《髓过氧化物酶》word版.doc

髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)又称过氧化物酶，是一种重要的含铁溶酶体，存在于髓系细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)的嗜苯胺蓝颗粒中，是髓细胞的特异性标志，随着对MPO研究的深入，人们发现MPO基因多态性导致个体对一些疾病易感性的差异，与人类多种疾病的发生、发展密切相关，因此越来越受到国内外学者的重视。 髓过氧化物酶MPO研究1.MPO的结构髓过氧化物酶(MPO)是由中性粒细胞、单核细胞和某些组织的巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶，是血红素过氧化物酶超家族成员之一。MPO是I相代谢酶。每个酶分子有两个铁素基团，顺磁共振波谱表明血红素中的铁是在甲酰基血红素部分。MPO的合成是粒细胞进入循环之前在骨髓内合成并贮存于嗜天青颗粒内，外界刺激可导致中性粒细胞聚集，释放髓过氧化物酶(MPO)。在成熟的粒细胞中，MPO是含量最丰富的糖蛋白，约占外周血多形核中性粒细胞(PMNs)内总蛋白质含量的5%，血液中95%的MPO来源于PMNs。MPO的相对分子质量为150103，是由2个亚单位聚合而成的二聚体，每个亚单位又由一条重链(链,相对分子质量约60103)和一条轻链(链,相对分子质量约15103)所构成。2个亚单位在链处由1个二硫键相连。重链具有亚铁卟啉基团，说明MPO是铁依赖性的。MPO以3种亚形存在于髓系细胞中，分别为MPO、。3种亚型主要是重链有差异，轻链的差异较小，导致它们在相对分子质量及疏水性等方面不同，3种亚型在功能上的差异还不明确，有待进一步研究。 2.MPO基因及其多态性人髓过氧化物酶基因位于染色体17q23?q24，含有12个外显子和11个内含子，长约14 638 bp，调控其基因表达的是生长因子。MPO的mRNA在早幼粒细胞的表达水平最高，其次是原始粒细胞、幼稚和原始单核细胞；当细胞分化到成熟时期，MPO基因表达水平迅速下降。现已知MPO基因首先表达的是一条相对分子质量为89103的前体蛋白(precursor protein)，经过翻译后加工，切割成和两种亚基，再聚合为成熟的MPO分子，加上糖链，最后形成有功能的MPO。MPO在基因表达过程中存在的缺陷，造成MPO基因DNA序列发生改变，影响其活力。MPO基因的多态性影响其基因的转录和表达，对机体的疾病易感性有一定的影响。Chevrier 等发现了外显子11处和启动子区域的V53F、A332V、I642L和IVS11? 2AC4个新的基因多态性位点，它们的作用与功能需要进一步研究。Piedrafita 等研究发现与疾病有关的位点有5个：463G/A，R569W，Y173C，M251T和外显子9的碱基缺失。目前研究最多的是MPO基因启动子区第463位核苷酸G/A的突变，该位点位于SP1转录因子识别结合的顺式作用元件中，内含4个Alu重复序列。G/A的突变导致位于Alu反应元件的SP1转录因子结合位点消失，从而使MPO转录水平显著下降。也有报道发现外显子10的密码子569存在C被T替代，使CGGTGG，导致遗传性MPO缺陷性疾病。还有研究报道在MPO基因129位点存在G被A取代，使MPO基因的表达水平显著降低。另外，据有关文献报道，MPO基因463A等位基因与一些癌症的风险降低相关。 3.MPO的生物学作用MPO是中性粒细胞的功能标志和激活标志，其水平及活性变化代表着嗜中性多形核白细胞(PMN)的功能和活性状态。纯化的人MPO活性为2535 IU/mg，水溶性好，底物H2O2浓度0.8 mmol时酶受抑制，酶反应最佳pH为4.55.5，当pH10，或2时酶失活。MPO的主要功能是在吞噬细胞内杀灭微生物，利用过氧化氢和氯离子产生次氯酸盐，并形成具有氧化能力的自由基。构成MPOH2O2卤素系统。许多研究发现，MPO不仅能杀灭吞噬于细胞内的微生物，而且可释放到细胞外，破坏多种靶物质，如肿瘤细胞、血小板、NK细胞、原虫、毒素等，对机体产生和调节炎症反应等多方面发挥作用。然而，在特定条件下，MPO催化反应生成过量的氧化剂(HOCl、3氯化酪氨酸、酪氨酰基、硝基酪氨酸等)，超过局部抗氧化剂的防御反应时，就会导致氧化应激和氧化性组织损伤。MPO还参与调节炎症反应的许多过程，MPO缺陷的中性粒细胞因过量的注入炎症部位而发生氧化反应，大量的超氧化物和氧化物形成，造成炎症部位组织细胞损伤。此外还有学者发现MPO能与DNA牢固结合形成复合物，有效保护DNA防止其在氧化过程中受损，从而保证髓系细胞的正常分化成熟及功能。 编辑本段髓过氧化物酶(MPO)与相关疾病1.MPO与心血管疾病1.1MPO与冠状动脉疾病。冠心病是心血管系统中最常见的疾病，而动脉粥样硬化(AS)又是形成冠心病的重要病理基础。AS发病过程中通常出现氧化低密度脂蛋白，进而巨噬细胞吞噬脂质变成泡沫细胞，泡沫细胞的形成在AS的发生机制中起关键作用。研究发现MPO有促进AS病变形成的作用，MPO通过产生自由基和多种反应性物质，促进斑块形成和不稳定性增加，加速AS进展，进而引起多种并发症如急性冠脉综合征(ACS)。研究发现，MPO缺陷的个体罹患心血管疾病的危险性明显下降。MPO水平的升高不仅与患冠状动脉疾病易感性相关，还可以预测早期患心肌梗死的危险性。 1.2MPO与急性冠脉综合征(ACS).MPO促进ACS病变形成，并影响粥样斑块的稳定性，通过增大氧化应激而引起ACS。目前的研究表明，MPO是预测ACS患者发生不良心血管事件的一个新的预测因子，特别是在肌钙蛋白T(TnT)水平较低的患者，MPO能够识别那些将来发生心血管事件危险性较高的患者。 2.MPO与肿瘤2.1MPO与肺癌在肺部受微生物侵袭、职业暴露以及吸烟时，MPO会随中性粒细胞的聚集释放到炎症部位。MPO可代谢激活多种与肺癌有关的环境致癌物，能将前致癌物如多环芳烃类的苯并芘(BaP)转化成具有高度反应性和致癌性的活性产物二醇环氧化苯并芘(BPDE)，BPDE能与DNA形成加合物并导致姐妹染色体互换，从而导致肺癌。 2.2MPO与白血病白血病是累及造血干细胞的造血系统恶性肿瘤，其病因尚不完全清楚。 3.MPO与地方性砷中毒3.1近年来，随着分子生物学领域的不断发展，发现MPO在砷中毒所致皮肤病变的发生发展中起着重要作用。MPO目前被研究者认为可能是砷中毒新发现的一种易感标志物，将在慢性砷中毒的早期诊断和危险评估中具有重要的意义，但国内就这方面的研究还没有涉及到，国外对其深入的影响机制的研究也不是很多，因此还很难在现有的研究基础上建立起砷中毒易感性与MPO及其多态性的明确关系，还需要进一步的研究证实。 4.MPO与其他疾病4.1MPO在现阶段的研究也确定了它在疾病早期诊断与危险评估中具有重要的意义。MPO通过不同的途径可导致某些疾病，同时其基因多态性也会降低机体对某些疾病的易感受性，从而对机体产生保护作用，但其作用机制仍不清楚，随着分子生物学领域的不断发展，MPO的作用机制研究将不断深入，可能会发现其他一些与疾病易感性有关的多态性位点，从而使人们更清楚的认识其相关疾病的发生、发展，以便对这些人群采取有效的预防和治疗措施髓过氧化物酶myeloperoxidase 过氧化物酶含血红素辅基,主要存在于过氧化酶体,利用H2O2以氧化酚类及胺类化合物。.动物的肝、肾中只有微弱的活性，在牛乳中已分离出过氧化物酶，在白细胞中含有髓性过氧化物酶，这就是脓具有过氧化物酶活性的原因。红细胞也含过氧化物酶，极少量 . 更多解释 与髓过氧化物酶相关的文献前10条 更多文献 1. 髓过氧化物酶在急性冠状动脉综合征患者近期预后判断中的作用目的探讨血浆髓过氧化物酶水平对急性冠状动脉综合征患者近期心脏事件的预测作用。方法采用酶联免疫吸附法分别测定急性冠状动脉综合征组、稳定型心绞痛组和非冠心病组患者的血浆髓过氧化物酶浓 . 详情 中国动脉硬化杂志 2006年08期 内科学; 血浆髓过氧化物酶; 急性冠状动脉综合征; 中性粒细胞; 酶联免疫吸附法; 冠状动脉造影; 预后; 下载下载2. 非糖尿病维持性血液透析患者髓过氧化物酶与颈动脉硬化的相关性目的探讨非糖尿病维持性血液透析患者髓过氧化物酶与颈动脉硬化相关指标的关系。方法酶联免疫吸附法测定非糖尿病维持性血液透析患者同一次透析前后血浆髓过氧化物酶和血清弹性蛋白酶水平变化, . 详情 中国动脉硬化杂志 2011年11期 维持性血液透析; 髓过氧化物酶; 颈动脉粥样硬化; 下载下载3. 巨噬细胞髓过氧化物酶与低密度脂蛋白氧化关系的研究目的从低密度脂蛋白 (L DL)诱导巨噬细胞髓过氧化物酶活性升高的角度探讨体内 L DL 氧化的可能机制 ,为动脉粥样硬化 (AS)的抗氧化治疗提供新的思路。方法以体外培养的大鼠 . 详情 免疫学杂志 2001年01期 巨噬细胞; 髓过氧化物酶; 低密度脂蛋白; 牛磺酸; 下载下载4. 探讨颈动脉粥样斑块超声造影显像特征及血浆髓过氧化物酶水平与脑梗死的关系目的探讨颈动脉斑块实时超声造影的显像特征及血浆髓过氧化物酶水平对脑梗死事件的预测作用。方法对73例颈动脉硬化患者的89处斑块进行超声造影检查,观察斑块的显像特点。将他们分为斑块造 . 详情 中国超声医学杂志 2008年08期 超声检查; 造影剂; 颈动脉硬化; 血浆髓过氧化物酶; 脑梗死; 下载下载5. 光化学法诱导小鼠局灶性脑梗死肿瘤坏死因子表达及髓过氧化物酶活性的变化目的:分析光化学法诱导小鼠局灶性脑梗死模型脑组织肿瘤坏死因子表达和髓过氧化物酶活性的变化规律及其相关性。方法:实验于2004-07/2005-07在泰山医学院脑微循环实验室完成 . 详情 中国临床康复 2006年40期 脑梗塞; 光化学; 肿瘤坏死因子; 过氧化物酶; 下载下载6. 冠状动脉病变与2型糖尿病及髓过氧化物酶关系的探讨目的:探讨冠状动脉病变与2型糖尿病和髓过氧化酶的关系。方法:对2006年9月至2007年9月在我院就诊的210例胸痛临床怀疑患冠心病的患者进行冠状动脉造影,将其中冠状动脉狭窄大于 . 详情 泸州医学院学报 2008年04期 冠状动脉疾病; 2型糖尿病; 髓过氧化物酶; 冠状血管造影术; 下载下载7. 唾液过氧化物酶正 过氧化物酶具有多种生理功能,无论在细胞代谢调节还是在防御方面催化许多重要反应,是重要的细胞氧化还原体系.1944年Dempsey首先在甲状腺中发现甲状腺过氧化物酶(TPO). . 详情 生命的化学(中国生物化学会通讯) 1987年06期 下载下载8. 胱抑素C与髓过氧化物酶在冠心病严重程度评估中的应用目的研究分析冠心病病变程度与白细胞计数、超敏C反应蛋白(CRP)、纤维蛋白原(FG)、髓过氧化物酶、胱抑素C、肌酐(Scr)、肾小球滤过率(eGFR)之间的关系。方法收集121例 . 详情 检验医学与临床 2010年07期 急性冠脉综合症; 稳定性心绞痛; 胱抑素C; 超敏CRP; 纤维蛋白原; 髓过氧化物酶; 下载下载9. 联合测定免疫球蛋白M和髓过氧化物酶对新生儿细菌感染的早期诊断意义目的探讨血清免疫球蛋白(immunoglobin,Ig)M和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)联合测定对新生儿细菌感染的早期诊断意义。方法随机选择2007年7 . 详情 中华妇幼临床医学杂志 2009年06期 免疫球蛋白M; 髓过氧化物酶; 细菌感染; 新生儿; 下载下载10. 髓过氧化物酶基因G-463A多态性与肺癌易感性关系的meta分析背景与目的关于髓过氧化物酶基因G-463A多态性与肺癌易感性关系已有广泛研究,但研究结果不一致。本研究利用meta分析的方法探讨髓过氧化物酶基因G-463A多态性与肺癌易感性的相 . 详情 中国肺癌杂志 2010年02期 肺肿瘤; 髓过氧化物酶; 多态性; meta分析;人髓过氧化物酶(MPO)ELISA 检测试剂盒本试剂仅供研究使用 试验原理：MPO试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知MPO浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将MPO物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中MPO的活性浓度呈比例关系。试剂盒内容及其配制试剂盒成份（2-8保存）96孔配置48孔配置配制96/48份酶标板1块板（96T）半块板（48T）即用型塑料膜板盖1块半块即用型标准品：400ng/ml1瓶（0.6ml）1瓶（0.3ml）按说明书进行稀稀空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）即用型标准品稀释缓冲液1瓶（5ml）1瓶（2.5ml）即用型生物素标记的MPO抗体1瓶（6ml）1瓶（3.0ml）即用型亲和链酶素-HRP1瓶（10ml）1瓶（5.0ml）即用型洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）按说明书进行稀释底物A1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型底物B1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型自备材料1 蒸馏水。2 加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。3 振荡器及磁力搅拌器等。安全性1 避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。2 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。3 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。操作注意事项1 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。2 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。3 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。4 使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。5 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。6 洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。7 底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。8 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。9 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。样品收集、处理及保存方法1、 血清-操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。2、 血浆-EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000g离心30分钟去除颗粒。3、 细胞上清液-1000g离心10分钟去除颗粒和聚合物。4、 保存-如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。试剂的准备1 标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：400ng/ml（6号标准品）原倍浓度不用稀释直接加入50ul。200ng/ml（5号标准品）100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液100ng/ml（4号标准品）100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液50ng/ml（3号标准品）100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液25ng/ml（2号标准品）100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液12.5ng/ml（1号标准品）100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液0ng/ml（空白对照）原始浓度不用稀释直接加入50ul。2 洗涤缓冲液（50）的稀释：蒸馏水50倍稀释。操作步骤1 使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。2 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。3 加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37温育1小时。4 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。5 每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37温育30分钟。6 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。7 每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37温育10分钟。避免光照。8 取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。9 在450nm波长处测定各孔的OD值。性能1. 灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。2. 特异性：不与人其它细胞因子反应。3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。4.局限性：6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。结果 判 断 与 分 析1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的MPO标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的MPO含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。3、检测值范围：0-400ng/ml4、敏感度： 1.0ng/ml品型号：96T/48T产品名称：人髓过氧化物酶(MPO)ELISA说明书产品报价：产品特点：人髓过氧化物酶(MPO)ELISA价格公道、品质保证，售后服务完整，并提供免费代检测服务！本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中髓过氧化物酶(MPO)的活性。96T/48T人髓过氧化物酶(MPO)ELISA说明书的详细资料：人髓过氧化物酶(MPO)ELISA说明书目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中髓过氧化物酶(MPO)的活性。注意事项：1 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值)，请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数(n5)。5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6 底物请避光保存。7 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9 本试剂不同批号组分不得混用。10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人髓过氧化物酶(MPO)水平。用纯化的人髓过氧化物酶(MPO)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入髓过氧化物酶(MPO)，再与HRP标记的羊抗人抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的髓过氧化物酶(MPO)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中人髓过氧化物酶(MPO)的浓度。试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片(48)2片(96)密封袋1个1个酶标包被板1481962-8保存标准品：900U/L0.5ml1瓶0.5ml1瓶2-8保存标准品稀释液1.5ml1瓶1.5ml1瓶2-8保存酶标试剂3 ml1瓶6 ml1瓶2-8保存样品稀释液3 ml1瓶6 ml1瓶2-8保存显色剂A液3 ml1瓶6 ml1瓶2-8保存显色剂B液3 ml1瓶6 ml1瓶2-8保存终止液3ml1瓶6ml1瓶2-8保存浓缩洗涤液(20ml20倍)1瓶(20ml30倍)1瓶2-8保存样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8的温度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20保存，但应避免反复冻融.7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。操作步骤1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50l，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100l分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50l，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50l弃掉，再各取50l分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50l分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50l，混匀后从第七、第八孔中分别取50l加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l弃掉。(稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为600U/L，400 U/L ，200 U/L，100 U/L，50 U/L)。2. 加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3. 温育：用封板膜封板后置37温育30分钟。4. 配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶标试剂50l，空白孔除外。7. 温育：操作同3。8. 洗涤：操作同5。9. 显色：每孔先加入显色剂A50l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀，37避光显色15分钟. 10. 终止：每孔加终止液50l，终止反应(此时蓝色立转黄色)。11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标， 在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释 倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值 代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释 倍数，即为样品的实际浓度。试剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。2.批内与批间应分别小于9%和15% 保存条件及有效期：1.试剂盒保存：2-8。2有效期：6个月人髓过氧化物酶（MPO）酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 检测范围：7.8 ng/ml - 500 ng/ml 最低检测限：1.95 ng/ml 特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的人MPO，且与其他相关蛋白无交叉反应。 有效期：6个月 预期应用：ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中MPO含量。 说明 1试剂盒保存：-20（较长时间不用时）；2-8（频繁使用时）。 2浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 3中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 4刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。 实验原理 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗MPO抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗MPO抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的MPO呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板（Assay plate ）：一块（96孔）。 2. 标准品（Standard）：2瓶（冻干品）。 3. 样品稀释液（Sample Diluent）：120ml/瓶。 4. 生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：110ml/瓶。 5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 （HRP-avidin Diluent）：110ml/瓶。 6. 生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1120l/瓶（1：100） 7. 辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1120l/瓶（1：100） 8. 底物溶液（TMB Substrate）：110ml/瓶。 9. 浓洗涤液（Wash Buffer）：120ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10. 终止液（Stop Solution）：110ml/瓶（2N H2SO4）。 需要而未提供的试剂和器材 1. 标准规格酶标仪 2. 高速离心机 3. 电热恒温培养箱 4. 干净的试管和Eppendof管 5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器 6. 蒸馏水，容量瓶等 标本的采集及保存 1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。 2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8C 1000 g离心15分钟，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。 3. 细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 标本的稀释原则： 首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。 标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为500 ng/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释500 ng/ml，250 ng/ml，125 ng/ml，62.5 ng/ml，31.2 ng/ml，15.6 ng/ml，7.8 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。 如配制250 ng/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）500 ng/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 生物素标记抗体的稀释原则： 临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100l），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10l生物素标记抗体加990l生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则： 临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100l），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10l辣根过氧化物酶标记亲和素加990l辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 操作步骤 实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。 1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100l，余孔分别加标准品或待测样品100l，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37反应120分钟。 为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。 2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液