从噬菌体展示随机肽库中淘选多肽药物.doc

北京大学政学者论文集（2002年） 从噬菌体展示随机肽库中淘选药物从噬菌体展示随机肽库中淘选多肽药物Selection of Peptide drugs from Phage-displayed Random Peptide Library生命科学学院99级沈抒殚摘要以凝血酶为靶分子，利用噬菌体展示和亲和淘选技术，从随机十五肽库中筛选到结合凝血酶的3个特异结合肽克隆，并对其中结合活性最强的短肽进行了序列测定。ELISA鉴定结果表明，3个克隆对于凝血酶都有一定的结合能力，且都与凝血酶的天然抑制剂水蛭素产生竞争。关键词：噬菌体展示，随机肽库，淘选，凝血酶AbstractThrombin as target molecule, and with the new bio-technique of phage display and biopanning, 3 special binding peptide clones were selected out from a phage-displayed random 15-peptide library. The sequence of the clone, which had the highest affinity with thrombin, has been determined. Data of ELISA showed that all the three clones could be combined to thrombin to some extent. And all of them could compete with hirudin, which is the natural inhibitor of thrombin.Key words: phage display, random peptide library, biopanning, thrombin一、 前言噬菌体展示随机多肽库噬菌体展示随机多肽库技术是以噬菌体展示技术（phage display）为基础的。1985年由Smith1首次通过基因工程手段将外源蛋白质与噬菌体的次要外壳蛋白p形成融合蛋白展示于噬菌体颗粒表面，可保持相对独立的空间构象和生物活性，而不影响重组噬菌体对宿主菌的感染能力。与其他基因表达系统相比较，噬菌体展示技术的最大特点就是它有效地将被展示多肽或蛋白质和基因偶联起来，构成一个实体，因而在得到某种多肽结构的同时也就获得了它的基因。p蛋白因其序列中含有SGGG或SGGGG的重复而具有空间结构的灵活性，因此更适于在N端展示目的蛋白而不影响其空间结构。p位于丝状噬菌体尾端，具有识别和吸附大肠杆菌性菌毛的功能，为解决融合蛋白失去感染能力这一问题，常采用噬菌质粒和辅助噬菌体双基因组系统。噬菌质粒中p基因与外源基因融合，辅助噬菌体M13KO7中的p基因为野生型。当噬菌体颗粒组装时，噬菌质粒DNA被优先包装，这时组装好的噬菌体外壳有一拷贝的p融合蛋白，其余为野生型p蛋白，称为单价展示。单价展示时噬菌体感染能力不受影响，而且有利于淘选出高亲和力的目的重组噬菌体。在丝状噬菌体p 基因一侧插入特定长度的随机寡核苷酸，从而在噬菌体表面展示与p融合的随机多肽；由于每一个噬菌体呈现一种序列的外源多肽，那么展示特定长度各种不同序列外源多肽的噬菌体集合体就构成一个完整的随机多肽展示库。本实验室利用改建的噬菌体展示载体pCANTAB5G8构建了噬菌体展示随机十五肽库。拟从中淘选靶蛋白的结合多肽。亲和淘选表达于噬菌体表面的融合多肽或蛋白质能被特异性的抗体识别。如果将某种抗体包被于固相载体，就可将表达有相应抗原的噬菌体克隆从众多的噬菌体中分离纯化出来，且抗原的氨基酸序列又可以通过对噬菌体重组体的DNA测序而获得。按照同样原理，可以分离到蛋白质特异结合的配体。随机多肽展示库的出现充分利用了噬菌体展示技术的特点和优势，以生物合成肽库来实现化学合成肽库的功能和用途，并且更加经济和便利。近10年来，大量的研究小组利用噬菌体展示随机多肽库技术构建了不同种类的噬菌体展示多肽库，并从中筛选到不同靶物质结合的多肽，使该技术在多个研究领域得到广泛应用。噬菌体展示随机肽库的筛选是一个亲和纯化（affinity purification）的生物淘选(biopanning)过程。其具体过程是：先将噬菌体肽库与靶分子相互作用一段时间，接着洗涤除去非特异结合噬菌体，将特异性结合噬菌体洗脱下来扩增，然后再投入下一轮的淘选。继续重复淘选、洗脱、扩增，最终淘选出特异结合的重组噬菌体克隆。凝血酶结合肽凝血酶(thrombin，II)是一种生成于损伤处血管内皮细胞的多功能丝氨酸蛋白酶，它能水解血纤维蛋白原的4个Arg-Gly肽键，产生不溶性的纤维蛋白，使血液变成凝胶而发生凝固。凝血酶不仅在凝血瀑布反应中起着关键酶的作用，还可能诱发炎症、增生及修复等反应，而且能够和包括神经细胞在内的多种细胞发生反应，并影响其行为。凝血酶如此广泛的生理效应大部分由凝血酶受体介导。本实验以凝血酶为靶蛋白，从噬菌体展示随机十五肽库中淘选与凝血酶特异结合的多肽。在理论上可以通过对凝血酶结合多肽的序列性质分析来研究凝血酶受体的可能性质；在应用上通过对凝血酶结合肽的研究可以期望进一步找出有效的抗血栓药，具有一定的实际意义。二、 实验材料（一） 菌株大肠杆菌(Escherichia coli) TG1，辅助噬菌体M13KO7均为本实验室保存。（二） 主要试剂噬菌体展示十五肽库为本实验室构建（库容量1.36108），凝血酶购自Pharmacia公司，粗制牛凝血酶为天津血液所产品，凝血酶底物Chromzym TH 购自Boehringer Mannheim公司，HRPM13抗体购自华美公司， 96孔酶标板为Nunc公司产品,ELISA试剂均为华美公司产品。主要溶液的配制：PBS： 1PBS： 133mmol/l NaCl3mmol/L KCl8mmol/L Na2HPO41.5mmol/L KH2PO410PBS： 80.0g NaCl 2.0g KCl 11.5g Na2HPO47H2O 20.0g KH2PO4溶于1升H2O中，调至pH 7.5，高压灭菌。PBS-Tween 20 (PBST)：1升1PBS中加入1ml 吐温（Tween）20。PBSM: 100ml PBS中加入2g脱脂奶粉，离心取上清。50mmol/L 甘氨酸HCl (Gly-HCl), pH 2.0: 1mol/L 贮存液: 111.6g 甘氨酸 溶于1L H2O中，HCl调成pH2.0，高压灭菌。200mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.5)： 1mol/L贮存液: 44.16g NaH2PO42H2O 450.66g Na2HPO47H2O 溶于1LH2O中，高压灭菌。20%PEG-8000/2.5M NaCl: 200.0g polyethylene glycol 8000 146.1g NaCl 溶于1LH2O中，0.22um滤膜过滤除菌。邻苯二胺(OPD)底物缓冲液: 2.84g Na2HPO47H2O 2.10g Citric Acid 溶于100mlH2O中，pH5.0M9培养基平板的配制：瓶1： 0.6g Na2HPO4 0.3g KH2PO4 0.1g NH4Cl将上述试剂溶于50 ml H2O中，NaOH调至pH7.4。 瓶2：1.5g 琼脂粉溶于50 ml H2O中。将瓶1、瓶2高压灭菌后，冷却至5060时加入： 0.1 ml 1mol/L MgCl2 0.1 ml 1mol/L CaCl20.5 ml 1mol/L 葡萄糖0.2 ml 0.5mol/L 维生素B1立即将瓶1、瓶2混匀倒平板。（三）、主要仪器DG5031型 酶联免疫检测仪，华东电子集团公司医疗电子仪器厂JJT-7B洁净工作台，北京半导体设备一厂THZ-C恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂DF-C型恒压恒流电泳仪， 北京东方仪器厂DYY-23A型电泳槽，北京市六一仪器厂DYY-31B型电泳槽，北京市六一仪器厂台式冷冻离心机 Sigma 1K15，Sigma 公司三、 实验方法1.淘选过程1.1 噬菌体展示随机十五肽库的扩增1.1.1从M9平板培养基上挑取TG1单菌落于3ml LB培养基，37振荡培养过夜。1:100转接至50ml LB培养基中，摇至对数期。取原库10ul (1012cfu/ml)，于37摇床低速(7090rpm)感染30min。再加入M13KO7，使感染系数达到10:1(M13K07:宿主菌10:1)。37摇床低速感染30min. 取出菌液,5000 rpm 离心10分钟。去上清，将菌体重悬至200ml 2YTAK (2YT，含100ug/ml 氨苄青霉素，50ug/ml卡那霉素)。37210rpm 振荡培养1216小时。1.1.2取菌液5000rpm离心10分钟，取上清。加1/4 体积的PEG/NaCl，振荡混匀，冰上放置1小时。412000rpm离心20分钟，去上清。适量PBS重悬沉淀，使沉淀尽量溶解。10000rpm 离心10分钟。取上清，加1/4 体积PEG/NaCl，振荡混匀，冰上放置1小时。412000rpm离心20分钟，去上清。适量PBS重悬溶解，10000rpm离心10分钟。取上清，即得扩增后的噬菌体库。1.1.3用灭菌的PBS溶液梯度稀释噬菌体液，取9次，10次，11次的稀释液各50ul，加入已经转接培养到对数期的新鲜TG1菌液50ul，混匀，37温育20分钟。全部涂含Amp100ug/ml的LB固体平板。37温箱培养过夜。次日计单菌落数，计算滴度。1.2 凝血酶结合肽的亲和淘选1.2.1包被 1PBS稀释凝血酶，100ul包被酶标板，6ug/孔。以100ul PBS包被空白对照孔。4静置过夜。1.2.2封闭 吸出包被液。2%PBSM加满各孔，37静置2小时，或4包被过夜。1.2.3结合 吸出封闭液，如前所述以PBST和PBS各洗涤2-3次，拍尽洗涤液。各孔加入100ul以封闭液稀释的随机十五肽库液体（噬菌体滴度大于库容量的1000倍），37缓慢摇动或静置2个小时。1.2.4洗脱 吸出噬菌体液，PBST洗10次，PBS洗10次，拍尽洗涤液，以除去未结合的噬菌体粒子。各孔加入100ul甘氨酸HCl (pH2.0)，37缓慢摇动或静置15分钟。吸出洗脱液，加等体积pH 7.5 磷酸钠缓冲液中和。1.2.5. 测滴度 各孔取10ul中和液进行梯度稀释，取2，3，4次稀释度，按照1.1.3测滴度，计算洗脱噬菌体总数。1.2.6扩增 剩余的洗脱噬菌体液加入到3ml新鲜TG1溶液中，吸附30-60min。加M13K07，使感染系数达到10:1,吸附3060min。5000rpm10min离心菌体，重悬至3ml 2YTAK中。37210rpm振荡培养1216小时。按照1.1的步骤提取噬菌体，并测得扩增后的滴度。(对照孔所得噬菌体液无需扩增)1.2.7 重复淘选 后面几轮筛库，步骤同第一轮淘选。但蛋白包被量递减。第二轮2.5ug/孔，第三轮1.5ug/孔，第四轮1ug/孔。最后一轮筛得的噬菌体测滴度所得的单菌落保留。由于第四轮之后回收率没有明显增加了，故不再继续筛选。2.阳性克隆的挑选2.1.牛凝血酶的初步纯化CM Sepharose FF离子柱，用20mmol/L pH6.0的磷酸缓冲液平衡，并溶解粗凝血酶制剂。福林酚法测蛋白浓度。上样，以20mM pH6.0的磷酸缓冲液淋洗，至透过峰流出。先后以pH 6.0的0.2M，0.3M 磷酸缓冲液梯度洗脱。检测洗脱液的活性，将洗脱液样品和凝血酶活性底物TH加入测活缓冲溶液中，37水浴5分钟，有颜色的则为有活性样品。收集有活性部分。透析，测蛋白浓度，冻干。2.2随机挑选噬菌体克隆2.2.1.从最后一轮保存的平板上，随机挑选20个分离良好的单菌落，于3ml LB(Amp100ug/ml)中37振荡培养过夜。1:100转接于3ml LB(Amp)中振荡培养至对数期。各加入M13K07使感染系数达到10。缓慢振荡30min。5000rpm10min，离心菌体。弃上清，将菌体重悬至3ml LBAK或2YTAK中，37振荡12至16小时。 2.2.2. 如1.1.2所述，提取噬菌体。2.3用ELISA方法初步挑选阳性克隆2.3.1. 包被 取PBS稀释的经初步纯化的凝血酶100ul(约含凝血酶0.25ug/孔)包被酶标板，4静置过夜。2.3.2封闭 吸出包被液，加200ul 2%PBSM，37静置2小时或4过夜。2.3.3结合 出封闭液，如前所述地洗涤，每孔加入100ulPBSM稀释的单克隆噬菌体液，37静置2小时。2.3.4抗体结合 甩出噬菌体液，洗涤。每孔加入以封闭液1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的M13噬菌体抗体100ul，37静置2小时。2.3.5显色 甩出抗体溶液，洗涤。各加100ul OPD显色底物溶液，37于黑暗处显色30min。2.3.6. 终止 加入2mol/L的H2SO4溶液50ul，终止反应。2.3.7. 读取各孔490nm处的吸光度值。记录数据。从中挑出ELISA 阳性隆。2.4 ELISA进一步鉴定阳性克隆2.4.1扩增2.2.3中挑选出的阳性克隆。2.4.2纯凝血酶0.25ug/孔包被酶标板，按照2.2.3 进行ELISA检测。3阳性克隆与水蛭素的竞争作用3.1. 于两组酶标板孔中包被初步纯化的凝血酶溶液100ul，各含凝血酶约0.1ug/孔。3.2. 200ul PBSM封闭，372小时。3.3. 一组继续封闭，一组加上封闭液稀释的10ug/ml水蛭素溶液100ul/孔。水蛭素与凝血酶特异结合，分子量约7K，凝血酶分子量约35K，1ug/孔保证水蛭素对凝血酶大大过量。3.4.取2.2.4鉴定为阳性的克隆的扩增液，100ul/孔结合。3.5 加HRPM13抗体结合，显色，终止。测490nm吸光度值。4. 测序将结合活性最强的4号克隆送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。四、 实验结果1.凝血酶结合肽的淘选以凝血酶为靶分子，以酶标板为固相载体，对噬菌体展示随机十五肽库进行了四轮的淘选。各轮的淘选数据如下表所示。表1.各轮淘选数据轮次 凝血酶（ug/孔） 投入噬菌体(cfu) 回收噬菌体(cfu) 回收率（/ug） P/N 1 6.0 7.51011 6.4106 1.410-6 13 2 2.5 3.01011 8.2106 1.110-5 35 3 1.5 1.01011 7.5106 5.010-5 50 4 1.0 1.01011 5.2106 5.210-5 40淘选过程中逐步减少靶蛋白的量以提高淘选效果。第一轮靶蛋白为6g/孔，第二轮为2.5ug/孔，第三轮为1.5g/孔，第四轮为1g/孔。这样有利于淘选到高亲和力的结合肽。表中的P/N值为包被凝血酶的孔和空白孔所洗脱回收的噬菌体数之比，每一轮的P/N值都大于10,可见每一轮筛选都有一定的特异性。回收率代表富集程度。各轮的回收率如下图所示。图1. 各轮淘选回收率示意图由图可见，各轮的富集程度有明显的增加，第三轮之后就趋于平稳。故第四轮之后不再继续筛选。2.牛凝血酶的初步纯化以CM Sepharose FF离子柱，采用梯度洗脱的策略，0.3M pH6.0 磷酸盐缓冲液洗脱峰有凝血酶活性。纯化前后的SDSPage 蛋白电泳图如下。 凝血酶 1 2 3图2.SDSPage蛋白电泳图lane 1: 标准蛋白marker，从上至下分别为94K，67K，43K，30K，20.1K，14.4Klane 2: 粗凝血酶样品lane 3: 离子柱纯化后样品 上样前12.99mg,得到1.58mg的产物。由电泳图可看出，经初步纯化的凝血酶仍有两条杂带，并且凝血酶的含量不到50%。但是，鉴于只是用来初步淘选出有阳性可能的克隆，对纯度不做太高要求。3.阳性克隆的挑选包被经初步提纯的凝血酶，用ELISA检验随机挑选出来的20个克隆，从中挑出有阳性可能的3个克隆。实验数据见下表。 表2. 随机挑选20个克隆的ELISA A490nm值123 456789100.1040.2050.0530.7550.8870.1020.0810.0840.5440.2040.169+111213141516171819200.9070.1670.2050.0310.2010.6140.1650.2090.2150.2080.176其中，“”表示只包被蛋白，不加噬菌体的阴性对照。“”表示直接包被M13K07的阳性对照。由上表可以看出，3号，4号，15号克隆，具有较高的阳性。4.阳性克隆的鉴定将粗凝血酶挑选出来的3个候选阳性克隆，用购自Pharmacia公司的凝血酶进行ELISA鉴定。实验数据见下表 表3. 阳性克隆的鉴定34150.0650.3650.4650.3430.578 可见，3号，4号，15号的确是与凝血酶有较高的结合能力。5.阳性克隆对水蛭素的竞争作用水蛭素是凝血酶的天然抑制剂。在竞争性ELISA实验中，一组以阳性克隆和凝血酶直接结合；一组凝血酶经水蛭素结合后，再与阳性克隆作用。两组的结合活性有明显的差异。实验数据见下表。 3415A00430128015900770366B00350322040402110377B-A019402460134表4.阳性克隆对水蛭素的竞争作用其中，A 是包被凝血酶，结合M13K07的阴性对照 B 是包被凝血酶，不结合噬菌体的阴性对照A3A15是凝血酶结合水蛭素后再与噬菌体结合的实验组B3B15是凝血酶直接与噬菌体结合的实验组A,B是重复的阳性对照，直接包被M13K07。由上表可以看出，水蛭素对3号，4号，15号克隆均有竞争作用，尤其是4号克隆最为明显。由此我们推测，所筛得的噬菌体克隆所展示的十五肽和水蛭素凝血酶的结合位点可能具有某种相似性，特异结合肽可能具有抑制凝血酶活性。6.测序4号克隆所展示的十五肽序列如下五、 实验讨论噬菌体展示多肽库技术的淘选方法主要以噬菌体表面展示多肽与靶物质的结合为基础，由Smith等建立的亲和选择（affinity selection）方法和理论一直延用至今。（见图3）在阳性克隆的富集过程中，有两个因素需要着重加以考虑，一是回收率（yield）；一是选择强度（stringency）。所谓回收率，即在每一轮亲和淘选中，洗脱下来的噬菌体克隆数与加入用的噬菌体克隆数之比。所谓选择强度，即指各种实验因素对噬菌体多肽与选择配基或固相载体结合的影响。选择强度越高，阳性克隆的亲和力越高。淘选实验中的多种实验因素均会影响选择强度，其中最重要的是所用靶分子的用量。一般降低靶分子用量或浓度，可提高选择强度，增强所得噬菌体克隆与配基间的亲和力。其他影响因素则包括漂洗时间、洗脱液的pH值33或竞争性洗脱时竞争剂的用量等。随着选择强度的提高，回收率会随之降低，因而在亲和淘选中并不能一味提高选择强度。为解决这一矛盾，通常遵循的基本原则是，第一轮淘选时保证获得较高的回收率是最重要的考虑，后续各轮的淘选则强调选择强度。因为第一轮淘选时，阳性克隆在原始肽库中的比例和数量很低，若选择强度过高，极易导致阳性克隆的丢失，且在后几轮的淘选中不可弥补。经过第一轮的淘选后，阳性克隆获得了一次富集和扩增，数量和比例均得以大幅度提升，因此在随后的淘选中，即使加大选择强度，阳性克隆已不易丢失。此时，通过增加选择强度以提高阳性克隆的比例就成为可能。通常采用的方法是，第一轮淘选时，使用较大量的靶分子（如 l10g），而在后续几轮淘选中则试用不同的靶分子用量（lg以下）。 图3. 亲和淘选的一般步骤亲和淘选中，即使经过多轮淘选，也不能排除非特异性噬菌体克隆的存在，因而进一步挑选单个克隆确定它与选择配基的特异性吸附是必不可少的实验步骤。通常采用的方法有酶联免疫分析（ELISA）。由于ELISA鉴定得到A490nm值随着很多因素改变，不同次重复中数值常有波动。包被的蛋白量，包被等各步骤的时间长短，洗涤的不同程度，酶标板本身的差异等等，都会引入数值上的差异。现将本实验中上述几次鉴定得到的数值作图。 由上图看出，3个克隆的A490nm值在不同次重复中具有良好的平行性，它们的阳性是可靠的。但是ELISA只可用于半定量的测定噬菌体克隆和靶分子之间的结合能力，要真正地确定所淘选到的多肽是否具有特异结合活性，是否能作为药物，还要在人工合成多肽之后进行细胞、组织、动物体等一系列水平上的进一步测定。六.小结以凝血酶为靶分子，利用噬菌体展示和亲和淘选技术，从噬菌体展示随机十五肽库中筛选到3个特异克隆。经ELISA分析，这3个克隆都具有一定的特异结合凝血酶的能力。经过竞争性ELISA分析，3个克隆能与水蛭素竞争结合凝血酶，说明它们都具有作为凝血酶抑制剂和制备抗拴药物的前景。还需要进一步测定3个多肽体外抑制凝血酶的活性，以及其他细胞学，组织学，生理学上的测试。致谢首先感谢李政道先生的慷慨资助和对祖国青年学生的殷切关注，让我有了这个机会，提前一年走入了科学研究的殿堂。对我而言，这是一次足以影响人生走向的机遇和挑战。我在这一年里锻炼自己，也更了解自己。它将是我人生际遇中一段珍贵的经历。感谢导师朱圣庚教授，他的严谨求实、一丝不苟做学问的可贵精神深深感动着我。每当看见朱老师为我批阅论文时连一个标点符号都不放过的认真精神，我都暗自敬佩。感谢朱老师在这个过程中给我的所有指导和所有批评，让我看到了自己身上很多很多的不足之处。我会在今后的日子里努力改正。感谢实验室里的黄仪秀教授，洪龙老师，赵乐群、杨柏成、董晓明、谭涛超、聂敏、毕群、赵佳慧、岑晓东等一年来对我的无私帮助。他们在具体的实验操作上时时指点，在日常生活上常常关心，是我的良师益友。感谢顾军教授在这一年最后阶段实验的指导。感谢顾军实验室的韦锦学、富锦等师兄师姐在最后阶段对我的帮助和指点。最后感谢父母在这一年里对我的关心和照顾。他们虽然不能明白我在做的具体的工作，却全心全意支持我。感谢宿舍的姐妹们常常要忍受我实验晚归所带来的打扰，感谢她们一直以来的理解和帮助。参考文献：1. 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