迅速合成所需要的代谢产物。因此，发酵培养基的组成应丰富完整，除了具有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要具有产物所需要的特定元素、前体和促进剂等，同时浓度要略高一些，以便微生物生长和繁殖。发酵培养基的组成还应考虑菌体在发酵过程中各种生化代谢之间的协调。例如，在产物合成期，为使发酵液中的pH值不出现大的波动，需要在适当的时候加入一些缓冲剂、生理酸性或碱性物质，以维持发酵液pH值的相对稳定。在发酵过程中，若因菌体生长和生物合成产物需要的总碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段所需的最佳条件不同时，还应考虑用分批补料的方式加以满足。最后在选用发酵培养基的原材料时，质量要相对稳定，不能影响产品的分离、精制和质量。三、培养基的选择 不同微生物在培养过程中对培养基的要求是不同的，因此，不同微生物适宜的培养基也是不一样的。由此看来，在发酵生产中培养基的选择是非常关键的。在选择中一定要根据具体请况来确定：对生产菌种的来源、生活习性、生理、生化特性和一般的营养需求进行深入地了解；要搞清楚生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径；需要知道代谢产物的化学性质、分子结构、提取方法。在上述工作都做好以后，从微生物营养要求的特点和生产工艺等出发，选择合适的培养基。这样既能满足微生物生长的需要，又能使发酵生产获得较高的产量和较好的生产效益。另外，在选择培养基时还要符合增产节约、因地制宜、发酵后不对环境造成污染的原则。下面我们将从几个方面详细介绍培养基的选择； 1培养基组分和配比的选择 培养基的组分和配比对微生物的生长和产物的生成具有很大的影响。目前还很难做到从生化反应的基本原理推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，基本上只能在生物化学、细胞生物学等基本理论的指导下，参照前人已经使用过的某一类菌种较适合的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃发酵罐等小型发酵设备，对碳源、氮源、无机盐和前体物质等培养基组分逐个进行单因子试验，从中了解这些因子对菌体生长和产物合成量的影响。最后再综合考虑各种因素，找到一个比较适合本菌种生产的培养基配方，以求得到高产。但在实际生产中，由于单因子试验需要消耗大量的人力、物力、财力和时间，其试验结果准确性也不是很高。为了缩短试验时间，现在人们还常常应用“正交试验设计”等数学方法来确定培养基组分和浓度，还可通过方差分析了解哪个因素的影响作用较显著，以引起人们的注意。这样可以通过比较少的试验次数而得到较满意的结果。如果是对那些代谢途径比较清楚的菌种，问题就简单了，可以根据物料平衡计算确定某种营养物的理论浓度，但目前这种确定方法的应用对象还比较少，有待于进一步研究。下面在确定培养基组分和配比的操作中还需谈几个具体的问题。 (1)选择培养基的氮源 氮源可分为有机氮源和无机氮源两大类。对绝大多数药用真菌，有机氮源比无机氮源更适合菌体的生长，而某些菌只能利用无机氮源。有机氮源大部分为农副产品，例如，豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、玉米浆、酵母粉等，其中所含的成分受原料来源、加工方法、贮藏条件和有效成分的含量等的影响较大，常会引起产量的波动。例如，东北大豆含胱氨酸和蛋氨酸的量比华北、江南产的含量高，非常有利于链霉素的生产；豆饼粉在加工时有热榨和冷榨两种方法，由于加工方法的不同，其质量是不同的；同时在贮藏时，贮藏条件可能不尽相同，同样也会影响其质量。 综上所述，不同菌种对氮源种类的要求不一致。因此，在确定培养基前应从试验中设法，找到菌种所能利用的几种较好的氮源，然后根据成本、原料来源是否容易等因素确定氮源的组成。(2)无机盐用量的确定 若无机盐浓度不合适会影响菌体的生长和产物的合成。所以要预先做各种重要的金属和非金属离子的影响试验，即对各种无机盐的营养要求进行试验，以确定试验其最高、最低和最合适的用量以便于选择。(3)确定培养基组分时，要注意某些组分对于培养基黏度的影响： 如玉米粉等原料会导致发酵培养基黏度增大，这样会影响发酵罐中的通气与搅拌效果，影响产物的形成、分离精制和废物的处理。在药用真菌的发酵中，由于很多真菌的菌丝体要入药，如果微生物菌体与发酵的基质不容易分开，则不能采用含对人体有害成分的材料（如棉籽壳）和因种类不同而成分差异较大的材料（如木屑等）作为营养基质。(4)在确定了培养基的基本组分后，要进一步确定各组分之间的配制比例 配制比例合适，能够充分发挥发酵生产中菌种的生产能力，获得最高的发酵单位；配制比例不合适，会引起发酵单位降低，甚至抑制微生物代谢产物的合成。在培养基各组分的配。制比之中，以碳、氮比对发酵生产的影晌最大。 碳、氮比是指碳源和氮源在培养基中含量的比例。由于菌丝在生长过程中，一般50%的碳源作为能量供给菌丝呼吸，剩下的50%碳源组成菌体细胞。因此，培养基中理想的碳、氮比理论值应该为(16 -24)：1。若氮源过多，则菌体生长太旺盛，将引起培养基pH值偏高，不利于菌体代谢产物的合成和积累；氮源过少，菌体繁殖量过少，影响发酵产量。而若碳源过多，则容易造成培养基pH值较低；碳源不足，又容易造成菌体的衰老和自溶，缩短代谢产物合成和分泌的时间。所以在考虑碳源、氮源时，要注意快速利用的碳（氮）源和慢速利用的碳（氮）源的相互配合，发挥各自的优势，避其所短。 如在四环素的发酵中，就某种菌株来说，碳、氮比在25:1时，产量最高。多数中药用菌的固体培养在营养菌丝生长阶段，碳、氮比为20:1；在子实体生长阶段，由于降低培养基中的氮源是产生子实体的前提条件，所以碳、氮比最好为(30 40)：1；中药用菌液体培养的目的是增加菌丝体产量，通常碳、氮比也为20:1。但经过大量的生产实践还发现许多菌种能在较宽的碳、氮比范围内生长，所以不同菌种合适的碳、氮比还需要在试验中进一步摸索。 除选择好适宜的碳、氮比之外，生理酸性和碱性物质的配比也显得非常重要，因为它会影响发酵液pH值的变化，影响菌体的生长、繁殖和发酵代谢产物的合成。因此，要密切注意在培养过程中的培养基pH值的变化，观察适合于菌体生长、繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同pH值，不断调整配比来适应上述各种情况和要求，注意每次只限变动一个条件。2从经济效益方面选择培养基的原料 在实验室中进行培养基的选择试验，培养基的经济性通常易被忽视。在大规模的工业生产过程中，由于配制发酵培养基的原料大多是粮食、油脂、蛋白质等，且工业发酵所消耗的原材料数量非常大。因此，在工业生产中选择培养基原料时，除考虑这些原料能否容易被微生物利用，满足生产工艺的要求外，还应考虑到经济效益。所以在选用原材料时，培养基来源应力求丰富，做到代粮节粮、储运方便、就地取材、价格低廉、降低成本。例如，蛋白胨价格较高，在利福霉素发酵时，可用豆饼粉代替。这些代用品几乎不消耗粮食，且价格低廉，同时发酵效果也不错。一些中药用菌的发酵常用粗粮、杂粮或粮食加工之后的下脚料作为原料，像玉米粉、蔗糖糖蜜、甜菜糖蜜等。还可利用野生植物淀粉的水解产物代替粮食作发酵原料。3培养基中原料的预处理 培养基中很多原料在使用前要进行预处理。如一些农产品或野生植物原料，最好先去皮壳，这样一方面可以防止其中有害物或单宁等被带入培养基中，影响微生物生长和产物形成；另一方面大量皮壳占有一定体积，降低了设备的利用率，而且还会堵塞设备或管道，增加流动阻力，影响生产正常进行。在酒精、丙酮、丁醇等的生产中，淀粉原料使用量大，需要预先进行蒸煮、糊化，使酵母有效地将其糖化。对于豆饼、玉米等不易溶解的块粒原料应事先加工成一定细度的粉状原料后再使用。另外，在进行原料预处理过程中要把握好度，若有关条件控制不当，将造成成分损失，甚至产生有害物质。如对于富含生长素的原料，如果处理过度，生长素破坏较多，对发酵影响非常大。4根据微生物的特点选择培养基 由于微生物的种类不同，其生理特性差异较大，代谢产物的合成途径也比较复杂。所以还必须对微生物的种类、生理特性、一般营养要求、产物的组成和代谢产物的合成途径等进行深入的研究。上述工作完成后才能进行培养基的选择。如某些霉菌发酵生产不宜使用液体培养基，如改用固体培养基培养种子，菌丝繁殖良好，黑曲霉生产糖化酶就是一个典型的例子。某些微生物能自身合成生长所需要的多种生长因子。因此，这些微生物能在无生长因子（如氨基酸、维生素、核苷酸）的培养基中良好地生长。对于一些不能合成自身生长所需要的部分或绝大部分生长因子的微生物来说，在选择培养基时，要选用含有生长因子的复合培养基，同时还要考虑微生物对某些生长因子的特殊需求，这样才能最大限度地满足菌体的正常生长、繁殖。5药性基质 药性基质是在中药发酵中应运而生的。以中药材作为药用菌发酵的基质，称为药性基质。这种药性基质既能生长菌体，又能利用药用菌的酶使中药成分分解、分化，有可能提高菌质药效。20世纪80年代人们受传统中药神曲发酵的启发，大胆地进行了尝试，首先合理地选出药性基质，将其灭菌，采用无菌操作技术，将药用菌接种在已灭菌后的药性基质上，通过一定的培养条件使其发酵，试验证实发酵组合中合理地选用药性基质，比仅用营养基质所产生的菌质药效有明显的提高。第二节 培养工艺方法 微生物的生长，除了受本身遗传特性决定以外，还受许多外界因素如氧气、温度、培养基pH值等的影响。进行微生物培养，其目的是提供一个适宜特定微生物生长的物理、化学环境，使其按照人们的需要大量地生长、繁殖。微生物培养的目的各有不同，有些是以大量增殖微生物菌体为目标（如单细胞蛋白或胞内产物），有些则是希望在微生物生长的同时，实现目标代谢产物的大量积累。一个良好的微生物培养装置的基本条件是：按照微生物生长特点进行科学的设计，为其提供丰富和均匀的营养物质，保证微生物获得适宜的温度和绝大多数微生物所必需的良好通气条件（除少数厌氧菌外）等，同时严防杂菌污染。根据微生物种类、培养目的和要求、规模和资金投入的不同，有不同形式的培养工艺方法。以下就实验室和生产实践中较有代表性的微生物培养工艺方法进行介绍。一、实验室微生物培养方法根据培养基物理性状的不同，将实验室微生物培养方法分成固体培养法和液体培养法。（一）固体培养法 固体培养就是将菌种接至疏松而富有营养的固体培养基中，在合适的条件下进行微生物培养的方法。固体培养在菌种的分离、纯化，微生物鉴定、保藏，生产种子的制备等方面发挥着重要作用。根据培养时是否需要氧气可分为以下两类形式： 1好氧培养法 实验室中将微生物菌种接种在固体培养基的表面，使之获得充足的氧气而生长，这种培养方法称为好氧培养法。在培养过程中根据所用器皿的不同可分为试管斜面、培养皿琼脂平板、较大型的克氏扁瓶和茄子瓶斜面等平板培养。 2厌氧培养法 某些微生物在培养过程中，不需要氧气的参加，这种培养称为厌氧培养法。厌氧培养是一个复杂的生物过程，它是通过人工的办法创造厌氧微生物所需要的营养条件和环境条件，使设备内积累高浓度的厌氧微生物，以加速厌氧培养的过程。最后生产出人们所需要的物质和能源等。 在培养厌氧微生物时，除去培养基中的氧气是非常关键的。在实验室中培养厌氧菌时，培养基中除了正常提供碳源、氮源、无机盐、生长因子和水五种营养要素外，还必须加入适当的还原剂以降低氧化还原电势。还原剂有谷胱甘肽、巯基醋酸盐等，必要时还需加入刃天青等氧化还原指示剂。除需要配制特殊的培养基以外，还需要特殊的培养装置。早期主要采用高层琼脂柱法、厌氧培养皿法，现在主要采用厌氧罐技术、厌氧手套箱技术。以下介绍几种厌氧微生物可采用的专门培养装置。 (1)高层琼脂柱 把含有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，然后高压灭菌，这样除表层尚有一些溶解氧外，越是深层其氧化还原势越低，创造无氧环境，使厌氧菌能够正常生长。如韦荣氏管( Veillon tube)就是一根长25cm，内径lcm，两端可用橡皮塞封闭的玻璃管。 (2)亨盖特滚筒技术 此法是由美国微生物学家REHungate于1950年设计的。主要原理是利用除氧铜柱制备高纯氮，并用高纯氮驱除小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌、储存以及接种、稀释、培养、观察、分离、移种和保藏等操作的全过程始终处于高度无氧的环境下，从而保证厌氧菌的存活。 (3)厌氧培养皿 目前用于厌氧培养的培养皿有几种设计，有的利用皿盖创造一个狭窄的空间，加上含有还原剂的培养基，创造无氧的环境，如Brewer皿；有的利用焦性没食子酸和NaOH反应消耗氧，从而创造无氧环境。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养如Spray皿和Bray皿。 (4)厌氧手套箱 厌氧手套箱是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌的最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱体结构严密，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，操作者可以通过与箱壁相连的手套进行箱内的操作。箱内充满85%的氮气、10%的氢气和5%的二氧化碳，同时用钯催化剂除去氧气，保证箱内处于严格无氧状态。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均属于自动调节。由于该箱中还可放入解剖显微镜，所以非常便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究。 (5)厌氧罐技术 该技术对厌氧罐反复抽真空、灌注氮气，即便是罐内剩余的氧气也要在钯催化剂的催化下与灌入混合气体中的氢气还原成水而除去。因此，在厌氧罐中能形成良好的无氧环境。 （二）液体培养法 液体培养法是将微生物接种到液体培养基中，通过这种方法可以使微生物迅速生长、繁殖，获得大量的培养物。在一定条件下，液体培养是微生物选择性增菌的有效方法。根据培养过程中是否需要氧气可分为以下两种类型： 1好氧培养法 在液体培养过程中需要通入氧气的培养法称为液体好氧培养法，实验室中好氧菌液体培养方法主要有以下四种： (1)试管液体培养 在试管中装入培养液，然后将待培养菌接入进行培养称试管液体培养。一般由于该法的通气效果较差，仅适用于微生物的各种生理、生化试验。 (2)三角瓶浅层液体培养 在三角烧瓶中装入浅层培养液，其通气量与装液量、棉塞通气程度密切相关。通气量与微生物的生长速度和生长量有很大关系，一般仅适用于兼性厌氧菌的培养。 (3)摇瓶培养 又称振荡培养。将装有液体培养基的三角瓶（摇瓶）用8 -12层纱布或用疏松的棉塞塞住，以阻止空气中杂菌或杂质进入瓶内，但空气可以透过阻隔供培养菌呼吸。将摇瓶放在摇床上以一定的速度保温、振荡培养。为使菌体获得充足的氧，一般装液量为三角瓶的10%左右。有时为提高搅拌效果，增加通气量，也可在三角瓶内设置挡板或添加玻璃珠等。摇瓶培养不仅操作简便，而且还可以将许多摇瓶（在大摇床上可多达上百个）同时在相同的温度和振荡速度等条件下进行培养试验。摇瓶培养在实验室里被广泛用于微生物的生理、生化试验、发酵和菌种筛选等，也常在发酵生产中用于种子培养。 (4)台式发酵罐 实验室用的台式发酵罐体积一般为几升到几十升，技术不是太先进。而商品台式发酵罐就不同了，一般都有多种自动控制和记录装置。如配置有pH值、溶解氧、温度和泡沫检测电极，有加热或冷却装置，有补料、消泡和pH值调节用的酸或碱贮罐及其自动传送装置。因为它的结构与生产上用的大型发酵罐接近，所以它是实验室模拟生产实践的一种非常好的试验工具。 2厌氧培养法 厌氧培养法需要特殊的培养装置和向厌氧罐或培养基中加入还原剂和氧化指示剂。若在厌氧罐或厌氧手套箱中进行液体培养，由于已经具备了厌氧环境，一般不需要提供额外的培养措施；若单独放在有氧条件下培养，则在培养基中必须加入巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C等有机还原剂，或加入铁丝等能显著降低氧化还原电位的无机还原剂。二、生产实践中微生物培养法根据培养基物理性状的不同，将生产实践中微生物培养方法分成固体培养法和液体培养法。 （一）固体培养法 培养基中虽然含水丰富，但没有或几乎没有自由流动的水，其基质是不溶于水的聚合物，呈固态。对于中药的固体培育可以说是中国特有的生产工艺，它既古老又年轻，有着特殊的作用。早在一千五百多年前，中国就已经用固体培养工艺制成著名的中药神曲，它是用麸皮、赤小豆、青蒿、辣蓼、苍耳、杏仁等混合作为药性基质，经过酵母菌自然发酵后的菌质，切块晒干后入药的，它具有健脾和胃、消食调中的功效，临床上应用非常广泛。到20世纪70年代又相继通过采用固体培养工艺得到了蜜环菌、云芝等约十余个中药产品。根据培养时是否需要氧气固体培养法可分为以下两种类型： 1好氧培养法 好氧固体培养法可分为浅盘固体培养法和深层固体培养法，统称为曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。工业生产中利用麸皮或米糠等作为主要原料，加水搅拌成为含水量适度的固体物料作为培养基，接种菌种进行培养，在豆酱、醋、酱油等酿造工业上被广泛应用。在生产实践中，好氧真菌的固体培养方法都是将接种后的固体基质薄薄地摊铺在容器的表面，这样既可使菌体获得充足的氧气，又可以将生长过程中产生的热量及时释放，这就是传统的曲法培养的基本原理。食用菌生产中通常将棉籽壳等培养料装入塑料袋中或平铺在床架上，接种培养。 固体培养具有以下优点： (1)原料 主要以谷物和农业废物为原料，外加适量水分、无机盐等，因此，培养基组成简单、经济核算。 (2)防止污染 霉菌能在水分较低的基质表面进行生长、增殖，而在这种条件下不利于细茵生长。因此，不易引起细菌污染。 (3)固体曲的酶活力较高 (4)通气 在曲房周围使用经过循环冷却、增湿的无菌空气来控制温度、湿度，并且能根据菌种不同生理时期的需要进行灵活调节。在固体培养中，氧气是通过基质粒子间空隙的空气直接供给微生物的，同液体培养时用通气搅拌供给氧气相比，具有节能的优点。 2厌氧培养法 生产实践中对厌氧菌进行大规模固态培养的例子还不多见。在我国传统白酒的生产中，一向采用大型深层地窖对固态发酵料进行堆积式固态发酵，对酵母菌的酒精发酵和乙酸菌的乙酸发酵等都十分有利，因此，可生产名优大曲酒（蒸馏白酒）。 （二）液体培养法 液体培养法是将营养物质溶解在液体中作为培养基，然后接入菌种，通过一段时间培养得到目的产物。我国历史上的液体培养是在抗生素工业上发展起来的，后来运用到中药的发酵中。人们在长期的实践中发现，通过中药的液体培养，不但能够大量增殖菌丝或孢子，还可在发酵液中得到多糖、多肽、生物碱、核酸、维生素等具有生理活性作用的各种化合物。这些物质对心血管、神经系统、肝脏、肾脏等人体器官具有防病、治病的作用，并具有抗癌、抗炎、抗菌、抗溃疡和抗衰老等的功效。目前国内以药用真菌发酵液为原料得到的制剂产品主要有灵芝片、灵芝糖浆、安络痛片、金水宝胶囊、宁心宝胶囊等。液体培养的优点是规模大，可以进行工业化连续生产，产量高，生产效率高，适于机械化和自动化生产。所以它是当前微生物发酵工业的主要生产方式。液体培养有静置培养和通气培养两种类型，静置培养适于厌氧菌发酵，如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等发酵；通气发酵适于好氧菌发酵，如抗生素、氨基酸、核苷酸等发酵。1好氧培养法 早期的青霉素和柠檬酸等的发酵工业中均使用过浅盘液体培养法。该法在容器中盛装浅层液体静止培养，没有通气搅拌设备，全靠液体表面与空气接触进行氧气交换，这是最为原始的液体培养形式，因其劳动强度大、生产效率低以及容易污染杂菌等缺点，未能得到广泛应用。现代发酵工业中主要采用深层液体培养法，该法向培养液中强制通风，并设法将气泡微小化，使它尽可能滞留于培养液中以促进氧的溶解。深层液体培养基本操作有3个控制点。 (1)灭菌 发酵工业要求纯培养，因此，在发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌。 (2)温度控制 由于在微生物的增殖、发酵和搅拌时会产生热量，为维持温度的相对恒定，必须在夹套中让冷却水循环流过，以及时带走过多的热量。 (3)通气、搅拌 空气进入发酵罐前应先经空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，然后由罐底部进人，再通过搅拌将空气分散成徽小气泡。搅拌的目的除了溶解氧之外，还可使培养液中微生物均匀地分散在发酵罐内，促进热传递，以及使加入的酸和碱分散均匀而调节pH值等。 综上所述，该法的特点是能够根据生产菌种对于代谢营养要求以及不同生理时期为微生物提供丰富而均匀的养料、良好的通气和搅拌、适宜的温度和酸碱度，并能确保防止杂菌污染。深层液体培养生产效率较高，易于控制，产品质量稳定，因而在发酵工业中被广泛应用。液体曲、柠檬酸、谷氨酸、肌苷酸、灵芝、冬虫夏草及其他中药发酵产品先后采用此法进行生产。2厌氧培养法 工业上的厌氧培养法主要采用将液体静置，接种后不通空气厌氧静置保温培养，常用于酒精、丙酮、乳酸等发酵。酒精可用于食品工业、化学工业、医药工业等许多领域。食品工业中，酒精主要作为配制各类白酒、强化葡萄酒、保健酒、药酒的主要原料。酒，素有“百药之长”之称。因为酒精是一种良好的半极性有机溶剂，中药中的各种有效成分都易溶于其中，在酒精或酿造酒精的过程中配入不同的中药材即可制得药酒和保健酒。然而药物的配入是有针对性和选择性的，都是按特定要求加入的，因此，配入酒中的药物不同，其作用也不同。就其总体而言，将强身健体的中药与酒“溶”于一体，既右补益人体之阴、阳、气、血偏虚，祛邪治病的作用；又有保健强身的作用。其用药讲究配伍，根据其功能可分为补气、补血、滋阴、补阳和气血双补等类型。该发酵培养法发酵速度快、周期短、发酵完全、原料利用率高，适合大规模机械化、连续化和自动化生产。三、载体培养 载体培养脱胎于曲法培养，同时又吸收了液体培养的优点，是近年来新发展的一种培养方法。载体培养的特点是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质，以其作为微生物的载体。在培养过程中营养成分可以严格控制，发酵结束后，只需将菌体和培养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。载体几何形状无特殊要求，但形体大小应有适当范围。载体的取材必须耐蒸汽加热或药物灭菌，多孔结构既有足够的表面积，又允许空气流通。载体种类，目前以脲烷泡沫塑料块用得较多，石棉已很少采用。据报道，利用载体培养法培养霉菌、酵母、放线菌可以提取多种产物，如色素、肌苷酸、酶等。第三节 菌种扩大培养 现代的发酵工业生产规模越来越大，每只发酵罐容积已达几十或几百立方米。如按百分之十左右的种子量计算，需要投入几立方米或几十立方米的种子，显然需要的种子量是非常巨大的。而通过保藏的工业微生物菌种的数量相对较少，远远不能满足工业生产中对种子的需求，所以要进行生产菌种的扩大培养。 生产菌种的扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程，这些纯种培养物称为种子。显然菌种扩大培养的目的是为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。 从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产菌种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。其生产方法与培养条件将随不同菌种而异。如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢不同，产孢子能力的大小不同，对营养、温度、需氧等条件的要求均有所不同。因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。这种种子接入发酵罐后，不仅能够缩短发酵周期、提高产量，而且还能提高设备利用率。可见种子质量的优劣对发酵生产起着关键的作用。对优良种子的主要要求是：生理性状稳定；菌种细胞的活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；能够保持稳定的生产能力；无杂菌污染。 种子扩大培养大致可分为实验室种子制备阶段和生产车间种子制备阶段。实验室制备阶段包括琼脂斜面、固体培养基扩大培养或摇瓶液体培养。生产车间种子制备阶段的任务是种子罐扩大培养。一、实验室种子制备 实验室种子制备是将深藏在砂土管或冷冻干燥管中的菌种经无菌手段接人适合于孢子发芽或菌丝体生长的斜面培养基中，经培养成熟后挑选菌落正常的孢子再一次接入试管斜面。实验室种子制备一般采用两种方式：产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便且不易污染杂菌，这种方法为孢子制备。而对于产孢子能力弱或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养基培养孢子，这种方法为种子制备。（一）孢子制备 孢子制备是制备种子的开始，是发酵过程的开端，由于孢子的质量、数量财以后菌丝体的生长、繁殖和发酵水平都有明显的影响。因而是一个非常重要的环节。菌种不同，孢子的制备工艺也有所不同。下面我们将以放线菌、霉菌和细菌为例，分别对其一般制备工艺、制备过程中的注意事项、影响孢子质量的因素及其控制方法等加以介绍。 1不同菌种孢子的制备工艺 (1)放线菌类孢子 1)培养基 放线菌类孢子培养多数采用人工合成的琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。由于碳源丰富容易造成生理酸性的营养环境，不利于放线菌孢子的形成；而氮源丰富则有利于菌丝繁殖但不利于孢子形成，所以碳、氮源不要太丰富。实验表明，碳、氮之比以氮少一些为好。其一般工艺流程如下。 2)培养条件及保藏 放线菌类孢子的培养温度大多数为28，部分菌种可达37。不同菌种培养时间是有差异的，但一般都在5 -14天内。孢子成熟后，为保持其生活力，应置于5冰箱（库）内保存备用。存放时间不宜过长，一般在1周时间内，少数品种可存放13个月。 3)注意事项 菌种从沙土管移接斜面时，为保证原菌种的进一步保藏，应绝对严格地使用干接法，严禁将水分带入沙土管内。具体操作方法是直接从沙土管内取适量沙土孢子，均匀地散布在琼脂斜面培养基上，力求长出的菌落密度合适、分布均匀。 斜面孢子移植时，最好采用点种法，原则上要求挑选正常的菌落一只，最多23只进行斜面传代。在斜面传代过程中，为防止衰老和变异，传代最好不要超过三代。 (2)霉菌类孢子 1)培养基 霉菌类孢子的培养多数采用大米、小米、麦麸、麦粒等天然农产品为培养基。这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌孢子的繁殖，而且这类培养基的面积较大，可获得大量的孢子。另外，这些营养物质来源丰富，简单易得，价格低廉，比琼脂培养基产孢子量大得多，其一般工艺流程如下。 2)培养条件及保藏 霉菌类孢子的培养温度一般为25 28，不同菌种培养时间是有差异的，但一般都在4l4天。为了保证培养过程中通气均匀，在培养时要注意翻动。制备好昀大米或小米孢子，可放在5冰箱中保存备用；如欲延长保存时间，可将大米或小米孢子中的水分用真空抽干，使其含水量在10%以下保存，这种干燥孢子菌种可在生产上连续使用半年左右，这对稳定生产是很有好处的。这种抽干法保存主要适用于孢子制备，纯粹的菌丝不能采用此法保存，因为容易引起死亡。 3)注意事项 接种时应选择中央丰满部分的孢子，不要触及菌落边缘的菌丝。当接种完毕后，应将大米等固体培养基敲翻一次，使孢子悬浮液同培养基混合均匀。 (3)细菌类孢子 1)培养基 细菌的斜面培养基多采用碳源限量、氮源丰富的配方，在氮源方面如牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。其一般工艺流程如下（图3 -5）。 2)培养条件及保藏 细菌孢子的培养温度一般为37，也有少数为28左右的，培养时间因菌种不同而异，多数为12天，产芽孢的细菌需培养510天。制备好的原种一般保存在冷冻管内，有些芽孢杆菌亦可用斜面或沙土管保存。 3)注意事项 在制备细菌类孢子斜面时，先在冷冻管或母斜面中放入适量无菌水，制成孢子悬浮液后接人空白斜面。在接种时一定要控制好斜面的涂布面积，尽量做到使菌落分布均匀，密度适宜。 2影响孢子质量的因素 (1)原材料质量 生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量发生了波动。例如，在生产实践中发现，琼脂的牌号不同，将会对孢子的质量产生影响；在四环素、土霉素生产中，制备产孢子斜面培养基用的麸皮因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量也产生了影响。据分析，原材料质量的波动也可能是由于其中无机离子种类和含量不同造成的，如适量微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成；另外，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。基于土述情况的出现，提出了具体操作中的要求：培养基所用原料要经过发酵试验合格才可被使用；严格控制灭菌后培养基的质量。 (2)培养条件 1)培养温度 培养温度对多数微生物菌种斜面孢子质量有显著的影响，特别是高温影响更显著。如土霉素生产菌种在高于37培养时孢子成熟早、易老化，孢子接人发酵罐后出现糖代谢变慢、氨基酸提前回升、菌丝过早自溶、效价降低。链霉素产生菌灰色链真菌的斜面孢子，必须在26. 5 - 27. 50下培养，超过28斜面孢子的生长会变得不正常。所以一般各生产单位都要严格控制孢子斜面的培养温度。 2)培养湿度 制备斜面孢子培养基的相对湿度对孢子的数量和质量均有较大的影响。如北方冬季气温低而干燥，斜面水分很快蒸发使斜面上部干瘪，菌落长不出来；而夏季气温高及相对湿度较大，由于斜面下部冷凝水较多而不利于菌落生长。实验表明，在一定条件下培养斜面孢子时，若北方相对湿度控制在40% 45%、南方控制在35%42%，所得的孢子较成熟、且孢子颜色均匀、数量适中、质量较好，这种孢子进罐后萌发时间早，糖氮代谢快，发酵单位增长快。 若孢子在恒温箱培养，由于恒温箱中相对湿度偏低，可放入盛水的平皿使相对湿度捉高。同时为保证新鲜空气的交换，利于孢子的生长，恒温箱最好每天开启几次，开启时间不宜过长，每次凡秒钟就可以了。 3培养和冷藏时间 (1)培养时间 一般来说，孢子的培养时间应该控制在孢子量多、成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。如果培养时间过长，孢子衰老，衰老的孢子已逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。所以衰老的孢子显然不如年轻的孢子。 (2)冷藏时间 斜面孢子的冷藏时间，对孢子的质量影响也很显著。冷藏时间随菌种不同而异，因此，不能干篇一律。斜面冷藏孢子的冷藏时间与孢子成熟程度有关。成熟的斜面孢子耐冷藏，如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4冰箱内保存，冷藏78天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，由于孢子完全成熟，20天未发现自溶。但冷藏时间过长菌种特性会衰退，所以总的原则是宜短不宜长，一般不超过7天。冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如，在链霉素生产中，斜面孢子在6冷藏2个月后的发酵单位比冷藏1个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。 4孢子龄及接种量的影响 研究表明，孢子过于年轻经不起冷藏，过于衰老其生产能力又会下降。一般来说孢子龄应控制在孢子量多、孢子成熟、发酵单位正常的阶段。 接种量的大小影响到培养基中孢子的数量，进丽影响菌体的生理状况。如青霉素产生菌中的球状菌种的孢子数量对发酵单位影响极大，因为若孢子量过多，则接入罐内不能很好地维持球状体；若孢子量过少，接人罐内长出的球状体过大，影响通气效果。实验证明，若能严格控制球状孢子的数量，就能保证孢子质量，获得稳定的、高产量的青霉素。 下面我们对斜面孢子的质量标准进行一个简单的总结：总体原则是以菌落的形态、色泽、密度、孢子量及色素分泌为指标。如果是传代用的斜面孢子要求菌落分布较稀，适于挑选单个菌落。如果是接种摇瓶或进罐的斜面孢子，要求菌落密度适中或稍密、菌落正常、大小均匀、孢子丰满、孢子颜色及分泌色素正常、孢子量符合要求。最后为确保孢子质量还应考察发芽率、变异率和保证无杂菌，必要时还要观察摇瓶发酵单位。（二）摇瓶种子制备 以孢子形式的种子直接进发酵罐，一方面工艺路线较短，容易控制；另一方面斜面孢子易于保藏。如果菌种纯度高，一次可以制备