蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析法.docx

蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析法法还能想起那些在荧屏中曾经震撼过我们，具有超能力的英雄么？蜘蛛侠，敏捷，灵活迅速飞流直下，忽闪直冲高楼；绿巨人浩克，力量，速度，耐力，在我们的想象力中膨胀；还有，我们随身携带星形盾牌，品格高尚的美国队长幻想里中的人物形象存在我们的记忆力，然而生物背景出身的我们，总归要锻炼出属于自己的实验技能，即便是相同的实验步骤，每个人做出来的结果也不尽相同，差别在哪？反复练习，用心总结出属于自己的心得，转化为自己的实验“超能力”吧。本文总结了蛋白纯化硫酸铵沉淀详细的实验原理、步骤，供大家参考。 -锻炼属于我们自己的实验“超能力”之一我是超级蜘蛛精看我有劲儿不？而我是一只冷静的科研小蜗牛冲啊，我是美国队长这次，我们所要分享的便是一种很常见，但是也很重要的蛋白质纯化方法：硫酸铵沉淀蛋白法，一起走进实验室吧。硫酸铵沉淀法是粗分离蛋白时常用的纯化和浓缩蛋白的技术。蛋白质的溶解度和盐浓度密切相关，在低浓度的条件下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度增加；但在高浓度的盐溶液里，盐离子竞争性的结合蛋白表面的水分子，破坏蛋白表面的水化膜，溶解度降低，蛋白质在疏水作用下聚集形成沉淀。每种蛋白质的溶解度不同，因此可以用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。硫酸铵的溶解度大，解离形成大量的NH4+、SO42-离子，会结合大量的水分子，使蛋白质的溶解度下降，另外，其温度系数小，不易使蛋白质变性，因此，蛋白质粗分离时硫酸铵沉淀法是很重要的一种技术，后续可采用层析技术进一步纯化蛋白，效率更高。硫酸铵沉淀法是常用的分离免疫球蛋白的方法。各种不同蛋白质盐析需要不同浓度的硫酸铵溶液。在实验中建议配置不同梯度浓度的硫酸铵溶液来确定蛋白质沉淀所需的最佳浓度。（1） 参照如下表格配置不同浓度的硫酸铵溶液；例如，在25 条件下，配置饱和度为100 %的硫酸铵溶液，称取767 g的硫酸铵固体，边搅拌边加入到1 L的蒸馏水中，完全溶解后，用氨水或者硫酸调节pH到7.0。（2） 沉淀蛋白将样品离心，去除沉淀，保留上清液并测量体积；一边搅拌一边慢慢的加入硫酸铵。接着，将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 h，或者4 ，搅拌过夜，使蛋白质充分沉淀。加入硫酸铵有两种方式，一种是直接加入硫酸铵固体，在操作上速度缓慢，不易太快，否则会造成蛋白变性；另一种方式是加入饱和的硫酸铵液体，但若需要较高浓度的硫酸铵溶液，需要加入较大体积的饱和硫酸铵溶液，在后续实验操作中，因蛋白质上清液和硫酸铵饱和溶液的体积之和过大，离心机无法离心，因此根据需要加入的硫酸铵饱和溶液的体积选择合适的方法。另外，每种蛋白质沉淀所需要的硫酸铵溶液的浓度也不同，因此在每次实验中应该做好观察记录，积累经验值。分享来自网上的一种简单的方法来估计蛋白沉淀所需要的硫酸铵溶液的浓度范围，供大家参考：将蛋白质溶液分成5份，每份分别加入硫酸铵至浓度分别为20%、30%、40%、50%、60%，离心，弃蛋白质沉淀，留取上清，再向上清液中加入硫酸铵，使得浓度从原先的20%升高到30%，30%的浓度升到40%，40%的浓度升为50%.，离心保留沉淀，分析沉淀中是否含有目的蛋白，以此确定沉淀目的蛋白所需要的最佳硫酸铵溶液的浓度。（3） 透析除去硫酸铵将蛋白质溶液离心沉淀，弃上清保留沉淀。加入10-20 ml的PBS-叠氮化钠溶液溶解蛋白质，叠氮化钠不于蛋白质反应，但能防止蛋白质变性。蛋白沉淀溶解之后，放入透析袋中透析24-48 h，每隔5 h更换透析液除去硫酸铵。收集透析液，离心，测