《辣根过氧化物酶》word版.doc

用辣根过氧化物酶追溯周围神经联系法辣根过氧化物酶(Herseradish Peroxidase)最早由Richard(1960)等人1用来研究肾近端小管的早期吸收情况，将HRP注入鼠静脉内，离隔一定时间进行观察。70年代Kristensen是将HRP用于神经系统联系的创妙人2，他的第一部分工作即是将HRP注入腓肠肌内而观察中枢（前角运动细胞）的HRP阳性标记颗粒。1972年Lavai和Lavai et al3首次将HRP用于中枢神经系统。他将HRP注入小鸡的中脑顶盖部分,30小时后取材, 观察视网膜节细胞内的HRP阳性标记细胞。1973年以后, 此法用于中枢神经系统者逐渐增多。将HRP注入周围神经末梢部分, 观察其向中枢的联系, 近年来开展了各方面的探索：里见肇及山本悌司等人进行的试验：是将HRP注入胃壁包括胃体、胃底、幽门等处,观察延髓迷走背核及孤束核的内侧部的酶标颗粒, 以及将HRP注入猫心脏窦房结观察延髓迷走背核及孤束核的酶标颗粒1,5。Dalsgaard, Elfvin(6)等人将HRP注入肠系膜下节及交感颈上节, 观察脊髓内五个交感核的酶标颗粒及其节段性。至于用HRP法追踪周围神经联系的研究工作, 目前国内外开展很少。只有Lowrence7将HRP注入一侧牙髓后观察同侧三叉神经半月神经节细胞内的HRP阳性颗粒；此外他还切断坐骨神经将断端浸入HRP液内, 在后根脊神经节细胞内找到HRP阳性颗粒。Elfvin还将HRP注入荷兰猪的肠系膜下节, 观察脊神经细胞内HRP阳性细胞的节段性。国内从事HRP法研究的学者也多是研究中枢神经系内各核团的联系, 而用HRP法从事周围神经系联系者则鲜见。因此我们用HRP法追溯胃交感内脏传入第一级神经元-脊神经节细胞内酶标颗粒和足三里穴区一级感觉神经元-脊神经节细胞内酶标颗粒。建立了HRP追踪围围神经联系的方法, 开展了对胃交感内脏神经元的节段性问题的探讨。对针刺足三里穴区作胃肠手术或针刺治疗胃肠疾患进行了形态学基础的研究。一、辣根过氧化物酶的注入问题注入的浓度及时间：HRP注入法在追溯中枢神经联系和周围神经联系有所不同。中枢神级系统内HRP需要用蒸馏水或生理盐水配成高浓度的溶液, 但也有用pH7.4的磷酸缓冲液做溶剂者8。其浓度是30%-50%，注射量是0.05l-0.1l, 0.1l-0.25l，最大量可以是0.5l。住射速度很慢, 一般约为0.1l/10分。Nauta认为可慢至0.05l/h, 注射后留针15-30分钟。HRP法在周围神经联系方面, 所用的HRP配制法与中枢相同, 是用蒸馏水或生理盐水配制, 但浓度较低, 1%、5%、10%, Yamamato及Teiji在猫胃壁注入时所用浓度为20%-30%, 注入时间没有说明。而在心脏窦房结及房室注入HRP时浓度为30%-50%。Elfvin在荷兰猪的肠系膜下神经节内注入的浓度25%-30%在5-10min内注入完华。我们的实验, 是用8-10mgHRP溶于80-100l的蒸馏水, 浓度是10%注入猫、兔胃壁内, 注入速度是1l/min, 所得的结果是比较满意的, 经过灌流及孵育等过程, 脊神经节细胞内的HRP酶标颗粒在光学显微镜明视野下, 细胞质内核的周围呈棕黑色颗粒, 暗视野下观察此棕黑色颗粒则成明亮的小点（参看本期胃交感内脏传入神经元的节段性一文附图。以同样的浓度浸胞足三里穴区的腓深神经断端, 也可以在脊神经节细胞内得到同样的结果。二、HRP注入后动物的存活时间问题关于HRP的运输问题, 一般认为是通过神经细胞体与突起末梢间存在着的双向流动的轴浆流axoplasmic flow来运送的。无沦是树突还是轴突都有这种现象9。注射部位的HRP被神经末梢及神经终末部分无髓段细轴突以胞饮方式吸收。在周围神经注射后存活时间：日本学者里见肇、山本悌司在胃壁注入HRP后2-3天在迷走背核及孤束核的细胞内有酶标颗粒,Law， Furst将HRP注入大鼠牙髓腔后1-2天在三叉神经半月神经节内看到标记细胞：Elfvin，将HRP注入肠系膜下节, 术后24-48h在脊神经节细胞内看到酶标颗粒。Dalsgaard10将HRP注入豚鼠肠系膜下节及交感颈上节后,48小时后在脊髓五个交感核内看到酶标颗粒。根据我们实验室的经验, 较大动物如兔和猫存活的时间应当长, 将HRP注入胃壁, 存活4-5天脊神经节细胞内酶标颗粒非常清晰。甚至存活7天的动物仍可见到脊神经节细胞及纤维内有酶标颗粒的出现。因此我们认为用HRP追溯周围神经联系时, 较大动物（猫、兔）存活时间适当长些。三、固定液的问题用HRP法显示神经细胞内标记颗粒, 无论是中枢或周围部分, 固定液的选择是个重要的关键, 在文献中多采用多聚甲醛、戊二醛混合液。戊二醛能较好的固定组织超微结构, 多用于电子显微镜技术, 虽然对酶有一定的破坏作用, 但仍然有相当程度的酶活性可以保存下来。其缺点是穿透能力太小, 对大的组织块固定, 多在固定液中加入穿透力强的多聚甲醛来补其不足。多聚甲醛为甲醛聚合物, 不溶于水, 但加水煮沸则可以解聚成甲醛单体而溶解, 因此用多聚甲醛灌流时须煮沸之。甲醛对酶的破坏作用比戊二醛小, 但在室温下仍可破坏HRP的活性, 所以Straus（64年） 11认为多聚甲醛灌流液应在0-4 时, 对动物进行灌流, 可保持HRP的活性。多聚甲醛及戊二醛的浓度问题在文献中各不相同。用HRP法探索中枢神经的联系时, 文献报导多聚甲醛的浓度为0.4-2.5不等。至于所用的缓冲剂皆为磷酸盐缓冲液, 因为多聚甲醛在弱碱性环境下对组织固定较好, 所以pH值多在7.2-7.4之间。在周围神经系统用HRP法显示酶标记时Elfvin和Daisgaard（77年） 等人只用3-5%的戊二醛溶于0.1M Cacodylate(卡钻的纳)缓冲剂内进行灌流, 可得到较好的结果。Lewreoe Furst（75年）用1%多聚甲醛加入1%的戊二醛溶于0.1M Cacodylate缓冲剂内（pH为7.5）进行灌流, 效果也甚好。日本的里见肇及山本悌司在胃浆膜下注入HRP观察延髓迷走背核及孤束核的HRP标记颗粒时则用2%多聚甲醛及0.5%的戊二醛作为固定液。我们实验室将里见肇的方法加以改良, 单独用2%多聚甲醛, 不加戊二醛, 溶于0.1M磷酸盐缓冲剂内pH为7.2-7.3, 在灌流动物时用冰将固定液冷却至0-4 进行灌流得到满意的结果。对于是否加戊二醛的问题, 我们认为戊二醛和多聚甲醛都可以做为固定剂, 戊二醛对酶的破坏性比多聚甲醛大, 而其穿透性又比多聚甲醛要小, 所以可以不用戊二醛（此药比较贵重, 而且不易买到）。灌流液冷却至0-4 , 这不仅是防止酶的破坏, 另一方面还可以减少酶的扩散12。灌流后取材, 再将组织浸泡于同一固定液1-2小时, 然后用含5%的蔗糖0.1M的磷酸盐缓冲液（pH7.2-7.3）中冲洗, 洗三次（每次隔20分钟）后置冰箱内过夜, 第二天早晨切片并做成色反应。取材后固定时间要视组织块的大小而定, 从一小时到几小时不等。如组织块小固定时间长, 则可抑制酶的活性而影响成色反应。加入蔗糖的目的是保护渗透压（13）固定不良则酶易受渗透压的影响而在制片过程中HRP被扩散, 加入蔗糖的百分比, 一般认为5%-10%。四、成色反应及辨别问题辣根过氧化物酶的成色反应, 最初是Straus联苯胺作为成色剂。在低温或弱酸环境下呈兰色, 而在室温及弱碱情况下呈棕色。1966年Graham用3-3二氨基联苯胺（Diomino banzemdine tetrahydrcchlo）简称DAB做成色剂是棕色反应。成色反应可在DAB（或联苯胺） 加H2O2液中一次完成, 也可以分为二步。将切片置于DAB（或联苯胺） 加H2O2液中进行孵育是一次成色反应。如将切片先放入DAB液中置37 恒温箱内浸泡一定时间, 然后加入H2O2再浸泡一定时间为二步完成成色反应。根据我们实验室的经验还是分两步较好。我们先将切片置于0.05%DAB液中（溶剂为含5%蔗糖的0.1MPO4缓冲液, pH7.2-7.3）在37 恒温箱中进行予染30分钟, 然后再将予染液连同切片从37 恒温箱中取出加入0.3%H2O2（每毫升染液中加入1毫升） 置于室温（20） 内30分钟进行孵育。如上述步骤HRP在神经细胞内的棕色颗粒清晰可见, 围绕着细胞核的周围成为比较均匀的棕黑色颗粒。暗视野现察, 棕黑色的颗粒呈明亮的小点与黑色的背地形成显明的对比, 恰似夏夜星空一样瑰丽。此外, 我们的试验证明:HRP在孵育液内时间过长或温度过高则神经细胞质内呈现均匀的黄色背地。以致影响HRP棕色颗粒的清晰度, 对显微摄影及镜下观察都有一定影响。五、用HRP法追溯周围神经联系的可靠性问题HRP法用于中枢神经系统自从Lavail et al在1972-1973年开始建立以来, 近七、八年间, 这方面的实验工作如雨后春笋, 有许多报导。对于其可靠性问题似无非议。因为在中枢有血脑屏障, 辣根过氧化物酶（分子量）40000不能从血液进入脑组织。关于周围神经系统HRP是否可以由神经末梢摄入, 经轴浆流入神经细胞体而不是血液运输至神经细胞内的问题。根据我们的大量试验（兔60只, 猫30只）结果, 是可以肯定的。（参见本期胃交感内脏传入神经元的节段性一文）。从50年代Nauta溃变神经染色法问世以来, 神经解剖学向前推进了一步, 解决了许多没有解决的问题。70年代HRP法的建立, 更使神经解剖学的进程大大向前推进。我们目前的实验工作, 可用HRP法分别观察交感内脏传入一级神经元脊神经节细胞的节段性和体壁（足三里穴区）一级感觉神经元脊神经节细胞的节段性。如无HRP法的建立是无法进行这种实验的。因此HRP法对追溯周围神经系统的联系起到了巨大的作用；对探讨神经解剖学中尚未解决的问题是个好的研究方法。同时, 对针灸针麻原理中经络实质的研究-体表内脏相关的问题也起到推动作用。洪伟杰张朝晖芦国营.辣根过氧化物酶的结构与作用机制2. HRP的作用机制2. 1植物体内的功能由HRP催化的多数反应可由以下等式表示,AH +H2O2-A + 2H2O其中AH是还原性底物, A是自由基。还原性底物包括芳香族化合物,酚类化合物,吲哚,胺类和磺酸盐。在HRP催化反应中,自由基的形成暗示了HRP在植物胞内中可能所起的作用。这些功能可能包括一些交联反应,如: 酪氨酸交联形成双酪氨酸,交联酚类单体形成软木脂,氧化偶合酚类化合物等。当遇到一些外部因素时,过氧化物酶的交联反应就有可能启动,如: 植物组织受到创伤。当失水或有病原体入侵时,此类植物就会合成一种保护性的聚合物屏障来减少伤害, 如: 软木脂等。但是HRP在体内的作用并没有完全被阐明 8 。2. 2 催化机制Dunford 等 9 广泛地研究了HRP的催化机制,尤其是HRP C。图3中以阿魏酸( ferulate)为还原性底物,阐述了一些催化循环中的重要特点。图3中生成的两个带电子的产物可能会引起更复杂的反应,包括形成二倍体、三倍体、多聚体,以及启动一个以该产物为底物的反应。催化循环的第一步是H2O2 和静态酶中的Fe( )反应生成化合物 (HRP) , HRP是一个高氧化态的催化中间体,包含一个含氧Fe ( )中心和一个带正电荷的卟啉。其实低温下在HRP形成的过程中还测到另一个催化中间体(HRP0) , HRP0被看成是H2O2-Fe ( )混合物,但是它的存在非常短暂。在正常情况下, HRP再经过两个等式就能回到静态酶。第一个等式由一分子还原性底物的加入,生成另一个含有含氧Fe ( )中心的催化中间体HRP。HRP和HRP都是强氧化剂,氧化还原电势接近+ 1 V。第二个等式也是有一分子还原性底物参加,使HRP还原成静态酶。在静态酶中加入过量H2O2 时,会使酶部分失活,这是由于生成了另外的一个催化中间体HRP, HRP又会引发另一系列的反应。HRP被认为是Fe ( )超氧化物与Fe ( )双氧化物的杂合体 10 。孙立水,高强.过氧化物酶的应用研究进展辣根过氧化物酶(HRP) 使苯酚或苯酚衍生物等有机化合物褪色的机制已经被阐明5 。最近Bhunia 等人6 研究表明, HRP 在降解Remazol 等重要的工业含氮染料时,有很高的效率。Bhunia 等通过研究HRP 对多种染料(如Remazol 和Cibacron) 的作用,阐明了它的结构特征,其中包括降解染料的最适pH 值、酶的内在活性、所选染料降解的动力学常数以及HRP 在染料中或者在H2O2存在下的失活情况。由于HRP 在染料中会失去活性,因此不能广泛应用于染料污染造成的污水治理。HRP 已经应用于聚苯胺的聚沉反应中12 ,但HRP 催化苯胺的活性较低,并且在pH 4.5 时不稳定13 。在自然界中有的过氧化物酶在较低的pH 值时,表现出很好的稳定性,因此可以用这种酶在酸性条件下来催化聚合苯胺。戚红卷, 陈苏红, 王升启.辣根过氧化物酶( HRP)底物的研究进展用酶标记各种特异性配体(抗体、抗原等) ,利用酶的催化放大作用和特异性作用而建立的标记免疫分析叫做酶免疫分析( enzyme immunoassay, EIA) 1 。在酶免疫分析中将在酶催化作用下产生新化合物的物质统称为底物。一种酶能催化特定的底物,将其转化为有可检测信号的产物。酶仅使底物转化为产物,本身在反应过程中并不消耗,反复起催化作用,将信号放大。传统的EIA采用色原底物测量可见光的吸光度,随着酶免疫分析技术的发展,出现了灵敏度更高的放射性底物、荧光底物和化学发光底物,而改为测量释放的射线、荧光和化学发光。由于采用放射性底物存在接触和处理放射性物质的危险,而随后出现的荧光和化学发光检测的灵敏度已经达到或超过该方法,因此放射性底物出现后不久即很少使用。目前常用于EIA的酶包括如下3种:辣根过氧化物酶( horseradish peroxidase, HRP) 、碱性磷酸酶( alkaline phosphatase, AP)及-D-半乳糖苷酶(-D-galactosidase,GAL) 。其中HRP分子最小、易于与蛋白耦联,而且呈色性好,应用最为广泛,因此对HRP底物的研究在基于酶的分析检测中具有非常重要的意义。本文对近年来HRP底物的研究进展作一综述。1色原底物最早的HRP底物是色原,常规的色原底物在酶作用下产生一种新的颜色(或者吸收光谱发生改变) ,这种检测方法的优点在于产生的颜色很容易用肉眼或光谱仪器检测,检测仪器的价格一般也比其他检测方法所用的仪器便宜;缺点是检测灵敏度普遍低于其他酶检测方法。色原底物的基本结构可用变化多样的芳香族胺和酚表示,大多数芳香胺、酚和它们的混合物在酶促氧化时会产生有色的缩聚物。常见的芳胺类色原底物包括: 邻苯二胺(OPD) 、四甲基联苯胺( TMB) 、2, 2-连氮-双-(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸) (ABTS) 、5-氨基水杨酸( 5-AS) 、邻联二茴香胺(ODA) 、邻联甲苯胺(OT)等 1 。部分色原底物的分子结构式见图1。2荧光底物与色原底物相比,荧光底物检测灵敏度高,而且可以同时采用几种不同颜色的荧光材料;但是荧光底物存在以下缺点:激发和检测荧光需要价格昂贵的光源、过滤器和扫描仪,检测成本高;荧光在观测期间或样品存放期间、甚至暴露于室内光线时都会衰减,导致难以获得恒定值或定量数据;另外从细胞和其他分子里产生的自发荧光(在许多活体中天然存在的某些特定化合物产生的荧光)也会对实验结果产生干扰。常规的荧光材料难以直接用作HRP底物,但是它们与酪胺 4 - (2-氨乙基) - 苯酚耦联后却可以在HRP作用下发生沉积。这种基于酪胺的荧光色素沉积技术的正式名称叫催化报道分子沉积( catalyzed reporter deposition, CARD) ,或者酪胺信号放大( tyramine signal amplification, TSA) 。该技术是由Bobrow等 3 于1989年首次提出的,其应用范围开始仅限于免疫印迹和EL ISA分析,后来则延伸到免疫组化、原位杂交等诸多领域,在基于酶的灵敏检测中得到广泛的应用 46 。CARD的基本检测过程包括以下几个步骤:首先使用生物素化的抗体或核酸探针,通过蛋白质或核酸的结合来检测靶标的存在;接着引入链酶亲合素-HRP耦联试剂,链酶亲合素与生物素特异结合;最后引入荧光标记的酪胺底物,在HRP作用下,酪胺的酚基发生反应形成自由基中间体,该中间体与周围的物质快速反应,从而将荧光材料沉积或固定在附近区域。这个过程通过供给更多的底物(荧光素化酪胺)而重复进行,在局限区域内积聚起更多的荧光材料,最后通过激发扫描即可实现高灵敏度的荧光检测。用于标记酪胺的常见荧光材料包括:荧光素( F ITC) 、青色素(Cy3、Cy5)等。与CARD中荧光分子只有通过与酪胺形成复合物才能被HRP催化沉积不同, Krieg等 7 合成了一类2-( 2-苯乙烯基)-苯并噻唑衍生物,这类化合物可以作为新型荧光底物直接用于HRP的活性定位,其基本结构式见图3。经过优化筛选,其中( E)-2-2- 4-羟苯基乙烯基-3-乙基-1, 3-苯并噻唑碘化物的效果最好,与Alexa荧光素546酪胺偶合物相比,这种新型的底物荧光染色特异性强、灵敏度高、背景低。总之,通过将苯乙烯基苯并噻唑衍生物进行酶交联从而在HRP活性位点附近产生多重荧光色素,是一种可以替代荧光染料标记酪胺沉积技术的很有前景的方法。3化学发光底物化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。化学发光与荧光的区别是形成激发态分子的激发能不同,荧光是吸收了光能使分子激发而发射的光,化学发光则是吸收了化学反应过程中所产生的化学能使分子激发而发射的光。化学发光底物一般具有高化学键能,在酶的作用下化学键断裂,能量释放出来形成可见光。图4展示了一种化学发光底物鲁米诺的发光机制。信号采用光电倍增管、雪崩二极管或其他灵敏的光学检测器检测,或者采用照相胶片显影。化学发光检测灵敏度高、背景低,因而得到广泛应用。但是这种方法也存在很多缺点:检测仪器价格昂贵,采用胶片显影又不方便;发射光必须随时采集,导致难以得到恒定值数据;要实现高灵敏度检测,需要长达数小时甚至1 d的光积分时间等。化学发光物质大多是有机化合物,它作为氧化反应的底物,在反应中转变为激发态分子。常用的化学发光底物包括以下四类: 酰肼类,如鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼) ,异鲁米诺(4-氨基苯二甲酰肼)及其衍生物; 咪唑类,较常用的是2, 4, 5-三苯基咪唑,俗称洛酚碱; 吖啶盐类,最为常用的是N, N-二甲基吖啶硝酸盐(俗称光泽精) ; 草酸盐类,该类化合物本身不是有效的化学发光剂,它和H2O2反应生成过氧化物中间体,而这种中间体是一个最佳的化学发光关键性中间体,它能释放出较多的能量,此能量可转移至加入反应体系的另一种物质的分子,使这种物质的分子激发而发光。这类化学发光反应的发光效率很高,例如双-( 2, 4, 6-三氯基苯)草酸盐( TCPO) 8 。近年来有研究小组陆续报道了一些新型化学发光底物并成功地应用到实际检测中。Ichibangase等 9 以2-(4-羟苯基) -4, 5-二苯基咪唑(HD I)的月桂酸酯为底物,发展了一种用于测定脂肪酶(三酰基甘油脂酶)活性的新型化学发光分析方法,该方法是基于氨基苯二酰肼-H2O2-HRP与通过酶水解底物而产生的HD I发生增强的化学发光反应。Yakovleva等 10 将亲合蛋白通过共价键固定在硅基芯片上,开发了一种基于HRP催化鲁米诺/对碘酚的复合物化学发光氧化的微流路免疫传感器,采用带有长柔性链的各种亲水性聚合物(如聚乙烯亚胺、葡聚糖、聚乙烯醇等)对硅基表面进行修饰,随后连接蛋白A或G。为了识别和控制在细胞和聚合材料之间界面的配体-受体相互作用, Takei等 11 研究了一种水相介质中的模式系统,这种系统以HRP为酶,以4-氨酰安替比林(AAP) 和3-(对2羟苯基) 丙酸(HPPA) 作为底物。Tang等 12 合成1, 5-bis ( p-hydroxybenzaldene ) thiocarbohydrazone(BHBTZ) 作为一种新型HRP 底物, 实验显示抗坏血酸(AsA)对BHBTZ-H2O2-HRP反应系统具有强烈的抑制作用,因此将AsA作为酶抑制方法的抑制剂进行了分光光度测定,该方法成功地应用于茶饮料中AsA的测定。4纳米金底物纳米金是指直径在1100 nm尺寸的微小金颗粒,一般以分散在水中的溶胶形式存在,因而也称胶体金。纳米金具有表面效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应等独特的物理化学性质以及良好的生物相容性,因此非常适合于生物大分子的标记和检测 13 。但是这种胶体形式的纳米金存在一些固有的缺点:颗粒大小不一、易凝集、与生物分子以静电吸附结合,标记不稳定且假阳性率高等。为了克服这些缺点,近年来美国Nanop robes公司开发了一种新型的纳米金颗粒并命名为“nanogold”,该颗粒是以一个包含大约67个金原子的簇化物为核心的复合体,通过位于其表面的金原子与三芳基磷配基或卤化物离子结合而形成稳定的纳米金分子,其中心粒径仅1. 4 nm,表面不带电荷,在溶液中呈离散状态。这种新型的纳米金与胶体金相比有诸多优点: 颗粒小且均匀一致、标记密度高、穿透性好; 经特定基团修饰后可以与生物分子以共价键结合,使得标记分子高度稳定; 颗粒表面不带电荷,因此不易凝集,适用于很宽的pH范围和离子强度中,等等。由于nanogold的上述优点,因此一经出现便迅速应用到原位杂交、免疫组化、Western印迹检测法等生物医学检测的众多领域 1416 。纳米金用于生物检测的研究已有接近一个世纪的历史,20世纪80年代初免疫金银染色( immuno-gold-silver staining,IGSS)技术的出现是纳米金应用于生物检测的里程碑 17 。该技术首先用纳米金标记待检的抗体或抗原,然后在体系中引入银离子。小尺寸效应使纳米金颗粒具有很强的催化还原作用,可以将周围的银离子还原成银颗粒;而这些银颗粒又可以进一步催化还原周围的银离子。这种级联瀑布催化作用使得银颗粒越聚越多,紧紧包裹纳米金颗粒积聚成团状银壳,形成几乎肉眼可见的黑色颗粒,用普通电镜甚至肉眼即可观测。IGSS的检测成本远低于荧光和化学发光检测,与色原检测相比又显著提高了灵敏度,因此很快得到广泛应用。为了提高IGSS的检测灵敏度,使之适用于检测组织中的稀有抗原。Lee等 18 将IGSS与免疫组化中广泛应用的TSA技术进行了结合。检测流程是首先将待检组织进行固定和封闭;然后依次加入一抗、生物素化二抗、链酶亲合素标记的HRP、生物素标记的酪胺以及链酶亲合素标记的纳米金,并分别在加入各步试剂后温育,最后加入银增强试剂染色;样本同时采用IGSS检测,即在加生物素化二抗温育后直接加链酶亲合素标记的纳米金,然后银染。用电镜观察两种检测流程的组织切片并进行比较,结果显示IGSS与TSA结合大幅度提高了标记密度和检测灵敏度。但由于纳米金必须通过两步反应才能沉积,即HRP首先催化生物素化酪胺反应以及随后生物素与链酶亲合素纳米金结合,因此检测过程相对繁琐。Hainfeld等 19 制备了一种包含有机配基的新型纳米金,它的最大特点是可以直接被HRP催化沉积,因此可以作为一种新的HRP底物。制备方法是首先将金盐用水溶解,接着将谷胱甘肽和对羟基苯硫酚加入金盐水溶液,最后加入NaBH4还原即可。产物用凝胶过滤色谱纯化。通过控制反应条件,得到了粒径范围在13 nm (标称1. 4 nm) 、含有酚基和巯基的纳米金颗粒。Gatan等 20 将这种纳米金底物作为探针,用于免疫组化中稀有组织抗原的标记与检测。结果显示,与IGSS结合TSA以及非放大IGSS相比, HRP催化纳米金底物沉积,然后银染的流程得到了最高的检测灵敏度和特异性,而且比IGSS结合TSA的方法简化了检测流程,更适合于稀有抗原或微量核酸等生物样本的高灵敏度检测。5展望HRP在酶免疫分析中占有重要地位。在前述的三类主要HRP底物中,早期的色原底物检测灵敏度不高,随后发展起来的荧光底物和化学发光底物显著提高了灵敏度,但面临的共同问题是检测仪器价格昂贵,从而限制了其应用。另外这两种底物自身也都存在一些缺陷:荧光信号易饱和、易猝灭,以及自发荧光对实验结果产生干扰;化学发光必须随时采集,光积分时间长等。与之相比,纳米金底物具有一系列突出优点:灵敏度高,纳米金颗粒的消光系数比色原底物和荧光基团高大约1 000倍;检测成本低,采用电镜甚至目视即可检测;沉积金属非常稳定,使检测信号容易得到恒定值,等等。纳米金底物已经作为新型的标记探针,用于免疫组化中稀有组织抗原的高灵敏度检测。基因芯片是基于核酸互补杂交的原理而发展起来的一项生物高新技术,是高效大规模获取生物信息的重要手段,在基因表达谱研究、疾病分子检测和大规模药物筛选等许多领域具有广泛的用途。荧光检测是基因芯片的常规检测方法,因此存在检测仪器价格昂贵、荧光猝灭、自发荧光等一系列缺点。近几年,已经有研究小组将金银染色技术用于基因芯片的可视化检测,但缺点是灵敏度低,不能满足分子检测的要求 21, 22 。将HRP催化纳米金底物沉积并附加银染的方法用于基因芯片的信号检测,将会大幅度提高可视化检测的灵敏度,实现基因芯片的高灵敏度可视化检测。该方法将突破荧光检测成本高导致基因芯片技术难以推广的瓶颈,展现出广阔的应用前景。冯春梁,于洪学,李亚男,刘媛媛. 储存条件对溶液中辣根过氧化物酶活性的影响HRP以干粉态能被保存数年,但在溶液中就很不稳定. 溶液中的酶在一定的pH范围内是相对稳定的,超出这个范围后,酶就会变性失活 6 . 由于缓冲液中含有大量离子,或影响酶蛋白的构型,或影响底物的解离程度,因此缓冲溶液的种类也会对酶的稳定性产生很大的影响. 随着保存时间的延长,酶也将逐渐失活. 以往的文献报道都是将HRP配成pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液保存,实验中发现,此条件下HRP的失活速度较快. 为了更好地了解HRP溶液的稳定条件,本文以HRP催化H2O2 氧化邻苯二胺为反应体系,利用紫外- 可见分光光度法,以反应初始速率为测试参数,考察了缓冲溶液种类,酸度条件以及保存时间对HRP稳定性的影响. 发现HRP在磷酸盐- 磷酸二氢钾缓冲溶液中保存较稳定,最佳保存pH值为8. 0, 0. 1g/mL HRP溶液保存7天活性基本不变,保存15天活性变化明显,但保存30天后活性只有10以下. 结果令人满意,对其它酶溶液的保存有重要参考价值.2. 1pH对HRP活力的影响在一定pH值下,酶催化反应具有最大反应速率,亦即酶具有最高活力,这一特定的pH值被称为酶的最适pH值.2. 2pH对HRP稳定性的影响酶是一种贵重试剂,所用酶溶液的浓度一般都非常小,故每次配制的量不能太少,否则会带来较大的误差. 因此,配一次溶液应该保存使用一段时间. 本文对溶液中HRP的稳定性进行了研究. 所说的稳定性是指在溶液中酶的活性发生变化的情况.3结论本文以HRP催化H2O2 氧化OPD为反应体系,利用时间驱动的方法,通过考察反应速率的变化来确定辣根过氧化物酶稳定性的变化. 从缓冲溶液、酸度条件、贮存时间三个方面研究了影响HRP稳定性的因素.实验结果表明,当HRP溶液浓度很低时, HRP在磷酸盐缓冲溶液中更为稳定, HRP在pH 8. 0的0. 1mol/L磷酸盐缓冲溶液中保存7天,活性基本不变,保存30天后HRP活性基本消失. 本实验为贮存低浓度的HRP提供了一种较好的方法.肖明丁炯左国平. 辣根过氧化物酶示踪大鼠孤束核、臂旁核至中央杏仁核纤维投射的解剖观察摘要目的研究孤束核(NST) 、臂旁核(PBN) 至中央杏仁核(CNA) 纤维投射,为阐明三者对内脏心血管活动的调节机制提供形态学资料。方法用辣根过氧化物酶(HRP) 逆行追踪标记技术,研究NST、PBN 向CNA 投射的起始神经元形态与分布。1 材料和方法111 材料成年SD 大鼠10 只,体质量180230 g ,雌雄不拘,南京医科大学动物中心提供。112 方法大鼠经2 %戊巴比妥钠(40 mg/ kg) 腹腔麻醉后,参照文献2 的大鼠脑定位图谱,在江湾型立体定位仪引导下,用接尖端直径15m 微玻管的微量注射器向CNA 分次注入30 %辣根过氧化物酶(HRP) ,共0. 1l ,留针15 min。动物存活2448 h 后再次腹腔麻醉,开胸,经左心室插管至主动脉灌注0. 4 %多聚甲醛和1. 25 %戊二醛磷酸缓冲液固定液(0. 1mol/ L ,pH7. 4) 300 ml ,取脑置固定液后固定2 h ,含20 %蔗糖的磷酸缓冲液(0. 1 mol/ L ,pH7. 4) 4 过夜,冰冻切片厚30m ,按文献 3 (Mesulam 法) 进行HRP 呈色,贴成2 套连续片,其中1 套中性红复染。禽类海马结构直接投射于禽类小脑各叶的神经元定位辣根过氧化物酶（HRP）逆行追踪法研究本试验研究以粤禽黄鸡、成年鸽、仙湖白鸭为试验材料，采用HRP逆行追踪法，将50卸RP溶液分别注射青年鸡小脑、V、各叶。成年鸡、鸽、鸭同时注射小脑、三叶，逆行追踪直接投射于禽类小脑各叶的起始神经元。对端脑及间脑、脑干及小脑进行冰冻切片，IMB呈色，观察脑内标记细胞出现的位置。结果表明：1文献综述11脑与神经系统神经系统(System nervosum)由脑、脊髓、神经节和分布于全身的的神经组成。神经系统能接受来自体内外器官和外界的各种刺激。并将刺激转变为神经冲动进行传导，一方面以调节机体各器官的生理活动，保持器官之间的平衡和协调；另一方面保证机体与外界环境的平衡和协调一致，以适应环境的变化因此，神经系统在机体调节系统中起主导作用【l】神经系统由中枢神经系统和遍布全身各处的周围神经系统两部分组成。中枢神经系统包括脑和脊髓，分别位于颅腔和椎管内，是神经组织最集中、构造最复杂的部位，存在有控制各种生理机能的中枢。周围神经系统包括各种神经和神经节。其中同脑相连的称为脑神经，与脊髓相连的为脊神经，支配内脏器官的称植物性神经。各类神经通过其末梢与其他器官系统相联系。脑(brain)是神经系统中的高级中枢，位于颅腔内。低等脊椎动物的脑较简单。人和哺乳动物的脑特别发达，可分为大脑、小脑、间脑和脑干四部分。其中大脑是神经系统最高级部分，小脑在大脑的后下方，脑干包括中脑、脑桥和延髓，由神经细胞集合成团块而成神经核或神经中枢，并有大量上、下行的神经纤维束通过，连接大脑、小脑和脊髓，在形态上和机能上把中枢神经各部分联系为一个整体。112小脑1121小脑的进化原始的小脑出现在圆口类的七腮鳗，在大多数鱼类，小脑还不发达，体积小，表面光滑，它只是横跨在第四脑室上方的一小块凸起的顶壁。软骨鱼中的鲨鱼小脑较大，表面甚至出现沟裂，这是比较特殊的例外。两栖类和爬行类的小脑不发达，表面也缺乏沟回，少数在海中洄游的龟类小脑的体积在整个脑中占有较大的比重。爬行类的小脑内部开始出现神经核团，这标志小脑接受传入信息和发出传出联系增多。鸟类的小脑非常发达，在种系发生上显得寒出。它的小脑体积大，表面沟回紧凑，位于内侧的新小脑部分特别发达，接受来自脊髓的传入纤维和来自上位脑结构的投射纤维数量增多，与之相应的传出联系也更为广泛，因而脑桥及橄榄核亦随之发达。到了哺乳类，小脑进一步发展，新小脑、旧小脑及古小脑分部清楚，表面的沟回变得更为复杂，神经核团更加分化、发达，其生理功能也更为完善和重要。12神经解剖学神经解剖学是研究神经系统形态和结构的科学，属于解剖学的一个分支。近年来，随着生命科学相关学科的发展和技术方法的进步，也极大地拓宽了其研究领域。121当代神经解剖学的主要研究内容神经系统主要由神经组织构成，神经组织则由神经细胞(神经元)和神经胶质细胞构成以往对神经系统的研究多集中在神经元方面，阐明脑内不同结构之间的神经纤维联系及其神经活性物质和受体的分布状况，是神经解剖研究的基本任务之一。而近年来对神经胶质细胞的研究也受到人们的重视，并取得了诸多新认识，加深了对神经系统的理解成年动物脑内神经元的形态非常复杂，具有许多突起(树突和轴突)，其中投射神经元的轴突的行径长、分支多、联系广泛树突和轴突不仅是神经元的重要组成部分，而且在各种神经信息的传入和传出过程中起关键作用，完整地显示这些突起对于阐明神经元的形态学特征、揭示神经信息的传递和调控过程、阐明脑的构造和机能来说是必须的95。经过100多年的艰苦探索，人类已经基本上了解了神经系统的基本形态和结构，如白质内主要的神经纤维传导束路及其起源和终止部位、灰质的分层及其内的主要核团、脑内一些主要核团(结构)之间的纤维联系、有关神经活性物质及其受体的定位分布等96。当代神经解剖研究的主要任务是阐明脑内一些具有重要功能意义的局部环路及其所含神经活性物质和受体，揭示它们在某些生理或病理条件下的可塑性变化，如对大脑皮层内与学习记忆、情感等有关的局部环路，脊髓背角层(胶状质)内的镇痛局部环路等。另外，近年来广泛开展的某些神经系统疾病的病因学和病理学探索、神经损伤后的移植和再生过程及其影响因素、某些病理条件下神经组织的可塑性变化及其神经活性物质和受体的动态变化规律等研究，也极大地丰富了神经解剖研究的内容虽然近年来分子生物学研究空前发展，但是在神经系统的分子生物学研究中，要想证实结果并令人信服，仍然离不开神经解剖研究结果的支持。122当代神经解剖学研究的方法技术方法的创新是促进自然科学发展的重要因素，一百多年来神经解剖学的发展也充分说明了这一点。每当一种先进的技术被引入神经解剖学的研究领域，人们对脑的认识也就随之深入一步，方法学的进步在神经解剖学的发展中起着关键作用。自从20世纪70年代初将辣根过氧化物酶(HRP)应用于追踪神经纤维联系以来，该方面的研究取得了前所未有的迅猛发展97，辣根过氧化物酶(HRP)逆行示踪技术已经广泛应用于动物实验，成为检验神经通路最客观的方法【98】。123 HRP示踪法的产生与演变辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)是从辣根中提取出来的一组同功酶混合物，其中只有几种能用作神经的追踪剂。HRP通常用RZ(reinhietzahl，德语纯度值)来表示。用紫外线分光度计测HRP时，在275nm及403nm处各有一吸收峰。Z=403nm吸收度275nm吸收度，因此,RZ也称吸收比。用作追踪剂的HRP其RZ应大于3.099-100。1971年Kristensson等101,102及1972年La Vail等【103,104先后将HRP用于追踪周围神经及中枢神经系的纤维联系，创造了HRP追踪技术。最初，HRP是作为一种逆向追踪剂被介绍于世的，即将HRP注射于神经末梢所在部位，HRP随即被神经末梢通过非特异性整体胞饮(bulk endocytosis)的方式摄入，逆向至胞体，然后用组织化学方法显示之；以后发现HRP也可以被神经元的胞体摄入，顺向运送至末梢部位，因而也可用作顺向追踪。HRP注射于周围神经感觉末梢部位逆向标记背根神经节细胞后，还可进一步沿背根节中枢突顺向标记其中枢终止部位，称作跨节标记(Transganglionic labeling)99,100。为增强HRP示踪法的功效，可在HRP液中另加入某种添加剂以促进HRP脱离胞体或向胞体输送，或在实验中设法消除传到注射部位的冲动105。124HRP示踪法在研究中的应用与展望随着现代生物学的发展和新的研究技术的应用，神经解剖学有了迅速的发展，自从70年代早期Kristensson等【101,102用于追踪舌下神经联系，La Vail等【103,104用于中枢神经系统研究以来，人们利用HRP示踪法追踪周围及中枢神经方面作了大量的工作。先后将HRP应用于外周神经和中枢神经的研究，追踪神经元之间的传入和传出的联系，开创了HRP追踪法。国内外学者利用这一技术进行了广泛的研究，取得了丰硕的成果。但大多数研究在猫、兔、鼠等哺乳类进行的，对禽类，特别是鸡的研究较少，且不够深入。随着方法学的不断创新和先进技术的不断引进，为了给禽类消化、生殖生理及免疫学的研究提供形态学基础，促进养禽业的发展，HRP示踪法在神经解剖学科学领域依然占据着重要的地位，在揭示脑的奥秘方面发挥着不可替代的作用。3材料与方法31试剂与材料311试剂辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP,R7=3，Sigma型) 美国Sigma-Aldrich公司硝普纳(亚硝基铁氰化钠，Sodium nitroferricyanide) 美国Sigma-Aldrich公司四甲基联苯胺(3，3，5，5-四甲基联苯胺，TMB) 美国Sigma-Aldrich公司乌拉坦(氨基甲酸乙酯)， 国药集团化学试剂有限公司禽用生理盐水，01MPBS(pH74)，双氧水，酒精，浓盐酸，二甲苯，蔗糖，中性红等312主要试剂的配制(1)禽用生理盐水：试剂reagent 剂量dosageNaCl 0.75g 蒸馏水distilled water 100ml总量total amount 100mlC)PB和PBS缓冲盐液：PB母液的配制；A液(酸性)：02molL NaH2P04H20(分子质量13801)276g,溶解后倒入1000mL容量瓶中，加蒸馏水到终刻度。B液(碱性)：02molL Na2HP0412H20(分子质量35814)71632g,溶解后倒入1000m1,容量瓶中，加蒸馏水到终刻度。(3)01M pH74的PBS的配制：试剂reagent剂量dosageA液liquid A 19mLB液liquid B 81mL蒸馏水distilled water l00mL总量total amount 200mL(4)呈色反应液的配制：1)02M醋酸缓冲液(pH33)(100mL)：试剂reagent剂量dosage醋酸钠3H2O natrium aceticum 272g蒸馏水 distilled water 81mL1.0N HCI 19mL测pH，用浓醋酸或氢氧化钠调pH至33。314仪器：江湾I型C小动物脑立体定位仪，上海奥尔科特生物科技有限公司生产；KD-500型推拉式三用切片机，浙江科迪仪器设备有限公司生产KD电脑快速制冷器，浙江科迪仪器设备有限公司生产；1l微量进样器，上海光正医疗仪器有限公司生产；Tiger显微图象分析系统，由暨南大学组织胚胎学教研室研制。32方法321 HRP逆行追踪选择健康活泼的实验动物，按1000mg/Kg剂量翼静脉内注射40乌拉坦施行全麻，将实验动物保定于脑立体定向仪上并固定头部，口角与耳棒呈45。前下倾斜角度，外科方法剪毛消毒后于后囟后方偏左一侧开颅，切开脑硬膜，将已吸取50HRP水溶液的玻璃微针(用毛细玻管拉制而成，内径20-40m)固定于立体定位仪的电极夹持器上，在正中矢状面(以矢状窦判定)稍偏左一侧的部位向小脑各叶进针：然后手控与微玻管相连的压力推进器注射HRP 03uL，5 min注完并留针10min，然后缓慢撤针。青年鸡每例在一叶上均分点注射3点，共注入HRP0.9l。由于开颅后、三叶能够完全暴露，容易注射，因此对于成年鸡、鸽、鸭采取同时注射、三叶，每叶注一点，注射量依个体而定(表1)，注毕闭合创口。术后自由进食与饮水，动物存活4896h。322灌注术后实验动物自由进食与饮水，动物存活4896h，按Mesulam（1982）方法灌流固定。灌注前再次用乌拉坦全身麻醉，绑缚保定，在腹部剖开口，纵行剪开心包，充分暴露心脏在左心室尖端剪一小口，将与输液管相连的大号针头(针头尖端被磨平)插入升主动脉中，但不能伸入主动脉太远，用止血钳固定针头，并立即放松输液管夹子开始灌注，灌注液高度18m,同时剪开右心房放血。先快速灌注21左右的禽用生理盐水500mL(4,-,-6 min灌完)以冲去血液；之后迅速灌注21左右的固定液400500mL，前一半速灌，后一半缓灌，持续30 min灌注；最后灌注蔗糖，灌注量及灌注速度同固定液。323取材灌注后立即取端脑两半球、小脑和脑干。对于固定良好的材料，置于10蔗糖溶液内4过夜。对于固定不良的脑，先行在与灌注固定液相同的液体中后固定4不超过4h，然后再移入蔗糖液中4过夜。当翌日见到脑沉入液体底层时，即可进行下一步骤。324制作冰冻切片制冰冻切片，片厚40m，端脑行横切，隔3片取1片，小脑行矢状切片，隔4片取1片，注射点部位每片均取，脑干行横切，每隔3片取1片。切片时，用毛笔将切片从刀上取下依次循环收集在24空网筛中，网筛置于盛有01M磷酸缓冲液(pH74)的有机玻璃反应盒中。载玻片涂新鲜配制的铬矾明胶液，按顺续从前到后依次将收集的脑切片贴到玻片上325呈色反应所有例脑切片经TMB呈色：(1)切片蒸馏水洗，1次，1015s；(2)温育液预浸，每个反应盒中加温育液100mL，2336，避强光20 min不时晃动切片。温育液的颜色应无明显变化，否则说明容器不净。(3)取出网盒，100mI温育液中加03H202 15ml混匀，重新浸入切片，不时晃动2336，20 min。避强光。(4)洗-保存液洗。04。6次，共约30 min。切片在此液中不得超过4h。326贴片载玻片上涂铬矾明胶。用毛笔按次序在洗-保存液中取片，贴片。室温下空气干燥。327复染切片自然干燥后中性红复染，丙酮脱水，二甲苯透明。步骤为：1中性红复染(812mi