番茄黄化曲叶病毒.doc

番茄黄化曲叶病毒 一、危害症状 番茄黄化曲叶病毒病( TYLCV)，或“番茄黄化卷叶病毒”，Toamtos Yellows Leaf Curl Virus 简称TYLCV或TY，一种植物单链DNA病毒，该病在番茄花期、结果期、采收期各阶段均可发生。番茄植株感染病毒后，初期主要表现生长迟缓或停滞，生长点黄化，节间变短，植株明显矮化，叶片变小变厚，叶质脆硬，叶片有褶皱、向上卷曲，叶片边缘至叶脉区域黄化，以植株上部叶片症状典型，下部老叶症状不明显；后期表现坐果少，果实变小，膨大速度慢，成熟期的果实不能正常转色。番茄植株感染病毒后，尤其是在开花前感染病毒，果实产量和商品价值均大幅度下降。严重时造成的损失可达100%，是严重危害番茄生产的病害之一。因此抗病毒病育种成为消除番茄黄化曲叶病毒病威胁的主要策略。目前国内对番茄黄化曲叶病毒病的品种抗( 耐) 性选育研究还甚少，导致很多种植户与农户由于得不到抗病的优良品种，只能少种植，甚至改种其他蔬菜品种。为此，国内一些科研院、所和种子生产企业及农业技术推广部门加强与国内外企业、院校合作和交流，在抗病品种培育和推广上开展了大量工作，目前优良品种的筛选工作正在进行，以TY病毒重灾区山东省为例，区域内寿光、临淄、广饶、莘县等蔬菜主产区纷纷成为国内外种子企业、院校试验TY的前沿基地。以“蔬菜之乡”-寿光为例，数十家国外知名种子公司，如：瑞士先正达、以色列海泽拉、荷兰瑞克斯旺、荷兰德澳特等陆续推出了抗TY病毒的番茄品种。 二、发病规律 番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属病毒，寄主为戟叶鹅绒藤、曼陀罗、兵豆、番茄、醋栗番茄、烟草、菜豆、苦苣菜等植物。烟粉虱（B型）是番茄黄化曲叶病毒病的主要传毒介体，烟粉虱获毒后可终生传毒，但不经卵传播。机械摩擦和种子不传毒，嫁接可导致病毒传播。三、危害特点椐报道，番茄黄化曲叶病毒病起源于中东地区和地中海盆地，主要分布在地中海西部、日本、美国东南部和加勒比海地区，是一种热带、亚热带地区最具毁灭性的番茄病毒病。2002年传入我国，在云南、广东、广西、上海、浙江、江苏、河南、山东等地危害严重，一般减产50%以上,严重者番茄几乎绝收。与其它病毒病相比较而言，番茄黄化曲叶病毒具有爆发突然、扩展迅速、危害性强、无法治疗的特点，是一种毁灭性的番茄病害，发病后没有很好的药剂防治。但是，由于该病毒病主要依靠烟粉虱带毒传播，防治烟粉虱可以有效防止该病毒的扩散、蔓延和危害成灾。 在我国，该病呈现明显的由南向北迅速发展的态势，而种植者缺乏对此病害的认知和辨别能力。2005年秋季，番茄黄化曲叶病毒病在江苏省的江都、无锡番茄产区初现，并在江都的部分田块造成毁灭性危害，以后逐步扩展蔓延，危害日益严重。2007年秋冬季节，河南省大棚番茄大面积发病，特别是扶沟县、开封县、中牟县病害发生严重，发现面积4万余亩，造成3万多亩大棚番茄毁掉，未被毁掉的减产也在3080，且番茄品质严重下降。2007年该病传到山东，在聊城零星发生，2008年在聊城、济宁、淄博、菏泽、青岛、枣庄等地爆发，发病地块多数绝产。2008年秋季传入濮阳，发病地块多数提早拉秧，甚至绝收。四、防治番茄黄化曲叶病毒病的措施根据该病毒的发生规律，防治上主要有两大措施：一是选种抗病毒品种；二是防治传毒媒介昆虫烟粉虱。由于该病毒属于双生病毒，存在基因重组现象，病毒变异频率高，世界各地的番茄黄化曲叶病毒病虽然名称一样，但是病毒的基因组成相差很大，因此一个地区的抗病品种引进到另一个地区种植不一定抗病，需要重新选育抗病品种。鉴于目前生产上还没有抗病品种可供选用的现状，采取措施防治好烟粉虱是控制病害为害和蔓延的关键，可以采取综合措施，减少毒源，控制烟粉虱发生危害，从烟粉虱零星发生时开始防治。具体措施：1.培育无病无虫苗是关键。该病对番茄植株侵害越早，发病率越高，所以预防要从育苗期抓起，做到早防早控，力争少发病或不发病。苗床周围杂草要除干净，苗床土壤要进行消毒处理，以减少病源。用基因活化剂浸种。苗床用蔬菜移栽灌根灵3000倍液喷后整地，并使用4060目防虫网覆盖。在苗期喷施12次番茄黄化曲叶病毒灵预防。2.重防烟粉虱。番茄黄化曲叶病毒病由烟粉虱传播。烟粉虱有迁飞性，应加强整枝打杈和化学防治等田间统一管理，减少相临田块之间的烟粉虱迁飞，每隔710天统一用药剂防治1次烟粉虱，药剂可选用吡虫啉、啶虫脒、扑虱灵、灭螨猛乳油等，也可用虱介宁加乐丹，并注意轮换使用，或用蚜虱一冲净冲施。3.农业措施。在栽培上适当控制氮肥用量和保持田间湿润。施肥灌水做到少量多次，做到不旱不涝，适时放风，避免棚内高温，调节好田间温湿度，增施有机肥，促进植株生长健壮，提高植株的抗病能力，生长期可用蔬菜移栽灌根灵冲施或灌根，结合番茄黄化曲叶病毒灵，提高植株的免疫力，及时清除田间杂草和残枝落叶，以减少虫源。大棚风口用4060目防虫网隔离，配合田间吊黄板预防烟粉虱。4.接种疫苗。番茄育苗期采用黄化曲叶病毒疫苗接种防疫是最经济有效的方法。黄化曲叶病毒疫苗：黄化曲叶病毒疫苗又叫黄化曲叶病毒裂解疫苗。产品的主要成分是用黄化曲叶病毒当前流行株(疫苗病毒株)接种，经病毒培养、病毒液收获、病毒灭活、病毒纯化、病毒裂解等工序配制而成，用于植物预防黄化曲叶病毒感染。应用范围：该疫苗可用于番茄、茄子、辣椒、黄瓜、西瓜、甜瓜、烟草、西葫芦等接种防疫。接种本疫苗后，可刺激机体产生抗黄化曲叶病毒的免疫力，用于黄化曲叶病毒病的预防，同时对花叶病毒、小叶病毒、蕨叶病毒、条斑病毒均有效。5.灌根喷雾相结合防治番茄黄化曲叶病毒病。防治番茄黄化曲叶病毒病可采用蔬菜移栽灌根灵灌根和用黄化曲叶病毒灵叶面喷雾相结合的方法，可有效控制病毒病发生、传播和流行。灌根防治：番茄定植时用蔬菜移栽灌根灵3000倍液灌根，1亩地用500毫升药剂，对水10001500公斤，每株灌稀释好的药液0.5公斤。也可随水冲施，每亩用药剂1000毫升。喷雾防治：应用黄化曲叶病毒灵在番茄分苗、定植、绑蔓、打杈前先喷1次番茄黄化曲叶病毒灵可预防接触传染。在定植前后各喷1次番茄黄化曲叶病毒灵600倍液，能增强番茄耐病性。在发病初期(56叶期)开始用番茄黄化曲叶病毒灵600倍液进行叶面喷雾，每隔4天1次，连续喷45次。在治疗期间停止用其他农药、叶面肥、生长素及控旺药物。小苗从34片叶开始预防，一周预防一次；定植返苗后再用药，没发病时预防710天1次，初发病时34天1次，喷34次。一般用药当天会发生叶片卷曲，属正常现象，12天自然恢复，一般浇水后的34天用药最好，12次用药可控制病害扩散，34次用药初发病株可恢复，对生长点已经停止生长的就没有治疗意义了。如果已经发病必须和蔬菜移栽灌根灵同时使用，效果快，恢复好。采用“50目防虫网覆盖+黄板预警+适时喷药”技术进行番茄育苗，番茄出苗整齐，幼苗生长正常。而且隔离烟粉虱效果好，平均百株幼苗烟粉虱成虫12头，而常规露地育苗平均百株幼苗烟粉虱成虫410头，苗期减少喷药次数45次。采用50目防虫网全程覆盖栽培番茄黄化曲叶病毒病病株率在0.9%2.8%之间，防控效果达90%以上，每667 m2可挽回经济损失6 329.5元。20072009年在温州苍南、瑞安、瓯海等地番茄生产基地应用防虫网覆盖防控番茄黄化曲叶病毒病，推广面积逾330 hm2。建议各地在应用防虫网覆盖番茄隔离育苗栽培时，要充分考虑当地气候条件、栽培习惯和品种特性，选择合适防虫网目数和配套技术措施进行。在温州地区开始推广防虫网覆盖栽培技术时，当地农民认为防虫网覆盖投入大，管理麻烦，推广速度较慢，但通过系列技术培训和生产上重点受灾户的示范宣传，菜农逐渐接受并推广应用，20072009年在温州苍南、瑞安、龙湾、瓯海等番茄生产基地推广番茄防虫网覆盖隔离栽培技术，面积逾330 hm2，有效地解决了温州地区番茄黄化曲叶病毒病重点灾区的防控难题，受到农民的普遍欢迎（许方程2010）。抗原收集筛选鉴定植物病毒的鉴定主要根据病毒侵染鉴别寄主后的特征性症状(生物学实验)、高度放大后病毒的形态和大小(电子显微镜技术)、病毒抗原和专化性抗体的待异性结合(血清学技术)和病毒核酸与同源探针的碱基互补性(核酸杂交技术)等，有些病毒的物理化学特性也用来区分病毒的不同。疑难病毒的鉴定通常要组合应用多种技术，新病毒的鉴定需要分子生物学的资料。 嫁接法可以作为番茄黄化曲叶病毒病的接种鉴定方法。欧美地区的发达国家及日本等都已有很好的抗TYLCV番茄品种在生产上推广应用，我国尚无自主知识产权的抗病品种大量应用，对番茄黄化曲叶病毒病缺乏直接有效的防治措施。TYLCV病毒由烟粉虱(Bemisia tabaci)和嫁接传播，目前对番茄黄化曲叶病毒病的接种鉴定方法研究多集中于烟粉虱接种法，对嫁接接种法研究较少。目前抗番茄黄化曲叶病毒（TY）的番茄品种近两年番茄黄化曲叶病毒病（TYLCV）在我国连续暴发，给番茄生产带来了极大风险。由于病害易于暴发与流行，加之防治难度大，选择抗病品种就成为防治病害的根本性措施之一。目前，国内外不少种子公司积极开展抗病品种的研发工作，有些品种已在生产上推广应用，有些品种还处于试验、示范阶段。海泽拉抗TY的番茄品种以色列海泽拉优质种子公司（Hazera GeneticsLTD）的研发部门很多年前就已经对TY病毒进行了专门研究，并培育了一系列抗TY的番茄品种。由于公司一直关注TY病毒的发展动向，所以在国内许多的番茄种植区域提前安排了具有TY抗性的番茄品种进行试验、示范。从调查的结果看来，抗TY的番茄品种表现突出，为种植户挽回了不少损失。适合保护地种植的抗TY的番茄品种有飞天、光辉、阿库拉、忠诚等。20072009年，以上品种已在山东、辽宁、赤峰、山西、宁夏等省区的多个地区进行了示范，示范面积约33.3 hm2。飞天（中型果）：无限生长型，早熟品种。植株长势中等，节间较短，高温和低温条件下坐果性能好，不易空穗；果实扁球形，大小均匀、整齐，颜色鲜红，着色均匀，硬度好，货架期特长，平均单果质量150220 g；高温季节不裂果，无皲裂、老年斑点及青皮现象。抗TY、黄萎病（V）、枯萎病1、2号（F1、F2）及烟草花叶病毒（TMV）。适合春季、越夏和秋冬茬栽培。20072008年该品种在辽宁西部、赤峰地区及山东等地的冬春茬、越夏茬、秋冬茬均表现十分稳定和优秀。光辉（大型果）：无限生长型，中熟品种。植株长势强。大果，单果质量200300 g，国内实际种植更大。果实球形，大红色，硬度好。抗TY、黄萎病（V）、枯萎病1、2号（F1、F2）、烟草花叶病毒（TMV）、番茄斑萎病毒（TSWV）以及根结线虫（Mj）。适合秋冬茬栽培。适合南方露地栽培的抗TY的番茄品种有琳达、琳达：无限生长型，中熟品种。植株长势旺盛。单果质量160220 g。果实扁球形，色泽鲜红亮丽，无绿抗番茄黄化曲叶病毒（TY）的番茄品种。无绿果肩，硬度好，耐贮运。抗TY、黄萎病（V）、枯萎病1、2号（F1、F2）、烟草花叶病毒（TMV）及根结线虫（M）j。适合秋、冬、春茬栽培。该品种在云南、广西等地的秋冬茬表现优秀。瑞克斯旺抗TY的番茄品种格利（73-516）RZ F1（果实大红色，微扁圆形，中型果，单果质量180220 g）、74-587 RZ F1（果实大红色，微扁圆形，中型果，单果质量200220 g）、74-205（Lynna）RZ F1（中果型串收番茄，果实红色，单果质量7080 g）、74-104（Moscate）lRZ F1（樱桃番茄，果实红色，圆形，单果质量15 g左右）。以上品种2010年将开始小批量推广。74-112 RZ F1：圆形鸡尾酒型番茄，无限生长，植株健壮、开展，果实红色、鲜亮，单果质量3540 g，果穗排列整齐，建议每穗留果810个，既可单果采收也可成串采收，口味佳，适合早春、秋冬、早秋保护地种植。抗烟草花叶病毒病、斑萎病毒病、TY、黄萎病、枯萎病及线虫病。先正达抗TY的番茄品种莎丽：无限生长类型红果番茄，适应性强，坐果性好，单果质量160180 g，硬度大，高抗TY，耐热，抗病性强，产量高。拉比：高抗TY，早熟，硬度大，抗病性强，产量高。奇达利：无限生长类型，植株节间短，果实大红色，扁圆形，萼片美观，抗TY，适合保护地越冬及露地秋延后栽培。迪利奥：无限生长类型，坐果能力强，果实大红色，果形美观，耐热性好，耐裂能力强，抗叶霉病、TY，适合保护地秋延后栽培。荷兰德澳特抗TY的番茄品种红果品种宝塔利亚：植株长势中等，无限生长型，果实大红色，圆形，单果质量180220 g，抗根结线虫、枯黄萎病、烟草花叶病毒、TY。适合早春、秋延后栽培。建议每667 m2栽培2 000株。粉果品种DRK599：植株长势旺盛，无限生长型，果实粉红色，圆形，单果质量220260 g（根据栽培密度，果实大小有所变化），抗枯黄萎病、烟草花叶病毒、TY。适合早春、越冬栽培。建议每667 m2栽培2 500株左右。 浙江浙农种业公司抗TY的番茄品种浙杂301：有限生长类型，早熟；高抗番茄青枯病、南方根结线虫，抗TY、番茄花叶病毒病（ToMV）和枯萎病；幼果淡绿色、无绿果肩，成熟果大红色，单果质量180 g左右，果实圆整，耐贮运；坐果性佳，产量高栽培番茄均不抗番茄黄化曲叶病毒，所以传统育种采用从野生近缘种中筛选抗性材料，以其为亲本与栽培番茄进行杂交来获得抗性；野生近缘种中的抗性位点Ty-1、Ty-2和Ty-3及一些QTLs先后被定位，也筛选出了可鉴定Ty-1基因的SSR-47标记及鉴定Ty-3的SCAR标记；通过转基因技术获得抗性是研究热点之一，目前转入番茄后表现出抗性的序列有TYLCV病毒的CP基因、REP基因的部分序列或反义序列、不编码的保守序列以及源于白粉虱的GroEL基因。番茄抗TYLCV育种始于20世纪70年代，已培育出了一些抗病品种(Lapidot and Friedmann.,2002)。TYLCV的鉴定以病症、植物体内的病毒DNA含量、PCR鉴定等方法均被采用，不同时期接种病毒，发病率没大的差异，但对产量的影响却很大(Levyand Lapidot.,2008)。由于TYLCV需白粉虱传播，如何饲养白粉虱，并使其带上具传染性TYLCV，也是研究内容之一(Goldman and Czosnet.,2002)，最近也有报道PCR扩增TYLCV全长序列，然后克隆到质粒上，采用微粒轰击法接种，植物可出现病症，虽然比白粉虱接种时晚57 d，在番茄上成功率仅37%，但在一种曼陀罗属(Datura Linn.)植物上却可达85%(Lapidot et al.,2007)。较早发现的抗性种是S.pimpinellifolium（醋栗番茄）和S.peruvianum(秘鲁番茄)，尽管不是完全免疫，但却具很高的抗性，至90年代又筛选到S.chilense（智利番茄）和S.habrochaites，感染后植株体内病毒含量很低，不表现症状(Vidavskiet al.,2008)。通过从野生番茄中筛选出具抗性的材料，以其为亲本与栽培种杂交，使栽培番茄获得TYLCV抗性的研究较早，也取得了一定的成果(Prez de Castro etal.,2005;Chomdej et al.,2008)。将S.pimpinellifolium与栽培番茄杂交，其杂种13代及回交后代均具有部分抗性。尽管S.peruvianum中的抗性是由5个隐性基因控制的，但与栽培番茄的杂交获得了第一个具抗性的商业化杂种 TY-20，其它一些抗性品种如TY-197、TY-172等也是与这一亲本杂交获得的。对TYLCV的抗性不会影响到番茄的品质。Hernandez等(2008)对西班牙3个抗病品种与3个感病品种的主要化学成分如糖、矿物质、抗坏血酸、番茄红素、总酚等化学成分进行了检测，结果表明，感、抗病品种间的主要差别表现在可溶性固形物、pH、有机酸、总酚和羟基肉桂酸含量上，其它成分未表现出显著差异。、2番茄抗TYLCV分子标记辅助育种：运用分子标记进行辅助育种可避免复杂的抗性鉴定步骤，也有利于缩短育种年限，抗性位点的分子标记研究工作开展也较早。最早鉴定出的抗性位点是源于S.chilense的Ty-1，通过S.chilense(抗病)与S.sculentum(感病)杂交，回交1代接种TYLCV，挑选无病征后代，用61个分子标记分析检测哪一段基因渗入了栽培种，BC2接种后用RFLP分析。结果表明染色体3和6上的分子标记与抗性相关，染色体6上的分子标记在BC2上得到证实。以染色体3和6、7上S.chilense纯合基因的BC2为亲本，产生BC3研究发现，染色体6上的Ty-1为抗性主要基因，而3和7上具修饰基因(Zamir et al.,1994)，可鉴定该位点的分子标记SSR-47经24份材料验证，可作为番茄Ty-1等位基因鉴定的标记(Nizio et al.,2008)，与该基因连锁的RAPD标记及CAPS标记均已筛选出。通过RAPD标记分析将抗性位点定位于第6条染色体长臂上的3个区域，其中一个区域包含Ty-1(AgramaandScott,2006)，Ji等(2007)进一步运用RAPD进行QTL定位，发现另一个抗性位点Ty-3，在标记cLEG-31-P16和T107之间，与Ty-1邻近，两者间的遗传距离仅30 cM，根据RAPD引物UBC169转化的SCAR标记P169可标记Ty-3位点。但是这些分子标记应用于育种还未见报道。(褚云霞,2009)对TYLCV抗性的遗传研究揭示了不同来源的野生品种其抗性是由不同的遗传机制控制的，且在绝大部分情况下，抗性涉及多基因控制(Pico et al.,1996)。目前对TYLCV抗性研究较多的是Ty-1、Ty-2和Ty-3基因。其中Ty-3基因是一个部分显性基因，被定位到第6号染色体上，可能是抗TYLCV的主效基因(Ji et al.,2007a)。2000年Hanson等利用RFLP技术把Ty-2基因定位在11号染色体的长臂上，并将其限定在标记TG393(103 cM)和TG36(84 cM)这间。Ji等(2007b)将该基因限定在一个更小的范围。Ty-2基因作为TYLCV的一个抗性位点最早是由在S.habrochaites f.glabratum家系B6013发现的(Kalloo and Banerjee,1990)，2006年正式把该位点命为Ty-2(Hanson et al.,2006)。Purcell等(2003)发现Ty-3对TYLCV的抗性具有等同的加性和显性效应。除此之外，番茄F2代植株TYLCV发生变异的原因65%是Ty-3基因引起的，因此认为Ty-3可能是抗TYLCV的主效基因。这与Zamir等(1994)认为的Ty-1基因是抗TYLCV的主效基因有矛盾。番茄抗黄化曲叶病研究进展自从Cohen 和Harpaz发现番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）以来，番茄黄化曲叶病主要集中于热带和亚热带地区，目前已在非洲、中东和东南亚地区、地中海地区、中美洲、澳大利亚、日本、印度、墨西哥、加勒比海地区及美国的佛罗里达州和加州等众多的国家和地区发生。自20 世纪90 年代起，在中国的浙江、上海、广西、云南、江苏、河南、广东、福建、海南和台湾等地也相继在番茄上发现有TYLCD 的危害。番茄生长发育早期感染TYLCD，其症状主要表现为植株生长缓慢或停滞，严重矮缩，顶部叶片黄化、变小，叶片边缘向上卷曲，无法正常开花结果；后期感染TYLCD，染病植株仅上部叶片和新芽表现症状，结果减少，果实变小，致使番茄品质下降，基本失去商品价值，产量减少，甚至绝收。在广西，TYLCD发病很普遍，发病严重地区病株率高达30%50%，有的田块100%植株染病，损失惨重。2006 年浙江苍南县大棚番茄发病面积达400 hm2，占全县番茄栽培面积的80%，经济损失1 000 多万元。1 病毒分类番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus),主要通过烟粉虱(Bemisia tabaci)传播。TYLCV是最初在以色列所分离双生病毒的名称。但双生病毒为单链DNA病毒,存在基因重组现象,病毒变异频率高,越来越多的此类病毒在世界各地被分离出来。经过序列比较分析发现侵染番茄的一系列Begomoviruses病毒亲缘关系或近或远,仅用TYLCV对这类复杂的病毒进行命名明显已不恰当了。双生病毒科病毒全基因组核苷酸序列同源率小于89%的往往定名为不同病毒,大于89%则被认为是同一病毒的不同株系。国际病毒分类委员会将Begomovirus中侵染番茄并造成其黄化曲叶症状的病毒划分为以下几种:TYLCAxV、TYLCCNV、TYLCGuV、TYLCIDV、TYLCKaV、TYLCMaIV、TYLCMLV、TYLCSV、TYLCTHV、TYLCV、TYLCVNV,其中每种病毒又包含不同的株系。表15-1 番茄黄化曲叶病病分类 病毒全称株系TYLCAxVTomato yellow leaf curl Axarquia virusTYLCAxVTYLCIDVTomato yellow leaf curl Indonesia virusTYLCIDVTYLCKaVTomato yellow leaf curl Kanchanaburi virusTYLCKaVTYLCMaIVTomato yellow leaf curl Malaga virusTYLCMaIVTYLCVNVTomato yellow leaf curl Vietnam virusTYLCVNVTYLCGuVTomato yellow leaf curl Guangdong virusTYLCGuVTYLCCNVTomato yellow leaf curl China virusTYLCCNV-Bao、TYLCCNV-Bea、TYLCCNV-Chu、TYLCCNV-Dal、TYLCCNV-HonTYLCMLVTomato yellow leaf curl Mali virusTYLCMLV-ET、TYLCMLV-MLTYLCSVTomato yellow leaf curl Sardinia virusTYLCSV-Sar、TYLCSV-Sic、TYLCSV-ESTYLCTHVTomato yellow leaf curl Thailand virusTYLCTHV-A、TYLCTHV-B、TYLCTHV-CTYLCVTomato yellow leaf curl virusTYLCV-Gez、TYLCV-IR、TYLCV-IL、TYLCV-Mld通过对番茄花叶病毒的病原分子鉴定,结果发现危害中国不同地区的双生病毒不全相同。刘玉乐等在广西分离到中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV),是一种不同于其他国家和地区的新双生病毒,其共同区DNA序列与TYLCV-Tha、TYLCV-Sar、TYLCV-Sic的同源性仅为53.2%57.7%。何自福等从广东采集的番茄黄化曲叶病病株上分离到的病毒分离物G2和G3,与之前已报道的40多种菜豆金色花叶病毒属病毒的亲缘关系均较远,推测两者可能是先前未报道的双生病毒科菜豆金色花叶病毒属新种,命名为广东番茄曲叶病毒(Tomato leafcurlGuangdong virus ,ToLCGDV)。彭燕等从云南分离到分离物Y64,徐幼平等从广西分离到分离物G102,两者DNA-A全长序列与TYLCCNV的同源性均达到95%以上,表明两者均是TYLCCNV的同一个分离物。近年来从浙江、上海、江苏、安徽等地番茄上分离到的番茄黄化曲叶病毒,病原分子鉴定的同源性均在95%以上,都与中国台湾、广东、云南、广西等地以及泰国、缅甸、越南、印度等东南亚国家报道的双生病毒DNA-A全序列亲缘关系较远,而与美洲、非洲等地的TYLCV亲缘关系较近。2 TYLCV 检测及防治2.1 TYLCV 检测番茄黄化曲叶病毒在全球范围内危害日益猖獗。病毒的检测对了解病毒的发生及其流行动态，并为控制这类病毒打好基础。常用的检测方法有生物学检测法、血清学方法和分子生物学方法等。2.1.1 生物学检测法 生物学检测法一般包括目测法和指示植物鉴别法。目测法就是通过观察番茄表现的症状来确定是否感染发病，指示植物鉴别法是借助于对某些病毒敏感的植物而进行的病毒鉴定方法。生物学鉴定是病毒鉴定的传统方法，检测比较简单，观察结果具有直观性。该方法由于受观察的主观性和症状产生的不确定性影响而具有一定的缺点，但作为TYLCV 研究的生物学意义仍不可取代，可以与分子生物学等方法结合起来研究TYLCV。2.1.2 血清学方法 血清学方法是利用抗原、抗体的体外特异性结合来研究植物病毒。目前应用最广泛的血清学检测方法是酶联免疫吸附法（ELISA），将抗原抗体的免疫反应与酶的高效催化作用相结合，通过化学方法将酶与抗体相结合形成酶标抗体，在遇到相应底物时，酶催化无色底物产生化学反应生成有色化合物或不溶物，借助有色产物检测相应抗原抗体。ELISA 方法主要有双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）、三抗体夹心ELISA（TAS-ELISA）等。其中TAS-ELISA 是检测TYLCV 常用和有效的手段之一。2.1.3 分子生物学方法 分子生物学方法通过检测病毒核酸（DNA，RNA）来证实病毒的存在。由于是从核酸的水平来检测病毒，所以比血清学方法的灵敏度更高，并且特异性更强，检测病毒的范围更广，并可以进行大批量的样本检测，甚至可以直接使用粗提液检测。2.2 防治番茄黄化曲叶病毒病可能在首次暴发后，数年内迅速蔓延开来并导致大暴发，故须立即采取措施进行积极有效的防控，如加强田间管理、培养无虫苗、化学防治及种植抗耐品种等，以便将该病毒引起的损失控制在最小限度内。烟粉虱繁殖力强且极易产生抗药性，如片面施用化学农药往往13 年后难以防治，而且该虫寄主广泛，几乎涵盖所有常见蔬菜、多种花卉等作物，要将该病毒病阻止其传播和扩散有很大的难度，因此寻找抗病毒品种，是消除番茄黄化曲叶病毒病威胁的主要策略，引进、筛选、培育抗耐病的优良品种是当前的重要任务。虽然防治番茄黄化曲叶病毒病最有效的途径是培育优良抗病品种，但这需要一个艰辛的培育过程。3 抗性鉴定方法抗病性鉴定是抗病育种的重要基础，从抗源筛选、后代选择、直到品种推广的全过程都离不开抗病性鉴定。3.1 粉虱接种鉴定3.1.1 集体接种 首先在温室内，将烟粉虱若虫放于病株上饲养。感病植株表现出严重的TYLCV 症状，并维持烟粉虱较高的种群量。当待测番茄植株长到34 片真叶时，以盆栽的方法种植于温室，完全随机区组设计。鉴定期间，不使用杀虫剂。这种方法能够保证烟粉虱在有限的空间内传毒，但是受粉虱喜食性影响。集体接种法不适合鉴定中抗或低抗的番茄材料，因为接种物密度较大能够克服抗性机制，如杂交种F3522 和F3524 在自然接种和网罩接种条件下表现为抗病，但在集体接种条件下完全感病。温室控制的集体接种方法可能会遇到不选择的问题，如物理障碍：叶片上的蜡质及特化的表皮毛等都会抑制粉虱的喂养。这个问题在鉴定野生材料抗性时特别显著，某些感病材料不能被感染。当栽培种和野生种一起鉴定时，野生材料不选择性的发生使得粉虱很难均匀分布。这增加了感病材料避开被侵染的可能性，如L. peruvianum PE-30。而网罩下个体接种能避免这种情况，确保100%的发病率。集体接种法不适合用在育种方案中，因为当筛选新的抗源时，可能错误的选择感病材料。3.1.2 网罩接种 待测番茄品种（系）长到34 片真叶时，种植于苗盘中，并被放在单独的网罩内。烟粉虱成虫获毒饲养48 h。在防虫网罩内每个植株约有1520 头携带病毒的粉虱。接种4 d 后，喷杀虫剂，植株被移到防虫温室，并观察其症状。这种方法排除了粉虱喜食性的影响。3.1.3 自然接种 田间自然鉴定是在自然发病条件下的田间鉴定，利用田间带毒烟粉虱接种，自然发病，尤其是在病害的常发区，进行多年鉴定。此法对于抗性资源的筛选方便快捷，但是，带毒粉虱的数量不能保证，不同年度间结果差异较大，受粉虱喜食性影响较大，因此此法不适合用在育种计划中。杂交种Tydal 和Jackal 在田间自然接种条件下表现出很高的抗性，而在人工接种条件下，完全感病。多数野生材料在田间自然接种条件下鉴定，不能感病或感病率很低。3.2 嫁接接种鉴定以感染TYLCV 植株作砧木，被鉴定植株作为接穗，或者采用腹接法将来自感病植株的叶片或茎尖嫁接到被鉴定植株上。此法传送效率高，并且被鉴定植株持续暴露在病毒下，因此可以用来筛选抗TYLCV的材料。但是这种方法耗时耗力，不适合鉴定大量的材料。3.3 农杆菌接种鉴定TYLCV 基因组的串联重复序列被克隆到根癌农杆菌Ti 质粒的T-DNA 上，然后将含TYLCV 的侵染性克隆的农杆菌在含有Km和Sm的YEP 液体培养基中28培养至OD600 为0.60.8。取0.2 ml 混合菌液在距根部12 cm 处或植株叶柄处分别注射接种46片真叶的番茄材料。接种植株置于防虫温室，在25、16 h 光照条件下培养并定期观察症状。农杆菌接种法能将 TYLCV 导入叶盘和整个植株，TYLCV 在植株中进行系统侵染，诱导致病症状。因此此法可以筛选抗TYLCV 的植株。Pic 等利用农杆菌接种和分子杂交检测病毒DNA 的方法筛选了2 个Lycopersicon hirsutum 材料UPV-16910 和UPV-16911，4 个Lycopersicon pimpinellifolium 材料：UPV-17049、UPV-16953、UPV-16991 和UPV-16990。3.4 基因枪轰击法接种鉴定将TYLCV全长DNA克隆到质粒。克隆的TYLCVDNA 再从质粒上切除、连接，然后形成用于基因枪接种的单体环状双链TYLCV DNA。基因枪接种，植物产生典型的病毒致病症状，与粉虱接种后产生的症状相似。但是基因枪接种植物比粉虱接种植物迟几天表现出症状。4 抗源筛选及抗性遗传规律据报道,番茄栽培种种质资源中缺乏抗TYLCV的基因,仅有一些表现为耐病的种质,高抗TYLCV的基因都存在于近缘野生种质中24-25。目前已报道的抗番茄黄化曲叶病的近缘野生种主要有醋栗番茄(Lycopersicon pimpinellifolium)、秘鲁番茄(Lycoper-sicon peruvianum)、多毛番茄(Lycopersicon habro-chaites)、智利番茄(Lycopersicon chilense)和契斯曼尼番茄(Lycopersicon cheesmanii),且在不同的种质资源中抗性基因呈现不同的遗传方式(表2)。通过与野生番茄进行杂交可把抗病基因转入到栽培番茄中,从而产生抗病性。最初TYLCV抗性育种工作始于以色列,首先在L. pimpinellifolium中发现对TYLLCV表现耐病的种质。Pilowsky等26研究发现LA121中的抗性受控于单个不完全显性基因。随后,Hassan等27研究发现LA121和LA373所表现出的抗性由多基因控制。紧接着, 1989年Kasrawi28发现该野生种中hirsute-INRA和LA1478表现出的抗性受控于单个基因,呈显性遗传。在该野生资源中发现的不同程度的耐病种质,其所含抗性基因虽然能防止症状发生,但是后代产量显著减少,因此并没有有用的番茄品种问世,导致在目前的育种进程中L. pimpinellifolium未成为主要的抗性来源。表1番茄黄化曲叶病不同抗源的遗传方式抗性来源遗传方式LA121单因子,不完全显性遗传LA1478 hirsute-INRA单因子,显性遗传PI 1269355个基因,隐性遗传PI 126926, PI 126930,PI 390681,LA4411个不完全显性基因和2个隐性基因互作LA1969主效基因Ty-1位于第6染色体上,不完全显性LA386多基因,显性遗传LA1401多基因,隐性遗传由于育种家们在L. Pimpinellifolium中未找到令人满意的抗源材料, Pilowsky等21开始在L.Peruvianum中进行TYLCV抗性评价,结果发现PI 126935抗TYLCV,该抗性受5个隐性因子控制,由此产生了世界上第1个抗番茄黄化曲叶病的商业杂交种TY-20。该品种在被侵染后虽然只是延迟了症状的发生和病毒DNA的积累,但是仍然能得到较为可观的产量21, 29。随后,以色列农业研究中心利用L.peruvianum(PI 126926, PI 126930, PI 390681和LA441)培育了一系列高抗TYLCV的育种系,如TY172、TY197、TY198和TY536等30-31。TY172无论是经温室接种鉴定还是在田间自然鉴定,在TYL-CV侵染后均不出现症状。经F2群体遗传分析表明这些种质中的抗性至少受控于3个基因,呈部分显性遗传。除此之外,更多的育种家在其他近缘野生资源中不断寻找抗番茄黄化曲叶病的种质。L. chilense(LA1969)中某些单株在世界很多地方对TYLCV都表现高抗,抗性受控于1个主效基因(命名为Ty-1,为部分显性遗传),和至少2个以上的修饰基因32-34。由于整合单个显性基因相对容易,因此该主效抗性基因Ty-1得以广泛应用,带有该抗性基因的杂交种也在市场上被推广种植。野生番茄L. habrochaites中LA386、LA1777等对TYLCV也表现较高水平的抗性,研究发现该抗性是由1个主效基因和几个修饰基因所控制。另外该野生种B6013中,有2个上位基因控制其对TYLCV的抗性,育种家由此育成了H24,之后相关研究证明H24携带Ty-2基因38-39。AVRDC在番茄育种进程中将Ty-2基因作为基本抗源,继续利用H24培育了一系列抗病自交系。亚洲和世界其他地方的一些种子公司,也对H24进行了广泛的应用。在中国,江苏省农业科学院蔬菜研究所对引进的种质资源材料进行带毒烟粉虱鉴定及病区田间鉴定,筛选出了一批抗病材料。目前,利用Ty-2基因作为抗源,已经成功培育了抗番茄黄化曲叶病毒病的优质高产杂交番茄新品种苏红9号40。除了上述番茄近缘野生种,在L. cheesmaniiLA1401中也发现了TYLCV抗性,抗性表现为多基因隐性抗性。5 抗性基因定位早在 1994 年，Zamir 等利用Lycopersicon chilense LA1969 和感病材料M82-1-8 杂交，通过对BC2S1 和BC2S2 代的分析，认为LA1969 携带的抗TYLCD 基因是不完全显性单基因，命名为Ty-1，被定位在6 号染色体的RFLP标记TG297（4 cM）和TG97（8.6 cM）之间，图距610 cM。另外2个修饰基因分别被定位于第7染色体上TG61 (90 cM)附近和第3染色体上(TG66和TG33)附近。除此之外, De Castro等发现了另外1个可用于定位Ty-1基因的CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)标记,即REX-1(ca. 55 cM),该标记同时与番茄根结线虫病的抗性基因Mi相连锁。用该标记分别对L. esculen-tum, L. chilense和L.peruvianu3种材料进行PCR扩增,然后对PCR产物进行酶切,发现3种材料分别具有0、2、1个Taq酶切位点,从而可以通过电泳很容易地将3种材料明显区分开。Hanson 等利用92 个RFLP 标记作为探针对来自野生番茄抗黄化曲叶病毒的抗性基因进行定位分析，将其定位在11 号染色体长臂上，在TG36（84 cM）和TG393（103 cM）标记之间，约14.6cM 的范围之内，2006 年该基因被命名为Ty-2，并定位在TG36（84cM）和TG26（92 cM）标记之间。Ji 等利用易感品种7781x 抗病自交系021108（来自Lycopersicon chilense LA2779）和易感品种8248x 抗病自交系034611（来自Lycopersicon chilenseLA1932）杂交后的F2 分离群体进行连锁遗传分析和QTL 定位分析。源于LA2779 的F2 群体，抗性位点定位在番茄6 号染色体长臂的cLEG-31-P16（20 cM）和T1079（27 cM）之间，约15 cM 范围内。这个位点加性和显性效应几乎是相等的（显性与加性比率是0.47），表明这是一个主效基因。源于LA1932 的F2 群体，抗性位点也定位Ty-3 位点，但对TYLCV 抗性有很小的显性效应（显性与加性比率是0.33）。检测这个抗性位点的SCAR/CAPS 标记：T1079、TG590、cLET-1-I13、P169C、C2_At3g11210、C2_At5g05690、T0507、C2_At5g41480、TG118 和C2_At4g27700 等。Ty-3 位点也存在其它的野生番茄中。来自危地马拉的多毛番茄或秘鲁番茄的优良育种系高抗TYLCV，并有Ty-3 位点的渗入。在醋栗番茄中，一个抗TYLCV的位点定位在TG153 标记附近（33 cM），而这个标记紧密靠近智利番茄的Ty-3 位点。田间试验表明源于LA2779 和LA1932 的育种系抗TYLCV 和ToMoV。利用RAPD 技术对各种群体的QTL 分析，把TYLCV和ToMoV 的抗性位点定位在6 号染色体的同一区。Ji 等将ToMoV 抗性位点定位在Ty-3 位点的两标记之间，这表明抗ToMoV 的基因位点和Ty-3 位点紧密连锁的。6基因工程改良番茄抗性与传统抗病育种相比,通过基因工程获得抗病植株具有独特优势:转基因植物中外源基因一般作为单个显性基因传递给后代,因此将其转入主栽品种中要容易的多。基于病毒外壳蛋白(Cp)和复制相关蛋白(Rep)等基因的表达,设计了多种蛋白质介导的抗性育种策略,从而获得具有抗病毒能力的植株。例如,在35S CaMV启动子调控下表达TYLCV外壳蛋白基因(Cp)的番茄植株,在被带毒烟粉虱接种后表现出较强的抗性,发病症状延迟出现。有关研究表明使用TYLCV的截短型复制相关蛋白(Rep)基因,转化番茄就会表现出对TYLCV感染的抗性。除此之外,利用拟南芥韧皮部特异启动子与Groel基因构建植物表达载体后转化番茄植株,Groel基因在番茄韧皮部特异表达,也可以获得抗双生病毒的转基因番茄。近年来发展起来的一种新的抗病毒基因工程策略,即RNA介导的病毒抗性,该抗病类型在番茄黄化曲叶病抗病基因工程中也发挥了重要作用。针对番茄黄化曲叶病危害日趋严重,以及中国抗番茄黄化曲叶病专用品种缺乏的现状,各研究机构正致力于通过转基因技术提高中国番茄对TYLCV的抗病性。7 展望TYLCV 的不同分离物在不同番茄抗源材料中呈现出多种抗TYLCV 遗传规律，可能是由于抗源材料抗TYLCV 的方式不一致，导致其抗TYLCV 遗传规律的不同，或者是由于TYLCV 菌株的差异和病毒的重组变异而导致其致病机理发生了变化，因而作物相应表现出不同的抗病机制，另外抗源在不同地区的表现差异很大，这在一定程度上使抗TYLCV 育种具有更大的难度。这就要求深入开展TYLCV 的病理学研究，包括病毒的接种鉴定方法以及寄主与病原物相互关系的研究。目前 TYLCV 分子遗传研究应用的标记多是RFLP 和RAPD 标记，在所应用的分析群体中，这些标记都没有均匀覆盖整个基因组，其原因是番茄的遗传基础狭窄，亲本间的多态性标记少。可以推测，应用亲缘关系较远的组合或应用新类型标记，将可能会在目前的空白区段发现新的抗性位点。抗性分子遗传的研究已证实在2 条染色体上存在抗性位点，并已找到相应的分子标记，这为分子标记辅助选择（MAS）打下了基础，今后的一个方向将是研究各个位点的具体功能，进行不同效应基因的聚合育种。如果把Ty-1、Ty-3 及Ty-2 聚合到同一个品系中，将会产生更加稳定持久的抗性。中国开展抗 TYLCV 的研究时间尚短，可应用的抗源有限，多是从国外或亚洲蔬菜研究发展中心引进。今后一方面要继续开展种质资源的搜集、鉴定和优异抗源材料的创新，另一方面要开展育种新技术和新方法的研究。在今后的抗病育种中，常规育种仍占有重要地位，但为了提高育种水平，常规育种应与生物技术相结合。现有抗性基因的精确定位还不够，随着分子生物学的快速发展，分子标记定位和转基因技术将在抗TYLCV育种中发挥越来越大的作用，而且分子标记的使用将使抗性基因的早期选择和多抗性基因的累加成为可能。本发明公开了番茄抗黄化曲叶病毒病育种的分子标记辅助选择方法,属于蔬菜抗病育种技术领域。该方法按以下步骤进行：(1)从育种分离世代材料提取DNA；(2)筛选抗TYLCVD基因的SCAR分子标记；(3)DNA的双重PCR扩增与电泳分析检测；(4)依据检测结果对育种分离世代材料进行抗性评价。本发明可在实验室对育种进程中的任何世代材料,对其是否聚合抗TYLCV的基因进行准确、快速的检测,从而明显缩短了抗病育种的周期,缩小了育种规模,并具有操作简便、省时、省力、省成本等优点,减少了工作量,提高了对抗性材料的筛选效率,加快了抗病育种进程。该发明可在番茄育种单位推广应用。1、 番茄抗黄化曲叶病毒病育种的分子标记辅助选择方法,其特征在于该方法按以下步骤进行： (1)从育种分离世代材料提取DNA：将番茄抗黄化曲叶病毒病育种分离世代材料的种子,播种；待幼苗长至34片真叶时,每植株取1片幼叶,用改进的CTAB法提取DNA； (2)筛选抗TYLCVD基因的SCAR分子标记：根据已发表的文献资料,初选出抗番茄黄化曲叶病毒病基因的分子标记,合成引物后进行PCR扩增；并根据PCR扩增的纯合和杂合带型以及人工苗期接种鉴定结果,从中筛选出适合自己育种材料的抗番茄黄化曲叶病毒病基因Ty-2和Ty-3的SCAR分子标记；Ty-2上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示,Ty-3上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示； (3)双重PCR反应体系的建立与电泳分析检测：Ty-2和Ty-3基因的双