综述溶菌酶的制备及其性质.doc

综述 溶菌酶的制备及其性质Abstract：Lysozyme is a kind of glucoside hydrolytic enzyme，and its molecular weight is about 1400015000DaLysozyme can hydrolyze the glucoside bond -1，4 between N-acetyl muramic acid，so that it can dissolve the cell wail of gram-positive bacteria and bacteriolyzeIt can be applied in many areas，for example，in food and drink fields as antiseptic substance and in medical domain as germicide.【实验要求】 ：通过探索和学习相关内容的理论和技术，熟悉并进一步掌握酶的提取，分离，纯化，检测溶菌酶的生物学性质和理化性质。【实验原理】 :溶菌酶：是一种有效的抗菌剂，又称胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。来源：自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的鼻涕、唾液、眼泪、尿、血浆、乳汁、淋巴液及鼻黏膜、肠道、腮腺、白细胞、肺、肝、脾、肾的细胞中，以及植物界中的卷心菜、萝卜、无花果、术瓜、大麦中，但以蛋清中含量最丰富。理化性质：分子量14700；溶于水，不溶于乙醚和丙酮，等电点为10.8，最适pH值6.5。最适温度50；稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；280nm的消光系数为13.0。酶活性可被该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-510-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+,Ca2+（10-510-3M）、NaCl所激活。提取原料： 鸡蛋（含量约为2%到4%）。鸡蛋清按水分和固形物所占比重，则含水分87%，固形物13%；固形物中大约90%是蛋白质，其中：卵白蛋白75%，卵类粘蛋白15%，卵粘蛋白7%，伴白蛋白3%。卵白蛋白分子量45000，pl4.7；卵类粘蛋白鸡卵粘蛋白分子量28000，pl3.9-4.5；伴白蛋白分子量77000，pl3.9。实验方法：a 热变性法：溶菌酶在酸性条件下耐热性好，耐热89C以上，100C加热仍然保持活性，而杂蛋白卵蛋白等变性温度低。可用热变性法来去除杂蛋白。b 等电点沉淀法：蛋清中其他蛋白等电点较低，为3到5左右（见上一步蛋清成分分析），溶菌酶pl为10.8，可用调pH来去除卵蛋白，来提高溶菌酶浓度。c D152树脂柱层析法：离子交换树脂法提纯溶菌酶是根据溶菌酶和离子交换树脂的基团之间进行交换的，由于溶菌酶是一种碱性蛋白质，可采用阳离子交换树脂。离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律。树脂对离子亲合力的大小，与离子的水合离子半径大小和带电荷的多少有关。经实验证明，在低浓度、常温下，离子交换树脂对不同离子的亲合力顺序有下列规律。对于在弱酸性阳离子交换树脂中具有相同价态离子的亲合力顺序为：Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+。根据弱酸性阳离子交换树脂的亲和力顺序，相同条件下弱酸性阳离子交换树脂对H+的亲和力比对Na+的亲和力要大，可采用D152，D201，D903型大孔树脂进行交换。蛋白质中溶菌酶含量一定，由于树脂对H+的亲和力比对Na+的亲和力要大，而使得溶菌酶与Na型树脂交换得更彻底，故本实验采用Na型树脂。d Sephadex- G-50分子筛柱层析：葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。Sephadex-G-50为每克凝胶膨胀时吸水5.0克，SephadexG-50 葡聚糖凝胶 G-50 分离范围1500-30000 适用于多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定。e SDS-PAGE：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小 和形状等因素，通过迁移率不同经过跑柱和染色后可以得到不同蛋白质的分离带，来鉴定蛋白质的种类。本实验用来验证只有一条带（溶菌酶），来鉴定纯度（可能只有溶菌酶）。f Folin-酚试剂法测定蛋白质含量：此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。g 微球菌和溶菌酶作用测定酶活力：由于溶菌酶能水解溶壁微球菌，使得底物悬浮液的浊度（可用450nm波长下的吸光度来衡量）下降，故可用反应液在450nm波长下吸光度下降的速度来表示酶活性。h. 超滤法提纯蛋清溶菌酶：超滤法是利用膜两侧的压力差，使小分子透过膜，而大分子物质留在膜内不透过，从而实现对酶的浓缩精制。超滤法的优点有不易引起酶变性失活，而且操作比较方便，因而近年米在酶制剂生产中得到了研究和应用。但存在膜容易堵塞，操作时间长等缺点。本文通过对超滤法提纯蛋清溶菌酶的研究，对提纯到的酶的收率和活性与酸性条件下热处理法、离子交换树脂法进行比较。i.【实验步骤简述（具体操作流程见书）】： 鸡蛋清的制备(pH=8) 鸡蛋清粗提取（去除较大的杂质）D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析（洗脱杂蛋白，根据分子量以及酸碱性）Sephadex-G-50分子筛柱层析（根据分子量大小进一步进行提纯溶菌酶）溶菌酶活力测定（根据产物在450nm处特定吸收光密度下降来测定活力）蛋白质分子量测定（福林酚法） 蛋白质纯度测定（SDS-PAGE显示一条带来表示纯度很高） 理化常数和激活抑制剂的测定【实验方法讨论】 ：1.溶菌酶的提纯方法：由于我国的溶菌酶生产存在收率低、活性低等缺点，所以目前溶菌酶的市场人部分依赖进口。本研究通过对热处理法、离子交换树脂法和超滤法提纯溶菌酶效果的研究，目的就是寻找一种操作简单、成本较低、适合产业化生产的方法，井尽可能提高溶菌酶的活性和收率，满足国内市场的需求。2.酸性条件下热处理法提纯溶菌酶：在酸性条件下溶菌酶具有热稳定性，不易变性失活，且溶菌酶和卵蛋白的等电点分别为11.0和4.5，由于溶菌酶和卵蛋白的性质著异，因而在接下来的实验中采用热变性和调pH值使卵蛋白沉淀的方法来探讨去除卵蛋白的较好方法。研究发现溶菌酶和卵蛋白之间存在静电作用力，在加热以及调等电点来除卵蛋白的时候溶菌酶会随卵蛋白一起沉淀。加入磷酸盐缓冲液后经热处理和调pH值到卵蛋自等电点，沉淀中不再含有溶菌酶，实验证明加入磷酸盐缓冲液可以去除溶菌酶和卵蛋向之间的静电作用力。研究得出去除卵蛋白效果最好的时候是在pH=7.5的磷酸盐缓冲液的条件下，100C下热处理2min，上清中溶菌酶纯度可达到67.17%，远高于其它条件的磷酸盐缓冲液以及碳酸氢钠缓冲液条件下的处理效果。该方法虽然简单成本低但是也造成蛋清余液无法重复利用，加人了实际生产成本。3.离子交换法提纯溶菌酶离子交换树脂法提纯溶菌酶是根据溶菌酶和离子交换树脂的基团之间的离子交换而进行的，由于溶菌酶是一种碱性蛋白质，常采用刚离子交换树脂。本实验选用了一种弱酸性阳离子交换树脂进行溶菌酶的提取，并探索了不同条件对溶菌酶活性及收率的影响。溶菌酶的提纯纯度、收率和活性除了受到离子交换树脂类型的影响外，洗脱液的类型和浓度、蛋清的pH值、提纯温度、均质条件、稀释倍数等也对其影响很大。通过对离子交换法提纯溶菌酶的纯度和活性研究表明，温度对溶菌酶纯化有一定影响，随着温度的升高，酶和树脂的吸收速率也随之加快：而蛋清液的pH值对提取到的溶菌酶活性和收率的影响是最大的，这是因为溶菌酶是碱性蛋白质，在偏酸性条件下比较稳定，碱性条下容易出现分解；蛋清得稀释倍数和均质条件对溶菌酶纯化也有一定影响，但稀释倍数超过4倍的时候树脂与溶菌酶的专一性吸附受到破坏，洗脱液中含有大量的卵蛋白，这是因为为稀释造成了溶菌酶和树脂之间的专一性吸附受到影响的原因，而均质则是通过破坏溶菌酶的物理结构破坏其活性。实验得到的溶菌酶的收率、纯度和活性都很理想，同时由于离子交换法原料来源简单、易丁再生、操作时间短、易于一体化生产而且吸附后的蛋清能再利用的特点，成为大批量生产溶菌酶的理想方法。4超滤法提纯溶菌酶超滤法是利用膜两侧的压力差，使小分子透过膜，而大分子物质留在膜内不能透过，从而实现对酶的浓缩精制。超滤法的优点有不易引起酶变性失活而且操作比较方便。溶菌酶分子量14000-15000Da，相对卵清蛋白分子量45000Da是一类分子量较小的物质。因此本实验用截留量的膜提取溶菌酶获得了较好的效果，但是超滤法在实际操作过程中超滤时间过长，超滤膜易堵塞，这限制了它进行溶菌酶工业化生产的利用。因此，有必要对超滤条件进一步进行研究。5. 溶菌酶的磁性亲和分离很多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地特异结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。如：酶和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合，特异性的抗体一抗原（包括病毒、细胞）、激素与其受体、载体蛋白的结合，基因与其互补DNA、mRNA及阻遏蛋白的结合，植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结合等。均属于专一性而可逆的结合，这种分子之间的结合能力叫做亲和力。亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术”。它具有分离快速，纯化效率高。特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。磁性介质被广泛用于分离细胞、核酸蛋白质等生物大分子和激素等小分子生物活性物质，其优点在于通过外磁场的作用可快速地实现固液及磁性介质与其它固形物间的分离，尤其是当待分离的液体样品含有其它固形物或粘度较大时。磁性亲和分离技术是将亲和吸附的专一性、高效性与磁性材料的磁可导向性相结合的一种新型分离技术。6.酶纯度的测定分析 蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学方法，如：电泳、HPLC等。其中常用的电泳分析方法有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等。纯的蛋白质在一系列条件下进行电泳时，都将以单一的速度泳动，它的非变性电泳图谱应只呈现一条染色带。HPLC常用于多肽、蛋白质纯度鉴定，纯的蛋白样品在洗脱图谱上呈现出单一的对称峰。电泳结果分析：1.根据电泳图谱分析溶菌酶的纯化情况。2.根据标准蛋白的分子量和迁移率及目的蛋白的迁移率，计算目的蛋白的分子量（以lgM对迁移率R作图，其中M为蛋白质分子量）。7.酶活力的测定 酶活力的测定采取溶菌酶能水解溶壁微球菌，使得底物悬浮液的浊度（可用450nm波长下的吸光度来衡量）下降，故可用反应液在450nm波长下吸光度下降的速度来表示酶活性的经典方法。然后计算酶活力的单位：酶的活力单位数=A450nm/t0.001比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质8.酶含量的测定除福林酚法外，又一方法：蛋白含量的测定用考马斯亮蓝G-250法分析溶液中可溶性蛋白的含量。取50uL的样品液加进2.5mL的考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，放置5min后，在595nm波长下测定吸光度，并根据标准曲线计算出蛋白含量。（由标准曲线求得的回回方程为：酶样蛋白含量：b(mg/mL)=1.674A595nm-0.0354）【影响因素】 ：1.对酸性条件下通过热变性利等电点变性的方法去除卵蛋白提取溶菌酶的效果研究发现溶菌酶和卵蛋白之间存在相互结合作用，在加热以及调等电点的时候溶菌酶会随卵蛋白一起沉淀。加入磷酸盐缓冲液可以破坏溶菌酶和卵蛋白之间的结合作用，可以有效的提取溶菌酶。2.比较pH值7.5的磷酸盐缓冲液和碳酸氢钠缓冲液的处理效果，结果发明，碳酸氢钠缓冲液条件下100C下处理2min时可得到纯度40.8%的溶菌酶，而pH值7.5的磷酸盐缓冲液处理得到的溶菌酶纯度好于碳酸氢钠缓冲液可达到67.2%。3.离子交换法提纯溶菌酶的纯度和活性的研究表明，用D152型阳离子离子交换树脂提取溶菌酶时，洗脱溶菌酶的最佳洗脱液浓度为0.28mol/L；阳离子交换树脂和蛋清的饱和吸附比例为1:6.18；饱和吸附时间为80min；常温（2030C）的条件有利于溶菌酶的交换吸附。溶菌酶的得率为86.6%，活性为20000U/mg。4.利用分子量截留值为30000的超滤膜对经均质后的鸡蛋清进行超滤超滤压为0.1M可得到活性为18500/mg，得率为73.1%的溶菌酶。5.溶菌酶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制性实验结果得