普通小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒RSV感染模型比较.doc

实验动物学设计大纲实验名称：普通小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV)感染模型比较 课题来源：自选 设计班级：2004级检验本科班 设计人员：罗坤 设计日期：2007年5月26日 指导老师：张晓 陈建敏 成都医学院实验技术教研室2007年制一、实验设计的目的意义：实验设计的目的意义，国内外研究现状，存在的问题，解决问题的思路。目的与意义比较研究BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的特点,建立理想动物模型, 为研究发病机理和防治措施奠定基础。国内外研究现状人呼吸道合胞病毒( human respiratory syncytial virus, RSV) 是全球婴幼儿下呼吸道感染首位病毒病原体, 几乎所有儿童两岁前感染过至少一次RSV1,年龄越小病情越重, 再感染率高, 与哮喘发生密切相关2。免疫缺陷者更易感染, 临床症状更为严重,常致死亡3。每年住院治疗的50%-75% 婴幼儿毛细支气管炎和25% 40% 的肺炎是RSV直接引起, 1 岁内婴儿RSV感染率68.8%, 1-2 岁感染率达82.6%100%。婴儿期急性RSV 下呼吸道感染使非特应体质和特应体质儿童发生哮喘危险性都比普通儿童明显增加, 是哮喘的独立危险因素4虽然已有许多抗RSV 制剂和疫苗的研究, 但尚无安全有效的防治方法。抗RSV 制剂的研究需要建立理想的动物模型, 但目前已建立的系列感染模型均不够满意。肺组织RSV抗原保护性免疫仅能维持数月, 福尔马林灭活疫苗不能起到保护作用反而加重病情, 至今RSV 仍无安全有效的治疗药物和预防疫苗, 脱氧核酶等新型抗RSV制剂正在研究中, 已在体外无细胞体系和细胞模型中表现抗病毒活性, 需要建立恰当的动物模型, 进一步在体内研究其抗病毒作用5。从RSV 发现至今,已建立的黑猩猩、猕猴、雪貂、牛、棉鼠、豚鼠和小鼠等感染模型各有优势和局限6, 除灵长类动物可出现临床症状, 其他都是无症状隐性感染7。BALB/c小鼠为近交繁殖产生，其对多种病原体具有易感性，利用小鼠建立模型的优点是它易获得, 遗传背景清楚而均一, 基因改造技术成熟, 已有多种商品化试剂, 是目前应用最广泛的实验动物。但小鼠不是RSV 自然宿主, 我们以往实验发现BALB/c 鼠感染RSV 没有临床症状, 肺内病毒复制水平相对低, 病毒滴度下降快, 带毒时间短, 限制了治疗效果的观察8。裸小鼠采用nu+雌鼠与nunu雄鼠交配方法产生，这种无毛小鼠是由于第11号染色体等位基因突变引起的，裸小鼠主要特征是无毛、裸体和无胸腺，缺乏成熟T细胞的免疫功能，B淋巴细胞正常，成年裸小鼠较普通小鼠有较高水平的NK细胞活性，目前未做过裸小鼠RSV感染模型，对其优势和局限尚不完全清楚。存在的问题：目前虽然已有许多抗RSV 制剂和疫苗的研究, 但尚无安全有效的防治方法，RSV感染具体发病机制也不够清楚，其发病机制和抗RSV 制剂的研究需要建立理想的动物模型, 但目前已建立的系列感染模型均不够满意。解决问题的思路： 复制BALB/c鼠和裸鼠RSV感染模型 ，不同时间空斑形成实验检测肺组织病毒滴度, 计数支气管肺泡灌洗液白细胞总数和分类情况, 免疫荧光和免疫组化检测RSV 抗原, 光镜和电镜检查肺组织病理学改变，比较研究BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的特点。参考文献：1 BlackCP. SystematicReviewoftheBiologyandMedical Management ofRespiratory Syncytial Virus InfectionJ. Respiratory Care, 2003; 48( 3) :209- 233.2 Holt PC, S1y PD.Interactions between RSV infection, asthma andatopy: unraveling the complexities J. J Exp Med, 2002; 196( 10) :1271- 1275.3 Meissner HC, RennelsMB, PickeringLK, et al.Risk of severe respiratorysyncytial virus disease, identification of high risk infants and recommendationsfor prophylaxis with palivizumabJ.Pediatr Infect Dis J, 2004;23( 3) : 284- 285.4 OddywH, de Merk NH, S1y PD, et a1. The effects of respiratory infections,atopy and breastfeeding on childhood asthma J.Eur Respir J,2002; 19( 5) :899- 905.5 ZhaoC- A,ZhaoX- D,YuH- Get al. Inhibitionofrespiratory syncytialvirus replication in cultured cells by RNA cleaving DNAzyme J.Chin JPediatr, 2003; 41( 8) : 594- 598.6 Schmidt AC, Johnson TR, Peter JM, et al.Respiratory syncytial virusand other pneumoviruses: a review of the international symposium- RSV2003J.Virus Research, 2004; 106 : 1- 13.7 McArthur- Vaughan K, Gershwin LJ.A rhesus monkey model of respiratorysyncytial virus infectionJ.J Med Primatol, 2002; 31( 2) : 61- 73.8 Lian G- L, Yu H- G, ZhaoX- D, et al.Establishment of respiratory syncytialvirus infection model in miceJ. J Xian JiaotongUniversity( MedicalSciences) , 2003; 24( 4) : 329- 332. 二、实验设计方案（实验设计目标,拟解决的主要问题, 实验动物设计,实验专业设计，实验统计设计,实验方法设计，可行性分析,预期结果，实验设计工作时间安排）。（一）实验设计目标，拟解决的关键问题设计目标比较研究BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的特点,以建立理想动物模型拟解决的关键问题BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的复制，对试验性RSV 感染的模型进行分组与实验结果分析。（二）实验设计1、实验动物设计（主要内容包括：遗传背景，微生物质量控制，育种繁殖，饲养管理，动物模型，实验动物学技术）（1）遗传背景BALB/c鼠遗传背景：近交系BALB/c小鼠裸小鼠遗传背景：采用nu+雌鼠与nunu雄鼠交配方法产生的同源导入近交系小鼠。（2）微生物质量控制BALB/c小鼠微生物质量要求：普通级动物要求。裸小鼠微生物质量要求： SPF（无特定病原体）或无菌要求 （3）育种繁殖BALB/c小鼠育种繁殖：繁殖方法：近交繁殖初始动物的选择：挑选一对或几对具有育种目标要求的性状的全同胞兄妹性别鉴定：1、雄鼠的生殖器距肛门较远2、雄鼠生殖器与肛门之间长毛3、雄鼠的生殖器较雌鼠大4、雌鼠乳头较雄鼠明显性成熟期：35-55日龄；实配年龄：60日龄左右；成熟时体重：20克以上发情鉴定：动情期小鼠外阴部肿胀红润，抚摸其身体出现脊柱前凹、抬臀等行为现象配种：动情前期交配 交配形式：采用全同胞兄妹交配形式妊娠诊断：摸胎法、阴道涂片法、外形涂片法、直肠检查法育种代数：作为亲本的全同胞兄妹（初始动物）记为0代，按雌雄1：1进行交配，所生后代记为第1代，从中又选留满意的一对或几对全同胞兄妹作亲本，按雌雄1：1进行交配，以此类推，直到20代以上个体选择：选择留繁殖力强，生活力强，特别是目标性状和基因保种方法：平行线系统扩大繁殖生产方法：交通信号灯方法裸小鼠育种繁殖:繁殖方法：近交繁殖（同源导入近交）初始动物的选择：挑选一对或几对具有育种目标要求的性状的全同胞兄妹性别鉴定：1、雄鼠的生殖器距肛门较远2、雄鼠的生殖器较雌鼠大3、雌鼠乳头较雄鼠明显发情鉴定：动情期小鼠外阴部肿胀红润，抚摸其身体出现脊柱前凹、抬臀等行为现象配种：动情前期交配交配形式：采用nu+雌鼠与nunu雄鼠交配方法，雌雄比例为1：1，有时可采用1：2或1：3妊娠诊断：摸胎法、阴道涂片法、外形涂片法、直肠检查法（平均每胎所得纯合子仔鼠能占仔数的550，离乳率97，14胎生育恒定，一年存活率达100 ，最长生存期可达752 d。）育种代数：作为亲本nu+雌鼠与nunu雄鼠记为0代，按雌雄1：1进行交配，所生后代记为第1代，从中又选留满意的一对或几对全同胞兄妹作亲本，按雌雄1：1进行交配，以此类推，直到20代以上个体选择：选择留繁殖力强，生活力强，特别是目标性状和基因保种方法：平行线系统扩大繁殖生产方法：交通信号灯方法（4）饲养管理BALB/c小鼠饲养管理:BALB/c小鼠环境标准：实验动物饲养室的温度为18-19，相对湿度为40%-70%，每小时换气次数为10-20次，噪声在60分贝以下，每立方米空气中氨浓度在14mg以下，工作照度为150-300lxBALB/c小鼠设施：开放系统BALB/c小鼠笼器具：采用无毒塑料笼具，垫料选用具良好吸湿性、无毒性、无异味、尘埃少的材料如电刨花，垫料须经高压蒸汽灭菌BALB/c小鼠饲喂：饲喂小鼠全价营养颗粒饲料，饲料的消毒灭菌应达到相应等级小鼠微生物控制的要求。饲喂采取“少量勤添”的原则，每周喂料3-4次，饮水应保证连续不断，每周换水2-3次，垫料每周更换1-2次BALB/c小鼠饲养环境卫生消毒：做好室内的清洁、消毒、及饲料笼器具的清洗消毒，每次饲养完后，用苯扎溴铵擦拭笼架、地板，每月定期彻底喷雾消毒1次裸小鼠饲养管理:裸小鼠环境标准：实验动物饲养室的温度为18-19，相对湿度为40%-70%，每小时换气次数为10-20次，噪声在60分贝以下，每立方米空气中氨浓度在14mg以下，工作照度为150-300lx，空气洁净度为100000级裸小鼠设施：屏障系统或隔离系统裸小鼠笼器具：采用无毒塑料笼具，垫料选用具良好吸湿性、无毒性、无异味、尘埃少的材料如电刨花，一般所有的笼具、垫料、饲料、饮水等都得经过灭菌消毒 裸小鼠饲喂：每周饲喂全价营养饲料23次。饲料、饮水、垫料及鼠笼均用双层包布包装高压蒸汽灭菌消毒。进室前经缓冲室紫外灯照射后去除外层包布，才能进入繁殖室及实验室裸小鼠饲养环境卫生消毒： 繁殖室设在空气过滤十万级环境中放置层流柜作为裸小鼠繁殖饲养条件。启用前，先用2新洁而灭全面擦拭，然后按消毒区域的容积用高锰酸钾15 g，In2加福尔马林15 mL混和熏蒸。最后经紫外灯照射，细菌培养阴性才使用。启用后我们的常规消毒是：进实验室前后紫外灯照射30 rain，每2周用2新洁而灭擦拭墙壁、天花板，每一个月用过氧乙酸喷射消毒。每三个月用甲醛和高锰酸甲熏蒸一次(用备用实验室轮流消毒和使用)。每三个月将层流柜的过滤材料拆下进行清洗。每年更换一次过滤材料。饲养人员定期入繁殖室进行饲养管理操作。进室前需淋浴并用新洁而灭常规泡手、消毒、穿无菌衣、带袜的无菌裤、戴口罩、帽子。外层穿上手术隔离衣，并带手术胶手套及无菌纱手套。每次操作完毕，用新洁而灭抹台面及地面。常规每周换两次笼具，投放3 4 d的饲料与饮水。每周加两次鸡蛋和瓜子及一次维生素。2、实验专业设计实验动物：选用BALB/c鼠和裸小鼠作为实验动物。处理措施：感染RSV。观察指标：感染RSV 后不同时间空斑形成实验检测肺组织病毒滴度, 计数支气管肺泡灌洗液白细胞总数和分类情况, 免疫荧光和免疫组化检测RSV 抗原, 光镜和电镜检查肺组织病理学改变3、实验统计设计结果用均数标准差表示, 两两组间比较用t 检验, 各组间比较用方差分析。= 0.05,P0.05 认为有显著性差异。4、实验方法设计实验技术路线BALB/c小鼠C ：感染6 天的BALB/c 小鼠B ：感染3 天的BALB/c 小鼠A ：对照BALB/c 小鼠D ： 对照裸鼠裸小鼠F ：感染6 天的裸鼠E ：感染3 天的裸鼠不同时间空斑形成实验检测肺组织病毒滴度, 计数支气管肺泡灌洗液白细胞总数和分类情况, 免疫荧光和免疫组化检测RSV 抗原, 光镜和电镜检查肺组织病理学改变实验技术方法（1）随机抽样：选正常成年健康体重相近的BALB/c小鼠30只和裸小鼠30只，分别将30只BALB/c小鼠和30只裸小鼠按体重由小变大编号后，从随机数字表中查取随机数字，依次抄录于小鼠编号下。具体方法：两种动物编号为130号，30只BALB/c小鼠按照能被3除的规律：不余到A组，余1到B组，余2到C组 ；30只裸小鼠BALB/c小鼠按照能被3除的规律：不余到D组，余1到E组，余2到F组 （2）实验分组：实验分六组： A ：对照BALB/c 小鼠 B ：感染3 天的BALB/c 小鼠C ：感染6 天的BALB/c 小鼠 D ： 对照裸鼠E ：感染3 天的裸鼠F ：感染6 天的裸鼠（3）模型复制:1 .病毒和细胞培养:Hep- 2 细胞接种RSV 标准A2 株病毒, 含2% 胎牛血清( FBS) DMEM培养至病变达90%100%, 吸取培养液, 4, 3000g 离心10min收集上清, - 80储存备用。2.病毒接种: BALB/c小鼠和无特殊病原菌( specific pathogen free, SPF) 级812 周龄、雌性裸鼠，腹腔注射戊巴比妥钠0.06mg/g 麻醉后, 感染组鼻腔缓慢滴入2106PFU/ ml RSV A2 株病毒液50l, 阴性对照组滴入50l 2% FBS DMEM。(4)取材:病毒分离和滴度分析:感染后不同时间处死小鼠, 无菌条件下取左肺、肝脏和脾脏称重, 按10ml/g( wt/vol) 加入预冷组织平衡液, 匀浆制备肺脏、肝脏和脾脏组织悬液, 4, 2500g 离心10min, 取上清接种于Hep2 细胞, 2% FBS 1640 培养基, 37 , 5% CO2 培养, 逐日观察细胞病变。同时取肺组织悬液上清空斑形成实验分析肺组织病毒滴度。(5) 相关指标测定:1.空斑形成实验测定病毒滴度:3105/ml Vero 细胞接种至6 孔板, 10%FBS 的1640 培养至单层致密无孔细胞, 接种10 倍倍比稀释的病毒液100l, 每个浓度设复孔, 未感染病毒为对照孔。病毒吸附2h 后覆盖含1.5%的琼脂糖凝胶和2% FBS 的1640 培养基, 培养5 天, 5mg/ml MTT 显色, 计数空斑, 计算病毒滴度: PFU/ml= 稀释度 P= 该浓度下各孔空斑数; n= 复孔数; v= 每孔接种病毒液体积(ml)2.支气管肺泡灌洗液白细胞计数:感染后第3 天、6 天和9 天处死小鼠, 气管插管, 预冷生理盐水0.5ml 灌洗2 次, 收集支气管肺泡灌洗液( BALF) , 血球计数仪计数白细胞总数。4, 1000g 离心10min, 取细胞沉渣涂片,Wright 染色, 显微镜下计数200 个白细胞, 按中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞形态学特点分类计数。3. 直接免疫荧光实验:取感染后第3 天小鼠BALF 离心细胞沉渣涂片, 4丙酮固定干燥, 按Light Diagnostics Respiratory panel 1 DFA 免疫荧光试剂盒说明书( Chemicon, USA) 鉴定RSV 抗原, 荧光显微镜下观察结果。4. 肺组织病理学检查:感染后第3 天、6 天处死小鼠, 取未经支气管肺泡灌洗的右肺组织, 一部分4%多聚甲醛固定, 常规苏木素- 伊红( HE) 染色, 光镜观察形态结构。另一部分立即2.5%戊二醛固定, 送重庆医科大学电镜室包埋、制成超薄切片, 透射电镜检查。5. 免疫组织化学检查:RSV 抗原免疫组织化学染色SP 染色试剂盒( 北京中杉生物技术公司) , 一抗是针对RSV 整个病毒抗原的山羊多克隆抗体( USBiological, USA) 。4%多聚甲醛固定肺组织, 常规切片, 各步操作按试剂盒说明进行, DAB 显色后显微镜下观察。同一标本未滴加一抗的切片作阴性对照。图像分析采用北航真彩色病理图像分析系统4.0, 平均光密度反映染色强弱。（三）可行性分析1.小鼠易获得,易饲养;小鼠遗传背景清楚而均一, 基因改造技术成熟, 已有多种商品化试剂,2.实验器械容易解决;本实验模型操作不复杂;3.实验所需费用不多; 实验时间不长。