双重或多重免疫组化标记.ppt

第六章 双重或多重免疫组 化标记 (p111) 一、基本原理 双重或多重标记是利用免疫学和细胞 化学原理，在同一张切片上同时采用或先 后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物， 或采用不同直径大小颗粒胶体金来原位示 踪组织或细胞内不同抗原大分子物质的一 项标记染色技术。 由于此项技术可在同一张切片上同时 显示两种或两种以上不同抗原成分(定性、 定位、定量)，因而使组织内不同抗原成分 相互间功能关系的观察更加直观，操作需 遵循的原则和要求基本上与单标免疫组化 方法雷同，但差异是流程长，脱片机率更 高，前后重染色试剂间有交叉干扰等。 二、技术类型 （一）双重或多重免疫荧光标记染色 采用呈现不同颜色的荧光色素配伍， 分别标记不同的抗体，再通过各自与同一 切片上的相应抗原特异性结合而加以区别 显示所建立起来的双重或多重免疫组化染 色技术。 荧光素配伍：异硫氰酸荧光素(FITC） 翠绿色，常与罗丹明(RB200)或异硫 氰酸四甲基罗丹明（TRITC）配伍，后者 呈红色。 方法敏感、特异，需选用各自特定的 激发滤光片分别观察或二次曝光显影，样 本不能长期保存，组织结构背景不清晰。 技术类型有直接法和间接法之分。前 者特异、快速，后者敏感、多用。 所用抗体试剂可为异种动物抗体，也 可为同种动物抗体。 异种动物抗体常混合应用，操作步骤 少，脱片率相对较低。 同种动物抗体多分别应用，操作步骤 加倍，脱片机率相对较高，前后重免疫荧 光标记交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或 多聚甲醛蒸气处理。 操作举例：垂体腺瘤-ACTH与GH 双重免疫荧光标记染色（间接法） (1)石蜡切片，厚5 m，常规二甲苯脱 蜡，梯度酒精水化，入PBS(pH7.4, 0.01mol/L)。 (2)1人血清白蛋白（HAS）孵育10min （亦可用10正常羊血清代之），不洗 。 (3)抗ACTH血清（McAb）1:200，孵育 30min 37，湿盒。 (4)0.05mol/L TBS(pH7.4,内含1 Triten 100,下同)洗，10min3。 (5)羊抗鼠IgG-TRITC 1:100，湿盒，室温 避光反应1h。 (6)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗，10min3，( 第一重ACTH-TRITC标记染色已完成)。 (7)切片逐级酒精脱水，二甲苯透明，空气 干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭容 器内，放在80烤箱或温箱内以甲醛蒸气 固定24h，使第一重染色中二抗的抗原 结合部位失活。 (8)切片以TBS洗，5min4 (9)1 HSA（或10正羊血清）孵育 30min，室温，湿盒，不洗。 (10)抗GH血清(McAb) 1:400，孵育30min ，37，湿盒。 (11)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗，10min3 (12)羊抗鼠IgG-FITC 1:100,湿盒，室温避 光反应1h。 (13)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗，10min3 ( 第二重GH-FITC标记染色完成)。 (14)缓冲甘油封片。 (15)荧光显微镜下分别以546nm及490nm波 长的激发光观察切片组织内TRITC及 FITC所标示的ACTH及GH抗原（TRITC 阳性细胞呈红色，FITC阳性细胞呈绿色） 。 (16)用彩色底片对切片同一部位用 546nm及490nm波长激发光分别作两次 曝光，即可在同一张照片上显示不同颜 色标示的ACTH与GH两种抗原。 TRITC-GAM IgG 鼠抗人ACTH （IgG） TITC-GAM IgG 鼠抗人GH （IgG） T 游离Fab T T T F GH抗原 ACTH抗原 F Fab被灭活 图1 同种动物抗体间接法（分步固定）双重免疫荧光荧色原理 （二）双重或多重免疫酶标记染色 以酶催化不同底物呈现不同颜色产物 标示同一切片内两种或两种以上抗原为理 论基础所建立起来的多重免疫标记染色方 法。特点是光镜下可以同时观察和对比， 样品保存时间相对较长，一次曝光即可成 像，故较双重免疫荧光染色法更为常用。 常用标记酶与底物的配伍 单酶双底物-HRP-DAB(棕色):4CN(蓝色) AEC(红色):4CN(蓝色) AP-萘酚AS-MX-坚固红(fast red 红色)-坚固蓝(fast blue 蓝色) 双酶双底物-HRP(DAB):AP(萘酚AS.MX-坚固蓝) HRP(4CN):AP(萘酚AS.MX-坚固红 ) （直接法、间接法、桥法均可使用，灵敏度 以桥法中的复合物法最高，特异性则以直接 法最佳） 操作方法类同单酶标记，有直接法、 间接法、复合物法之分。 间接法与复合物法较常采用。 操作举例 淋巴瘤轻链、的双重 酶标记标记 （双酶双底物） (1)石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固定 液固定的组织则需用0.5%碘的乙醇溶液脱 汞5min，乙醇浓度为70，经自来水洗后 ，以2.5%硫代硫到钠浸洗1min，水洗)； (2)0.3% H2O2甲醇液浸泡切片30min,自来 水洗，蒸馏水洗,入PBS(0.01mol/L pH7.2); (3)滴加正羊血清1:10，湿盒，室温， 10min，不洗； (4)加一抗(抗人 PcAb与抗人McAb的混 合液)1:200，湿盒，37，45min或更长长； (5)PBS液，5min3 (6)加二抗(GARGGAMG混合液1:200)， 温盒，37，30min； (7)PBS洗，5min3; (8)加酶抗酶抗体复合物(兔PAP鼠APAAP 混合液1:100)，湿盒，37，30min； (9)PBS洗，5min3； (10)过氧化物酶显色反应：以DAB- H2O2 液显色 710min(镜下控制显色程度)， PBS洗，5min3； (11)硷性磷酸酶显色反应：以萘酚AS.MX 及坚固蓝(fast blue)显色1015min(镜下控 制显色程度)，PBS洗、自来水洗； (12)缓冲甘油封片，光镜下观察 P PPA A A 图2 双酶双底物(复合物法)双重酶标染色原理 兔PAP GAR IgG 兔抗K Ag 鼠APAAP GAM. IgG 鼠抗人 注：若用同种动物抗血清分别进行标记染色时 ，尚需考虑在前后重染色之间是否设置“多聚 甲醛蒸气处理2-4h（封闭固定）或用pH2.2的 甘氨酸-盐酸溶液处理2h（酸洗脱）的操作步 骤”，目的为了避免前后重免疫试剂间的交叉 反应。可视预实验结果来确定。 （三）双重及多重免疫金标记(电镜） 电镜下的双重免疫标记染色不是靠 颜色区分，而是靠标记物的不同电子密 度或颗粒的不同大小来区别不同抗原， 有别于光镜下的双重免疫标记方法。 常用的方法多为双重免疫金标记 优点：高电子密度，分辨率高，抗原定 位精确，颗粒大小可人工控制， 标记试剂易制备。 缺点：试剂质量要求高，非特异吸附干扰 大(背景) 类型有直接法、间接法（异种动物抗 体或同种动物抗体）-双面染色，分步固 定。标记用的胶体金颗粒，直径多采用 5nm, 15nm组合，标记不同类别抗体(特异 性一抗-直接法，间接抗体-间接法)。 应用直接法进行多标，简便、快速、 准确、效果佳，尤多用于细胞表面抗原的 双重或多重标记。 缺点：敏感性较低，金标抗体纯度要求高 。 金标抗体双重抗原标记常用间接法显 示，且多采用异种动物抗体混合同步操作 。 优点：敏感性提高，操作步骤减少 缺点：标记二抗质量要求高，背景染色深 。 可通过采用固相吸附或过量二抗封闭 ，或用多聚甲醛蒸气处理，使二抗的游离 抗原结合部位（Fab段）灭活加以克服。 *举例：垂体组织生长激素(GH)和促肾 上腺皮质激素(ACTH)双重免疫电镜染色( 间接法)-分步固定。 (1)取新鲜垂体腺瘤组织1mm3，蒸馏水洗 ，不经饿酸固定，常规酒精脱水，用 Lowicryl k4M包埋，超薄切片厚40nm，置 无支持膜的镍网上； (2)以0.05mol/L TBS(pH7.4含1Triton X-100，下同)，浸洗5min； (3)加入1HSA 5min；不洗； (4)以兔抗ACTH血清(1:200)孵育，4 ，20h，室温下2h，TBS洗，用上述一抗 重复孵育1次，TBS喷射冲洗，然后浸洗 10min，3次，TBS (pH8.2)浸洗5min； (5)0.02mol/L TBS (pH8.2)浸洗5min； (6)1 HSA孵育5min，不洗；再以5nm 胶体金标记的羊抗兔，IgG孵育10min； 0.02mol/L TBS (pH8.2)喷射冲洗， 0.05mol/L TBS (pH7.4)冲洗及浸洗，时间 同前； (7)蒸馏水浸洗后，空气中干燥； (8)置盛有多聚甲醛粉末的密闭容器内 ，80温箱中以多聚甲醛蒸气处理1h， 冷却取出，入蒸馏水，换洗2次。 (9)再按(4)-(8)步骤作第二重抗原染色 ，这次一抗用鼠抗GH单克隆抗体(1:400) ；二抗用15nm胶体金标记的羊抗鼠IgG， 在二抗孵育并清洗后，入2的戊二醛及3 多聚甲醛的TBS (pH7.4)溶液中固定 30min，经蒸馏水换洗3次，再以1醋酸 铀和构橼酸铅作常规电子密度的染色。 (10)电镜观察 结果：见ACTH细胞和GH细胞的分泌 颗粒分别被5nm和15nm的胶体金颗粒所显 示，除很少量背景染色外，标记位置精确 ，无交叉重叠与弥散现象。 （四）其它双重标记法 1.免疫荧光法与免疫酶法联合应用(先酶标 后荧光) ； 2.免疫荧光法与免疫金银法联合应用(先免 疫金银标记后荧光标记) ； 3.免疫酶法与免疫金法联合应用(20nm,红 色），此法忌用银液放大，易吸附干扰 ； 4.免疫金银法与免疫酶法联合应用(对比明 显)。 三、注意事项 1.标记染色的顺序确定需视组织标记抗原 的性质，量少、脆弱先标记，量多、耐受 后标记。 2.结构保存与抗原保护并重，电镜样品一 般忌用