脊髓损伤大鼠运动及神经功能自然恢复规律的探讨.doc

脊髓损伤大鼠运动及神经功能自然恢复规律的探讨王红星 徐冬晨 姚莉 雷晓婷 刘兴波 丁新生 王彤【摘要】目的观察不完全脊髓损伤（SCI）大鼠运动及神经功能自然恢复情况，为SCI后运动训练时机选择提供依据。 方法共选取45只成年SD大鼠，分为实验组（40只）和假手术组（5只）。实验组手术切除T10椎板暴露脊髓，采用改良Allens撞击法致SCI；假手术组仅手术切除T10椎板暴露脊髓。实验组分别于损伤前及损伤后1,3,5,7,14 d,21 d和28 d，假手术组分别于术前及术后1,3,5,7 d时采用斜板试验、改良Tarlov评分、BassoBeattieBresnahan（BBB）评分进行运动功能评定，采用脊髓诱发电位评定神经功能。实验组于上述各时间点分别取5只大鼠处死，假手术组于术后7 d时处死，取2组大鼠T10节段脊髓进行形态学检测。 结果实验组大鼠在损伤后13 d斜板角度、改良Tarlov评分和BBB评分均较损伤前显著降低，自损伤后5 d时开始增加，至14 d时达到平台期，显著高于术后1，3，5 d及7 d时水平（P0.05），但仍低于损伤前水平（P0.05）。实验组大鼠在损伤后1 d时脊髓体感诱发电位（SCEP）潜伏期较损伤前明显延长(P0.05）；波幅在损伤后1 d时明显降低，随时间进展呈逐渐增加趋势；假手术组术后各时间点潜伏期和波幅与术前比较，差异均无统计学意义（P0.05）。2组大鼠术前脊髓结构完整，实验组术后13 d脊髓灰白质可见片状出血、细胞肿胀及变性；术后57 d炎性细胞减少，可见细胞内嗜碱性颗粒沉积、胶质细胞及少量神经纤维增生等；术后1428 d可见胶质细胞、神经纤维增生明显，细胞内有空泡结构形成；假手术组大鼠脊髓形态学方面手术前后无明显改变。 结论SCI大鼠运动功能、神经功能及脊髓病理形态学变化均与损伤时程密切相关，其运动功能改善一般于损伤后14 d时达到平台期，而神经功能改善一般于损伤后21 d时达到平台期。【关键词】脊髓损伤；运动功能；脊髓诱发电位Natural recovery of locomotor and neurological function in rats after spinal cord injuryWANG Hongxing*, XU Dongchen, YAO Li, LEI Xiaoting, LIU Xingbo, DING Xinsheng, WANG Tong. *Department of Rehabilitation Medicine, The 1st Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, ChinaCorresponding author: WANG Tong, Email: wangtong60621【Abstract】Objective To observe the natural recovery of locomotor and neurological functioning in rats after incomplete spinal cord injury. MethodsFortyfive SpragueDawley rats were divided into two groups: an experimental group and a shamoperation group. In the experimental group, the spinal cord was exposed at the T10 level by laminectomy, and an animal model of spinal cord injury (SCI) was created using a modification of Allens method. The shamoperation group received only laminectomy without spinal cord injury. Locomotor and neurological functioning were evaluated using inclined plane tests, modified Tarlov scores, BassoBeattieBresnahan (BBB) scales and spinal cord evoked potential (SCEP) before the operation and on the 1st, 3rd, 5th, 7th, 14th, 21st and 28th day post surgery. Histomorphological changes were observed by light microscopy. Results(1) In the experimental group, the angles of the inclined plane test and the Tarlov and BBB scores had decreased significantly 1 and 3 days postinjury compared with those before the injury, and then increased gradually from the 5th day onwards, and peaking at the 14th day after injury. In the shamoperation group no significant changes in the inclined plane test results, modified Tarlov scores or BBB scores were observed 1, 3, 5 or 7 days post surgery. (2) In experimental group, SCEP latency had increased significantly on the 1st day after SCI, but it then decreased gradually until reaching a plateau at the 21st day after the operation. The SCEP amplitude also decreased significantly at the 1st day after SCI, then increased gradually from the 3rd to the 21st day. In the shamoperation group, no significant changes in SCEP latency or amplitude were observed. (3) One and 3 days after the operation, hemorrhage and edema in the spinal cord as well as nerve fiber degeneration was observed in the experimental group. From day 5 to day 7, empty cavities formed gradually and astrocytes increased, a few nerve fibers grew. By days 14 and 28, more nerve fibers and astrocytes were found. ConclusionThe recovery of locomotor and neurologic function correlated closely with the natural course of spinal cord recovery, and becomes stable 14 to 21 days after injury. 【Key words】Spinal cord injury;Locomotor function;Somatosensory evoked potential脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是重要的致残原因之一。相关实验及临床观察发现，运动训练能有效促进SCI后功能恢复，是促进脊髓神经再生及功能恢复的有效措施之一13。由于SCI后机体神经结构及功能变化复杂，难以确定运动训练的最佳介入时机。本研究通过观察SCI大鼠模型运动与神经功能自然恢复的时间规律，为SCI患者康复介入时机选择提供实验依据。现报道如下。材料与方法一、实验动物及分组共选取成年健康雄性SD大鼠55只，体重（32030）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供许可证号SCXK（沪）20030003。在模型制作过程中及术后共死亡10只被剔除，余45只纳入实验分析，将其分为实验组（40只）和假手术组（5只）。实验组大鼠行手术切除T10椎板暴露脊髓并致SCI，假手术组大鼠则仅手术切除T10椎板暴露脊髓组织。二、SCI模型制作过程参照文献4介绍的方法，采用1%戊巴比妥钠（0.5 ml/100 g体重）腹腔注射麻醉成功后，将大鼠俯卧位固定，暴露T10椎骨棘突，切除椎板，暴露硬脊膜，然后将大鼠固定于立体定位器上，使脊柱处于水平位。采用改良Allens撞击法，在脊髓背侧面放置一金属垫片作为打击板，将10 g的砝码自4 cm高度垂直落下撞击打击板致大鼠SCI（术后大鼠尾巴痉挛摆动后双下肢瘫痪表明制模成功）。预防性应用青霉素进行肌肉注射（20万U，1次/d，共3 d）。实验组大鼠制模后每日上、下午各进行1次腹部按摩和挤压操作以协助排尿。三、运动功能评定实验组大鼠于损伤前、损伤后1，3，5，7 d，14，21 d及28 d时进行运动及神经功能评定，假手术组大鼠于术前及术后1，3，5 d和7 d时进行功能评定。具体评定内容包括以下方面。1.斜板试验：将实验大鼠置于光滑木板上，其身体轴线与平板纵轴平行，平板每次升高5，以大鼠能停留5 s（期间保持不下滑）的最大角度为其功能值5。2. Tarlov评分：0级后肢无活动，不能负重；1级后肢可见活动，但不能负重；2级后肢活动频繁或有力，不能负重；3级后肢可支持体重，能走12步；4级可行走，仅有轻度障碍；5级行走功能正常6。3. BassoBeattieBresnahan（BBB）评分7：该评分系统将大鼠后肢运动功能分为22个等级，其中后肢全瘫为0分，功能完全正常为21分，主要观察内容包括关节活动数目和范围、负重程度及前后肢协调性、前后爪和尾部活动情况等。上述运动功能评定时间均统一为上午800。四、脊髓诱发电位检查参照文献8,9介绍的方法，采用Medtronic Keypoint 4ch型诱发电位仪检测大鼠脊髓体感诱发电位（spinal cord evoked potential，SCEP），电刺激强度为10 mA，波宽1 ms，频率2 Hz，叠加200次，将刺激电极正极插入大鼠后肢刺激胫后神经，负极位于正极远端2 cm处，记录电极则插于T8T9棘间韧带处，参考电极位于同一水平皮下，与记录电极间隔2 cm，地线插在腹部皮下。以第1个负波（N波）的潜伏期和波幅作为观察指标，均重复测定3次，求其平均值。五、形态学检查实验组于各观察时间点随机处死5只大鼠取材；假手术组大鼠于术后7 d时取材。采用1%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，用4%中性甲醛溶液进行心脏灌注，取损伤部位及上、下1 cm范围内脊髓组织，制作标本切片行常规HE染色，观察组织学变化情况。六、统计学分析采用SPSS 14.0版软件进行数据统计分析，所得数据均以（x-s）表示，计量资料比较采用t检验，P0.05为差异具有统计学意义。结果一、运动功能结果分析1. 斜板试验：实验组大鼠SCI后第1天时，其斜板角度由损伤前的（38.22.4）降低到（19.71.7），差异具有统计学意义（P0.05），斜板角度自SCI后第5天时开始呈增加趋势，至第14天时增加到（32.63.8），与SCI后1，3，5 d及7 d时比较，差异均具有统计学意义（P0.05），但仍显著低于损伤前水平（P0.05）。假手术组大鼠术后第1 天斜板角度较术前降低，但差异无统计学意义（P0.05），术后第3，5，7 天时斜板角度与术前水平比较，差异均无统计学意义（P0.05）。2. 改良Tarlov评分：实验组大鼠SCI后第1天时，其改良Tarlov评分由损伤前的5.0分降低到(0.020.15)分，至SCI后5 d时仍无明显恢复；于SCI后第7天时Tarlov评分开始逐渐增高，至第14天时恢复到（2.60.7）分，显著高于损伤后1,3,5 d及7 d时评分（P0.05），但仍显著低于损伤前水平（P0.05）。假手术组大鼠Tarlov评分术前及术后比较，差异无统计学意义（P0.05）。3. BBB评分：实验组大鼠SCI后第1天时，其BBB评分由损伤前的21分降低到（0.090.05）分，于SCI后第5天时开始呈增加趋势，至损伤后14 d时恢复到(13.43.3)分，与SCI后1，3，5及7 d时比较，差异均有统计学意义（P0.05），但仍明显低于损伤前水平（P0.05）。假手术组术前、术后BBB评分无明显变化（P0.05）。具体结果详见表1。二、脊髓诱发电位结果分析实验组大鼠SCI后第1天时的SCEP潜伏期（11.62.4）ms较损伤前水平（5.71.0）ms明显延长，差异具有统计学意义(P0.05），至第28天时SCEP潜伏期再无进一步缩短，与第21天时比较，差异无统计学意义（P0.05）；SCEP波幅在SCI后第1天时明显降低，并随时间进展呈逐渐增加趋势。假手术组大鼠术后各时间点SCEP潜伏期和波幅与术前比较，差异均无统计学意义（P0.05）。具体数据详见表1。三、形态学观察结果分析实验组大鼠损伤前脊髓组织结构完整，神经细胞形态正常，无出血现象；SCI后13 d脊髓病理改变包括灰白质明显出血、细胞变性、神经纤维组织溶解、灰白质界限不明显、炎性细胞浸润等；SCI后57 d病理改变包括神经元变性、出血不明显、炎性细胞减少、细胞质内可见嗜碱性颗粒沉积，同时还有少量神经纤维增生及新生血管；术后1428 d胶质细胞增生明显，白质内细胞嗜碱性颗粒沉积，灰质内见小灶区域空泡变性及神经纤维增生。假手术组仅见脊髓硬膜外中性粒细胞浸润和少量出血，大脑灰白质无明显变化（见图1）。表12组大鼠不同时间点运动功能及脊髓诱发电位结果比较（x-s）组别斜板试验（）Tarlov评分（分）BBB评分（分）脊髓体感诱发电位潜伏期波幅（ms）（V）实验组（n=40）术前0.021.00.05.71.01.230.21术后1 d20.010.090.0530.06术后3 d19.22.00.00.00.00.060.11术后5 d23.02.70.00.01.00.310.32.00.540.12术后7 d50.15术后14 d32.63.8a2.60.7a13.43.3a8.42.1a0.670.20术后21 d32.42.6a2.91.0a15.54.0a7.51.5b0.860.23b术后28 d31.72.6a2.80.9a15.35.9a7.31.3b0.870.21b假手术组（n=5）术前0.021.00.060.34术后1 d35.03.55.00.021.00.040.31术后3 d0.021.00.000.26术后5 d38.03.45.00.021.00.06.00术后7 d0.021.00.020.27注：与组内术前及术后1，3，5,7 d时比较，aP0.05；与术后1，3，5，7 d及14 d时比较，bP0.05注：图1a图1e均为实验组，图1a示损伤前脊髓组织结构完整，神经细胞形态正常；图1b示损伤后1 d时脊髓灰白质明显出血，组织水肿，细胞变性，灰白质界限不明显及炎性细胞浸润；图1c示损伤后5 d时神经元变性，出血不明显，炎性细胞减少，细胞质内可见嗜碱性颗粒沉积；图1d示损伤后14 d时胶质细胞增生明显，灰质内可见小灶区域空泡变性；图1e示损伤后28 d时胶质细胞增生明显，白质内细胞嗜碱性颗粒沉积，灰质内见小灶区域空泡变性，神经纤维增生；图1f为假手术组，可见脊髓硬膜外中性粒细胞浸润和少量出血，灰白质无明显变化图12组大鼠手术前、后不同时间点脊髓形态学变化分析(HE染色，200)讨论本研究发现大鼠SCI后，随着时程延长，其斜板试验结果、改良Tarlov评分和BBB评分均呈逐渐增加趋势，以术后714 d期间恢复较显著，并于术后14 d时进入平台期，术后21 d及28 d时上述指标均无显著改善，提示SCI大鼠运动功能最大程度自然恢复的时间窗为714 d，之后随着时程延长，大鼠受损功能不再有明显改善。实验组SCI大鼠SCEP潜伏期随时程延长呈缩短趋势，于术后21 d时进入平台期，波幅的变化情况同潜伏期变化趋势基本一致，且均迟于运动功能恢复进程，其原因可能系SCEP主要评价脊髓后束感觉传导功能，不能完全反映运动传导束功能状态；而本研究采用的是不完全性SCI模型，其直接撞击部位为脊髓后束，因此后束损伤程度较运动传导束严重；但SCEP与脊髓损伤程度具有高度相关性，仍可较好地反映脊髓损伤程度及神经功能10。后续研究需进行磁刺激运动诱发电位测定，以全面评估神经功能。本研究综合采用斜板试验、改良Tarlov评分、BBB评分对大鼠运动功能进行评估，以求全面、准确反映SCI后运动功能变化情况；但BBB评分系统不能区分大鼠后肢是自发运动或是自主运动，由于大鼠等低等级哺乳动物存在自发性后肢运动，而这种自发性后肢运动功能恢复并非由脊髓组织修复引起11。相关研究表明，自发性运动功能恢复多在受伤2周后才会出现，而本研究结果显示，SCI大鼠运动功能恢复均于14 d时达到平台期，因此可排除自发性运动成分对研究结果的影响12。本研究形态学观察结果显示，在SCI后13 d时，实验组大鼠灰质、白质内出血明显，炎症反应较重，灰白质界限不清，57 d时炎症反应减轻，细胞增生明显，并可见神经纤维增生和血管新生，至14 d后胶质细胞增生显著，神经纤维增生较多。上述形态学方面的时程变化特点提示大鼠运动功能和神经功能恢复与损伤部位病理变化过程密切相关，SCI后57 d随着出血量减少，组织细胞水肿和炎症反应消退，未损伤神经元及神经纤维逐渐恢复功能，从而使部分运动及神经功能得到改善。GomezPinilla等1研究发现，于SCI后2 d时进行运动训练，并不能诱导神经生长因子表达及促进神经功能恢复，但于SCI后5 d时进行运动训练则能显著促进神经生长因子表达，该研究中的运动训练介入时机与本实验中运动功能最大程度恢复的时间点较为接近，提示在急性期过后进行运动训练，可能更有利于产生促神经再生作用。综上所述，不完全性SCI大鼠运动功能、神经功能及病理形态学变化均与损伤时程密切相关，其运动功能改善在损伤后14 d时进入平台期，而神经功能在损伤后21 d时达到最大程度恢复；SCI大鼠术后1 7 d可见脊髓组织出血、水肿及炎性反应，神经及运动功能严重缺损，此阶段不适于介入康复运动训练；而在SCI发生 7 d以后，上述各项病理改变及神经、运动功能均趋于稳定状态，此期间较适于介入康复训练，以进一步提高疗效。 参考文献1GomezPinilla F,Ying Z,Roy RR,et al.Voluntary exercise induces a BDNFmediated mechanism that promotes neuroplasticity.J Neurophysiol,2002,88:21872195.2王翔,王彤,宋凡.减重平板训练改善T1损伤伴脊髓空洞症患者步行能力.中华物理医学与康复杂志,2002，24:428429.3王彤,王翔.减重平板训练对瘫痪后步行障碍患者的影响.中华物理医学与康复杂志,2002，24:98101.4Falconer JC, Narayana PA, Bhattacharjee M, et al.Characterization of an experimental spinal cord injury model using waveform and morphometric analysis.Spine,1996，21:104112.5Cheng H,Cao Y，Olson L.Spinal cord repair in adult paraplegic rats:partial restoration of hind limb function.Science,1996,273：510513.6Rivlin AS,Tator CH.Objective clinical assessment of motor function after experimental spinal cord injury in rat.J Neurosurg,1977，47:577581.7Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open filed testing in rats.J Neurotrauma,1995，12:121.8王相莉, 夏萍, 平少华,等.骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后功能恢复影响的研究.中国脊柱脊髓杂志, 2004,14:609612.9Hu Y,Luk KD,Lu WW,et al.Prevention of spinal cord injury with timefrequency analysis of evoked potentials:an experimental study.J Neurol Neurosurg Psych,2001，71：732740.10周红俊,汪家琮,刘根林,等.脊髓损伤完全与否与体感诱发电位的关系.中华物理医学与康复杂志,2002，24:160161.11陈向荣,游思维,金大地.BBB评分评估脊髓损伤大鼠后肢运动功能的探讨.中国脊柱脊髓杂志,2004，14:547550.12胡俊勇,李佛保,廖威明，等.大鼠脊髓横断后后肢运动功能恢复的规律.中华创伤杂志,2003，19:592595.(收稿日期：20071129)(本文编辑：易浩)硬膜外脊髓电刺激结合减重跑台训练对脊髓损伤大鼠运动功能的影响徐江 王熠钊 黄晓琳 许涛 徐琦 邢科新 王昕 何际平【摘要】目的探讨硬膜外脊髓电刺激（ESCS）结合减重跑台训练对脊髓损伤大鼠运动功能的影响。 方法共选取成年雌性SD大鼠24只，采用改良Allen打击法将其制作成T89脊髓损伤模型，将造模成功大鼠随机分为脊髓损伤组(简称模型组，术后未给予特殊处理)、硬膜外电刺激组(简称电刺激组，术后给予硬膜外电刺激)、减重跑台治疗组(简称减重运动组，术后给予减重运动训练)和减重跑台训练结合硬膜外电刺激组(简称治疗组，术后给予减重运动训练及硬膜外电刺激)。于术前及术后采用神经行为学评分（BBB评分）对各组实验大鼠运动功能恢复情况进行评定，并于术后8周时取各组大鼠脊髓损伤节段进行神经丝蛋白（NF200）免疫组化染色分析。 结果减重运动组和治疗组大鼠神经行为学评分（BBB评分）和NF200染色光密度值均显著高于模型组及电刺激组水平（P0.05）；治疗组大鼠BBB评分显著高于减重运动组（P0.05）。 结论ESCS及减重运动训练均对不完全性脊髓损伤大鼠步行功能恢复具有促进作用，且两者联用具有协同功效，其治疗机制可能与刺激脊髓损伤下位中枢模式发生器神经元有关。【关键词】脊髓损伤；硬膜外脊髓电刺激；减重步行；可塑性；大鼠A combination of epidural spinal cord stimulation and treadmill training facilitates functional recovery after moderate spinal cord injury in ratsXU Jiang*, WANG Yizhao, HUANG Xiaolin, XU Tao, XU Qi, XIN Kexin, WANG Qin, HE Jiping. *Department of Rehabilitation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huangzhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, ChinaCorresponding author: HUANG Xiaolin, Email: xiaolinh2006【Abstract】Objective To investigate the potential synergistic effect on motor function recovery of the application of epidural spinal cord stimulation (ESCS) with body weight supported treadmill training after incomplete spinal cord injury. MethodsTwentyfour adult, female SpragueDawley rats were administered a contusive injury of moderate severity at vertebral level T89 using a modification of Allens method. They were then randomly allocated into 4 groups: a spinal cord injury group (SCI group), a spinal cord injury plus ESCS group (ESCS group), a treadmill training group (treadmill group), and a treadmill training plus ESCS group (treatment group). Before and after surgery, hindlimb functional recovery in the rats was evaluated using the open field Basso, Beattie and Bresnahan (BBB) scale for gait analysis and the expression of neurofilament 200 (NF200) was detected by histochemical staining 8 weeks post surgery. ResultsBoth BBB scores and the expression of NF200 were significantly higher in the treadmill and treatment groups compared with the SCI and ESCS groups. BBB scores in the treatment group were significantly higher than those in the treadmill group. However, no significant difference in terms of NF200 expression was observed between the treatment and treadmill groups. ConclusionThe combination of ESCS and treadmill training can yield functional improvement following spinal cord injury. 【Key words】Spinal cord injury;Epidural spinal cord stimulation;Treadmill training;Plasticity作者单位：430030武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院康复医学科（徐江、王熠钊、黄晓琳、许涛）；华中科技大学控制科学与工程系（徐琦、邢科新、王昕）；美国亚利桑那州立大学生物工程系（何际平）通讯作者：黄晓琳，Email: xiaolinh2006脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是严重致残性疾患之一，其治疗干预是目前神经科学领域中难点、热点之一。硬膜外脊髓电刺激(epidural spinal cord stimulation，ESCS)技术是将电极植入患者椎管内，通过脉冲电流刺激脊髓神经，对治疗慢性顽固性疼痛具有显著疗效。近年来有研究表明，ESCS结合减重步行训练（bodyweight supported treadmill training,BWSTT）对不完全性SCI患者步行功能有改善作用，但其确切治疗机制有待进一步探索1,2。本研究采用ESCS技术并结合BWSTT对不完全SCI大鼠进行治疗，发现实验大鼠运动功能均获得显著改善。现报道如下。材料与方法一、主要试剂和仪器主要实验试剂包括水合氯醛（上海试剂二厂产品）、大鼠NF200单抗、即用型SABC试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司产品），其它均为市售分析纯产品。主要实验仪器包括自制改良Allen打击器，ESCS系统由华中科技大学自动控制系研制3，Imagepro Plus图像分析系统由同济医学院提供。二、实验动物及分组处理共选取成年健康雌性SD大鼠24只，体重250300 g，由同济医学院动物实验中心提供，实验期间给予自然光照，定时添加饲料，饮水不受限制。将上述大鼠制成SCI模型，并将造模成功大鼠随机分为SCI模型组(简称模型组)、硬膜外电刺激治疗组(简称电刺激组)、减重跑台运动组(简称减重运动组)和减重跑台运动结合硬膜外电刺激组(简称治疗组)，每组各6只大鼠。模型组不作特殊处理，电刺激组及减重运动组大鼠于脊髓损伤后分别施以电刺激和减重运动训练，治疗组大鼠于脊髓损伤后给予电刺激及减重运动训练。三、SCI动物模型的建立采用10%水合氯醛按300 mg/kg体重进行腹腔注射麻醉，将大鼠俯卧位固定于实验台上，腰背部剪毛，以T89棘突为中心，自背部正中切口，显露T710棘突及椎板，切除T89棘突及部分椎板组织，暴露脊髓组织作为损伤区。制模方法参照改良Allen打击法4,5，将10 g重物从2.5 cm高度垂直落下并直接撞击大鼠脊髓组织，如受损脊髓组织出现水肿、出血，大鼠出现摆尾反射，双下肢及躯体回缩扑动，双后肢呈弛缓性瘫痪等征象，提示SCI模型制作成功。四、硬膜外电刺激电极植入电刺激组和治疗组大鼠于成功建立SCI模型后，将硬膜外刺激电极及导线从T9椎骨窗沿椎板下植入椎管内，将刺激电极中心置于L2水平，采用缝合丝线将导线固定于T7棘突处，导线与刺激器接头部分经背部皮下用牙科水泥固定于颅骨表面。待各组实验动物苏醒后分别单独饲养，采用青霉素腹腔注射3 d以预防感染，期间自由进食及饮水，每日按摩膀胱辅助排尿2次，直至大鼠排尿反射功能恢复正常。五、治疗干预方法减重运动组大鼠于脊髓损伤1周后开始BWSTT，每天1次，每次20 min，每周6次，初始减重量为大鼠体重的60%，跑台速度设定为3 cm/s，以后减重量和跑台速度根据大鼠运动功能恢复情况随时调整。治疗组大鼠在减重跑台训练过程中同时给予硬膜外电刺激，电刺激部位为L2区域，刺激强度为运动阈下水平（电刺激强度为100 mV，波宽200 s，频率20 Hz）。电刺激组大鼠于脊髓损伤1周后给予硬膜外电刺激，电刺激参数同治疗组。六、大鼠运动功能评定分别于术前、术后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d及56 d时由双人在单盲条件下采用BBB（Basso, Beattie and Bresnahan）开放空间运动评分法对各组大鼠后肢运动功能恢复情况进行评定6。神经功能评定在80 cm60 cm60 cm空间内进行，每只实验大鼠运动功能评定时间为4 min，评定前排空大鼠膀胱内尿液。七、标本制备与检测指标于术后第8周将各组实验大鼠用10%水合氯醛深度麻醉，开胸经左心室行主动脉插管，先用100 ml生理盐水快速灌注冲洗，再用4%多聚甲醛500 ml先快后慢灌注固定，取损伤脊髓节段0.5 cm组织置入上述固定液中后固定4 h，再置入4蔗糖溶液（30%）中，待组织块沉底后行恒冷箱冰冻切片（片厚20 m）。标本切片经正常羊血清封闭后，加入兔抗大鼠NF200单克隆抗体（1200），置于4环境下孵育48 h，然后与生物素标记的二抗（1200）于25环境下孵育2 h，再与ABC（1100）在25环境下孵育2 h，最后滴加新鲜配制的DABH2O2显色液室温下显色1015 min。将切片脱水、透明、封片后置于显微镜下观察。八、统计学分析本研究所得数据以（x-s）表示，采用SPSS 11.0版统计学软件对数据进行方差分析，P0.05表示差异具有统计学意义。结果一、各组实验大鼠治疗前、后运动功能比较通过对各组实验大鼠SCI后连续8周的BBB评分分析后发现，所有组别大鼠术前BBB评分均为21分，术后1 d时各组大鼠后肢均呈弛缓性瘫痪，爬行动作完全依靠前肢运动完成，期间BBB评分为01分；自SCI后第14天时开始，各组实验大鼠后肢运动功能均出现明显恢复，其中减重运动组与治疗组大鼠BBB评分显著高于模型组和电刺激组（P0.05）；且治疗组大鼠BBB评分与减重运动组比较，其间差异也有统计学意义（P0.05）；对组内数据比较后发现，各组大鼠术后14 d时BBB评分与28 d、35 d、42 d、49 d及56 d时比较，其间差异均有统计学意义（P0.05），具体数据详见图1。图1各组大鼠治疗前、后BBB评分结果比较二、各组实验大鼠脊髓损伤部位NF200表达情况比较NF200染色阳性以细胞及其突起部位呈棕褐色为主要特征，当脊髓损伤后8周时，模型组及电刺激组大鼠脊髓白质内均只见少量棕褐色神经纤维，而减重运动组及治疗组大鼠脊髓白质内均可见大量均匀排列的NF200染色阳性神经纤维。经图像分析系统处理后发现，与模型组及电刺激组比较，减重运动组及治疗组大鼠脊髓损伤部位NF200表达水平均显著增高（P0.05），具体情况详见图2，表1。模型组电刺激组减重运动组治疗组图2各组实验大鼠脊髓NF200表达情况比较（免疫组化染色，400）表1各组实验大鼠脊髓损伤后NF200表达水平比较（x-s）组别只数NF200染色密度模型组60.250.05电刺激组60.230.04减重运动组60.380.07a治疗组60.400.06a注：与模型组及电刺激组比较，aP0.05讨论SCI是常见的中枢神经系统严重创伤，常造成患者运动功能不同程度障碍。下肢的核心运动功能是步行，因此恢复步行能力是大多数SCI患者最迫切的需求之一。目前诸多研究表明，单一疗法均不能使SCI患者获得满意疗效7，这就要求临床需重视多种治疗手段的综合运用。除了各种促进损伤神经轴突再生的治疗方法外，近年来提高SCI后脑可塑性的治疗策略也引起临床越来越多的重视8。神经丝蛋白NF200是神经元特异性骨架蛋白，参与神经元形态结构的形成及维持，与蛋白质在胞体及突起之间的双向运输功能密切相关，并与膜蛋白相互作用。当中枢神经损伤后，神经丝蛋白的表达水平可间接反映神经轴突再生能力。本研究结果发现，BWSTT及ESCS均对SCI大鼠运动功能恢复有积极促进作用，且两者联用具有协同功效，如治疗组大鼠运动功能恢复情况明显优于模型组、电刺激组及减重运动组，差异均有统计学意义（P0.05），提示电刺激疗法对脊髓损伤处轴突再生并未产生显著影响。ESCS是将电极植入相应脊髓节段硬膜外间隙并给予适当电刺激，通过上行传导的电流阻断疼痛信号传递，从而达到镇痛目的9。对本研究结果分析后发现，单独应用ESCS治疗并不能有效促进大鼠神经行为学功能恢复及损伤脊髓节段轴突再生；而将ESCS与BWSTT联合应用后则能显著改善实验大鼠步行功能，进一步分析发现，实验大鼠运动功能改善与损伤节段轴突再生无明显相关性，推测大鼠运动功能改善是通过刺激脊髓损伤下位神经元而实现的。本研究将ESCS电极置于大鼠脊髓L2水平，在形态学上该处正是腰膨大的起始部位。有学者认为此节段具有特殊结构，即损伤部位以下腰骶段脊髓内保留的步行低级控制中枢中枢模式发生器（central pattern generator,CPG）1012。脊髓步行CPG具有独立于大脑等脊髓上位神经中枢的控制功能，能自发产生节律性神经冲动13。BWSTT能促进SCI动物运动功能恢复14,15，其相关机制可能是步行训练能将步行时下肢本体感觉信息传入到脊髓步行CPG神经元中，使损伤部位以下未受损脊髓环路神经系统可塑性增强，从而发挥治疗作用16。本研究结果提示ESCS能增强BWSTT对CPG的调控功能，加快截瘫大鼠后肢运动功能恢复。综上所述，本研究发现ESCS及BWSTT均能促进不完全性SCI大鼠步行功能恢复，两者联用具有协同功效，其相关治疗机制可能与电刺激改变中间神经元细胞膜电位及兴奋性，增强步行时本体感觉传入刺激，进而促进大鼠后肢运动功能恢复等有关，其确切机制还有待进一步研究。 参考文献1Carhart MR,He J,Herman R,et al.Epidural spinalcord stimulation facilitates recovery of functional walking following incomplete spinalcord injury.IEEE Trans Neural Rehabil Eng,2004,12:3242.2Herman R,He J,DLuzansky S,et al.Spinal cord stimulation facilitates functional walking in a chronic, incomplete spinal cord injured.Spinal Cord,2002,40:6568.3王永骥,张潇,何际平,等.硬脊膜外脊髓电刺激器的实验设计.中国临床康复,2006,10:118121.4Young W.Spinal cord contusion models.Prog Brain Res,2002,137:231255.5许涛,郭风劲,李新志,等.磁刺激对脊髓损伤组织cfos基因表达的影响.中华物理医学与康复杂志,2003,25:36.6Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats.J Neurotrauma,1995,12:121.7Fawcett JW.Spinal cord repair:from experimental models to human application.Spinal Cord,1998,36:811817.8Wickelgren I.Animal studies raise hopes for spinal cord repair.Science,2002,297:178181.9North RB,Wetzel FT.Spinal cord stimulation for chronic pain of spinal origin:a valuable longterm solution.Spine,2002,27:25842591.10Gerasimenko YP,Lavrov IA,Courtine G,et al.Spinal cord reflexes induced by epidural spinal cord stimulation in normal awake rats.J Neurosci Meth,2006,157:253263.11Ichiyama RM,Gerasimenko YP,Zhong H,et al.Hindlimb stepping movements in complete spinal rats induced by epidural spinal cord stimulation.Neurosci Lett,2005,383:339344.12Grillner S.The spinal locomotor CPG:a target after spinal cord injury.Prog Brain Res,2002,137:97108.13Duysens J,Vande C.Neural control of locomotion,the central pattern generator from cats to humans.Gait Posture,1998,7:131141.14Thota A,Carlson S,Jung R.Recovery of locomotor function after treadmill training of incomplete spinal cord injured rats.Biomed Sci Instr,2001,37:6367.15Zhang Y.Observation of locomotor functional recovery in adult complete spinal rats with BWSTT using semiquantitative and qualitative methods.Spinal Cord,2007,45:496501.16Fouad K,Metz GA,Merkler D,et al.Treadmill training in incomplete spinal cord injured rats.Beh Brain Res,2000,115:107113.(收稿日期：20080519)(本文编辑：易浩)McKenzie法联合动态干扰电及牵引治疗腰椎间盘突出症的疗效观察傅建明 顾旭东 王佳宇 姚云海 顾敏 尹汉逵 任芸腰椎间盘突出症是一种临床常见病、多发病，治疗方法多，但效果不一，主要以非手术疗法为主，我科采用McKenzie法联合干扰电及牵引治疗腰椎间盘突出症，疗效明显，现报道如下。一、资料与方法（一）临床资料选取2004年10月1日至2007年3月31日来我院康复医学中心门诊和住院治疗的86例腰椎间盘突出症患者。临床症状、体征、X线片表现均符合腰椎间盘突出症诊断标准1，均经CT或MRI检查确诊。排除结核、肿瘤、非椎间盘因素造成的腰腿痛。按McKenzie分型标准2均为椎间盘向后移位综合征，髓核向后突出或侧方移位。将所有患者随机分成治疗组和对照组，每组43例。治疗组中，男23例，女20例；平均年龄（35.24.3）岁；平均病程（6.92.5）个月；L34突出2例，L45突出14例，L5S1突出11例，L45和L5S1突出16例。对照组中，男25例，女18例；平均年龄（38.32.1）岁；平均病程（7.21.3）个月；L34突出3例，L45突出12例，L5S1突出12例，L45和L5S1突出16例。2组患者性别、年龄、病程、突出部位等经统计学分析，差异均无统计学意义（P0.05），具有可比性。（二）治疗方法2组患者均接受常规的药物治疗，即口服弥可保片，每次500 g，每日3次。同时应用日本产TM300型可变式电脑牵引系统行牵引治疗，患