实验三革兰氏染色实验.ppt

实验三 革兰氏染色法 河南城建学院环境科学与工程实验中心 环境生物技术实验室 一 目的要求： 1、学习并初步掌握革兰氏染色法。 2、了解革兰氏染色法的原理极其在细菌分类 鉴定中的重要性。 二 基本原理： 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gran 创立的，基本步骤是： 1、初染：结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脱色：乙醇脱色 4、复染：番红复染 经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌 为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染 上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。 Gram stain of Gram -Gram stain of Gram + 实验原理：细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细 胞壁的成分和结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被 染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合 成结晶紫碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。当用 脱色剂处理时，革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成 的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细 胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低， 从而使结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内， 经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则 不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以 当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使 结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染 后，细胞被染上复染剂的红色。 Structure of a Gram-Negative Cell Wall Structure of a Gram-Positive Cell Wall 三、器材： 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，革兰氏染色液， 载玻片，显微镜等 四、操作步骤： 1、涂片：将大肠杆菌（24h）和金黄色葡萄球菌 （ 24h）分别涂片、干燥、固定。 2、染色： （1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，水洗 （3）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗 至刚刚无紫色为止，约2030秒，立即用水冲净乙醇 （4）复染：用番红液染1-2分钟，水洗 3、镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色 为准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 4、混合制片观察：一载玻片上两种菌混合制片，对 比观察。 步骤1：涂片 步骤2：干燥 步骤四 染色 步骤三 固定 crystal violet stain wash with water 结晶紫染色 水洗 Stain with grams iodine solution 碘液复染 Decolorize by adding 95% alcohol 95%酒精脱色 Counterstain with Safranin 沙黄复染 Results of stain 染色结果 五 注意事项 1）注意涂片不宜过。 2）火焰固定温度要适宜。 3）注意控制好脱色程度。 六、实验报告： 1、结果：列表简述2株细菌的染色观察结 果（形状、颜色、革兰氏染色反应）。 2、思考题： 1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓 厚？其染色成败的关键步骤是什么？ 2）当你对一