异丙酚通过激活ERK信号通路减少H2O2引起的L02肝细胞凋亡.doc

异丙酚通过激活ERK信号通路减少H2O2引起的L02肝细胞凋亡王浩 薛张纲复旦大学附属中山医院麻醉科，上海 200032Propofol protected hepatic L02 cells from H2O2-induced apoptosis via activation of Extracellular Signal-Regulated Kinases (ERK) PathwayWANG Hao, XUE Zhang-gangDepartment of Anesthesiology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China摘要：目的 已有报道证明异丙酚在缺血再灌注损伤 (ischemia/reperfusion I/R) 中对一些重要脏器具有保护作用，但是对肝细胞的作用报道甚少。此外，最近的研究显示ERK信号通路在氧化应激中发挥重要作用。因此我们用H2O2诱导肝细胞氧化损伤，观察异丙酚预处理对人L02细胞的影响并且进一步检测ERK通路在其中的作用。方法 L02细胞经异丙酚预处理后被H2O2诱导凋亡，用TUNEL法及Caspase-3切割程度来检测细胞的凋亡。用蛋白质印迹技术检测ERK及MEK的磷酸化情况。通过实时定量PCR技术检测Bcl-2, Bcl-xL, Bad, 和Bax mRNA表达量变化。结果 在H2O2诱导的凋亡过程中，经异丙酚预处理的L02细胞凋亡数量及Caspase-3切割量均明显减少。并且这种减少与异丙酚的剂量成正相关：当异丙酚剂量用至300 M时，细胞的凋亡程度被降至最低。与此一致的是ERK的磷酸化被显著的激活。单用不同浓度的异丙酚 (10 - 300 M) 处理细胞，检测到浓度依赖性的ERK及MEK磷酸化升高。不同时间点（0 - 4 h）收获经异丙酚处理的细胞，发现ERK及MEK在0.5小时内就可以被激活，随后逐渐降低，至4 h时，ERK及MEK的活性下降到峰值时的一半。用特异性的MEK抑制剂PD98059处理细胞完全抑制异丙酚诱导的ERK活性，并且加重了细胞的凋亡程度。异丙酚预处理减少了促凋亡基因Bad和Bax的mRNA表达，并且这种抑制作用可以被PD98059逆转。结论 我们的研究提示异丙酚对H2O2诱导的人肝细胞凋亡具有保护作用，并且这种保护作用至少部分是通过激活ERK信号通路进而抑制Bad和Bax的表达起作用的。关键词：异丙酚；肝细胞；ERK；凋亡Abstract：Objective Here we investigated the effect of propofol preconditioning on human hepatic L02 cells under hydrogen peroxide (H2O2)-induced oxidative stress and attempted to find out whether ERK pathway is involved in this process. Methods Preconditioned or nonpreconditioned human hepatic L02 cells were exposed to H2O2 and the changes of apoptosis were evaluated by TUNEL assay and Caspase-3 cleavage. Activation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and MAP Kinase/ERK Kinase 1/2 (MEK1/2) was measured by western blot. The mRNA expression of Bcl-2, Bcl-xL, Bad, and Bax was quantified by real-time PCR. Results Propofol preconditioning reduced population of apoptotic cells and Caspase-3 cleavage induced by H2O2 in hepatic L02 cells. The minimal amount of cell death was relevant to 300 M propofol pretreatment, accompanying with significant activation of ERK1/2. L02 cells treated with propofol (10 - 300 M) alone, led to a dose-dependent activation of ERK and MEK. Treated cells with 300 M propofol for 0 - 4 h, ERK and MEK were activated within 0.5 h and eventually declined to less than 50% at 4 h. The addition of specific inhibitor, PD98059, completely abolished the activation of ERK and aggravated the extent of apoptosis. Propofol pretreatment decreased the mRNA expression of pro-apoptotic genes, and this repression could be reversed by PD98059. Conclusion These findings present a new molecular mechanism of propofol protection against H2O2-induced apoptosis in hepatocytes, which is at least partly mediated by activating MEK-ERK pathway, and further suppressing Bad and Bax expression.Key words：Propofol; hepaocytes; ERK; Apoptosis肝脏移植、组织切除术及出血性休克都会引起细胞氧化损伤并最终导致肝功能失调或衰竭1, 2。组织缺血再灌注中堆积的氧自由基是导致细胞死亡的主要因素3, 4。目前针对I/R损伤最有效的措施是预处理，如：缺血预处理、热休克及一些模仿这种作用的药物，都可以有效的提高移植术后的肝组织存活率 5, 6。作为常用的静脉麻醉药，异丙酚由于它的代谢几乎不受到肝功能失调的影响，因此常用于肝移植手术中。最近的一系列报道都提示异丙酚作为抗氧化剂对心、肺、脑具有保护作用7, 8, 9。但是对不同的组织细胞以及在不同的实验条件下，异丙酚的作用则并不完全一致。到目前为止，异丙酚对肝细胞在氧化应激条件下的作用尚不清楚，并且其作用的分子机制更是知之甚少。 氧化应激产物(Reactive oxygen species, ROS)包括过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2)是由于在I/R异常代谢过程中堆积的产物。细胞内毒性H2O2的堆积常伴随着细胞内一些组分的快速修饰，如细胞内谷胱甘肽和ATP的削减、NAD+的下降、胞内钙离子的增多以及脂质的过氧化。这会引起细胞的凋亡和坏死。凋亡是一种主动的细胞程序性死亡过程，其主要特征是细胞皱缩、染色体固缩成团形成凋亡小体和活性Caspase-3的切割 10。有丝分裂激酶蛋白家族 (Mitogen-actived protein kinases, MAPKs) 被认为涉及细胞氧化应激的过程。在真核细胞生物中，MAPKs将细胞外的信号传递到细胞核11, 12, 13。ERK是MAPKs家族成员之一，很多实验证实它在氧化损伤中具有保护组织脏器的作用。ERK磷酸化激活后与下游的转录因子及其他激酶相互作用，调节细胞内部的生理功能14, 15, 16。尽管ERK被报道参与缺血损伤的病理过程，但是在异丙酚对肝细胞的预处理中的效应未见报道。 在本研究中，我们检测了异丙酚预处理对于H2O2诱导肝细胞凋亡的作用，并且检测了异丙酚对ERK通路的影响。材料方法细胞株及主要试剂 L02人肝细胞购自中国科学院细胞生化所。RPMI-1640培养液及胎牛血清购自GIBCO公司。抗人ERK及磷酸化ERK单克隆抗体，兔抗人Caspase-3、MEK1/2、磷酸化MEK1/2多克隆抗体均购自CST公司。ECL发光试剂购自Pierce公司。异丙酚（得普利麻）购自阿斯利康公司。TUNEL试剂盒购自Roche公司。Real-Time PCR试剂盒购自TaKaRa公司。细胞培养 L02人肝细胞培养于37oC、5CO2及饱和湿度的细胞培养箱中。细胞在含有10的胎牛血清的RPMI-1640培养液（含链霉素与青霉素）中贴壁生长。异丙酚及抑制剂预处理 为了检测不同浓度异丙酚预处理的作用，将异丙酚溶解在DMSO中，加入细胞培养液中的终浓度为0，50，100和300 M。L02细胞接种到3.5 cm的培养皿，当细胞贴壁生长1 d后，分别加入不同浓度的异丙酚预处理1 h，对照细胞则加入相同体积的DMSO，然后加入H2O2诱导细胞凋亡。作为溶剂的DMSO在各样品中的终浓度均低于0.3。预处理后的细胞，继续用200M的H2O2共通孵育8h诱导凋亡17。为了测定异丙酚是否通过激活EKR信号通路发挥抗凋亡作用，在加入H2O2诱导凋亡前，L02细胞先用PD98059（特异性MEK抑制剂）处理1h，然后再异丙酚预处理。原位细胞凋亡检测（TUNEL） 用4中性多聚甲醛室温固定生长于96孔板中的细胞1 h，0.1mol/L PBS洗涤2遍（每次5min）后加入含0.3%H2O2的甲醇中1 h，后用含0.1% Tween-20的PBS洗涤2遍，每个孔加入50 l TUNEL反应液，37 h 孵育1 h后在荧光显微镜下观察拍照。Western印迹技术 收集细胞，PBS洗涤细胞两次，加细胞裂解液，超声破碎细胞，用Lowry法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离细胞总蛋白，每孔上样量为50 g，然后将胶上的蛋白通过电转移印迹到PVDF膜上。5 脱脂奶粉/TBS液封闭PVDF膜，加ERK、MEK、Caspase-3或-tubulin一抗结合，然后用HRP标记的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗结合，最后用ECL试剂发光，X胶片曝光、显影、定影记录条带，将条带扫描后进行灰度分析。Real-Time RT-PCR定量分析 用Real-Time RT-PCR检测Bcl-2家族基因的表达水平（仪器型号为ABI Prism 7300）。用Trizol试剂抽提细胞总RNA，取2g RNA逆转录制备cDNA。Real-Time PCR反应体系包括2 l的cDNA模板（1的RT产物）、10 l SYBR Green Mix（Takara）及10 M终浓度的上、下游引物（序列见表1），加入H2O补足20 l，扩增条件为95 C 5 s总变性以及95 C 5 s、 60 C 31 s循环40次。目的基因的mRNA水平用Gapdh内参校正，并将对照组细胞的表达水平设定为1。所有样品每个基因的PCR反应均为3孔，实验重复至少3次。统计学处理 采用SPSS11.5统计软件，最终数据采用“均数标准差”表示，数据比较采用t检验，P 0.05认为差异有统计学意义。结果异丙酚保护L02细胞对抗H2O2诱导的凋亡首先，我们用TUNEL法测定发现异丙酚预处理过的细胞的凋亡细胞数量与对照细胞相比有不同程度的减少，并且与异丙酚的浓度呈正相关（见图1A）。对照细胞100的凋亡，而用300 M预处理的细胞只有32发生凋亡（见图1B）。蛋白质印迹技术也证明300 M的异丙酚显著的降低了Caspase-3的切割（见图1C-D）。因此，我们的体外实验提示异丙酚在肝细胞中的作用与在心、脑细胞中的作用一致，都是起了保护细胞抗凋亡的作用。异丙酚激活ERK信号通路由于异丙酚调节细胞效应的分子机制研究的不多，而ERK信号通路被认为涉及氧化应激过程的抗凋亡作用。因此，我们想检测异丙酚是否与ERK信号通路存在联系。如图2A-B所示，200 M的H2O2本身不能激活ERK的磷酸化，而加入300 M的异丙酚明显上调了磷酸化的ERK，这说明ERK的激活完全依赖于异丙酚的作用。考虑到异丙酚可以激活ERK，我们进一步分析了异丙酚对ERK及其上游MEK激活的时间和剂量效应关系。分别用10，50，100，300 M的异丙酚处理细胞1 h，发现ERK的活性与异丙酚的浓度呈正相关（见图3A-C）。用300 M的异丙酚处理细胞后分别在0、0.5、1、2和4 h收获细胞，发现在0.5 h内ERK就被激活，当到4 h时，ERK的活性降低到峰值时的50（见图3D-F）。因此，我们的结果提示异丙酚在H2O2诱导的凋亡中可能通过激活ERK信号通路发挥保护细胞的作用。阻断ERK的活性抑制了异丙酚的保护作用为了证实异丙酚对ERK的活性调节作用，我们用50 M PD98059（MEK的特异性抑制剂）孵育细胞1h，发现ERK的活性几乎完全被阻断（见图4A-B）。TUNEL染色和Caspase-3活性分析都发现使用抑制剂的细胞凋亡程度明显高于未使用抑制剂的细胞（见图C-F）。因此，进一步证实异丙酚通过调节ERK信号通路发挥抗凋亡作用的。异丙酚对Bad 和 Bax表达的调节由于Bcl-2家族基因与细胞的凋亡密切相关，我们检测了异丙酚作用下Bcl-2家族基因表达的变化是否依赖于ERK信号的调节。用Real-Time PCR的方法定量分析了Bad 和 Bax两个促凋亡基因及Bcl-xL 和 Bcl-2两个抗凋亡基因的mRNA变化。我们发现Bad 和 Bax的表达明显减少，而Bcl-xL 和 Bcl-2的表达没有显著差异（见图5A-B）。用PD98059处理后，Bad 和 Bax的降低被大量抑制（见图5C），揭示Bad 和 Bax表达的调控受到异丙酚ERK信号通路的影响。讨论 本研究的目的主要是为了阐述异丙酚在氧化应激条件下对肝细胞的影响。这里所有的数据都强烈的提示异丙酚对L02人肝细胞具有保护作用，并且这种作用至少部分是通过激活MEK-ERK信号通路进而抑制特异性的促凋亡基因的表达起作用的。 为了证明异丙酚的抗凋亡作用，我们用过氧化氢作为凋亡诱导剂。在我们的实验中，200 M 的H2O2可以完全导致L02细胞凋亡。临床使用的异丙酚以脂肪乳剂作为溶剂，但有文献报道脂肪乳剂也具有一定的抗氧化作用18。因此为了排除溶剂的干扰，我们将异丙酚纯品溶解于DMSO，并将DMSO的终浓度控制在0.3%以下。我们发现50 M的异丙酚开始发挥抗凋亡作用，当浓度增至100，300M时效应更加明显。这说明高浓度的异丙酚在体外对肝细胞有保护作用，这也提示异丙酚适用于临床的肝脏手术。 尽管有不少研究证明ERK具有抗I/R损伤的作用，但是最近有报道在中性粒细胞中，异丙酚抑制了FLMP诱导的ERK的磷酸化活性19。而我们的实验则证实异丙酚能显著刺激人肝细胞ERK的活性表达，并且ERK的激活完全依赖异丙酚的作用而不是H2O2引起的。据文献报道在心肌细胞中，低浓度的H2O2就可以上调ERK的活性20，而我们发现200 M的H2O2并不能激活L02人肝细胞中的ERK。我们认为这种差异可能是不同的细胞类型造成的。在进一步的实验，我们发现ERK的上调有一定的时间、浓度效应。用PD98059可以逆转异丙酚对肝细胞的保护作用，细胞的死亡数量明显回复。这说明ERK信号通路是异丙酚发挥作用的关键分子。 Bcl-2家族蛋白是与凋亡相关的重要分子，可以分为两部分的成员：抗凋亡基因如Bcl-2、Bcl-xL,促凋亡基因如Bax和Bad21。这两类基因的表达比例决定了细胞最终的命运是存活还是死亡。临床研究中，一些抗氧化药物，例如MnSOD调节Bax和Bcl-2的比例22。基于以前报道ROS和MAPKs可以调节Bcl-2、Bcl-xL、Bad和Bax， 我们检测异丙酚是否调节这些基因的表达。Real-Time PCR结果证实：异丙酚处理后，Bcl-2和Bcl-xL的mRNA表达水平并没有明显的改变，但是Bad和Bax的mRNA水平明显降低。随之，抗凋亡和促凋亡基因的表达比例增加，进而减少了细胞色素c的释放。这些分子的表达水平变化进一步解释了为什么异丙酚能够促进L02细胞存活。此外，有些研究表明Bcl-2是强有力的促存活因子，能够有效的对抗多种应激细胞凋亡23。已知多种蛋白激酶，包括MAPKs能够磷酸化Bcl-2，从而激活它的抗凋亡功能。最近的研究也发现异丙酚可以通过影响Bcl-2和Bax的表达来减少TNF-alpha引起的细胞凋亡24。但是Muto等报道过表达Bcl-2促进缺血再灌注损伤引起的肝细胞凋亡25。然而，在我们的研究中，Bcl-2的表达没有明显改变。这样的差异可能是由于细胞类型及实验条件不同引起的。我们的研究首次提供了证据：在氧化剂引起的凋亡中异丙酚对肝细胞具有保护作用。考虑到所有的这些数据都只是来自体外实验，我们的结果和一些动物实验以及临床实验的结果不一致。在有限的报道中，异丙酚在缺血再灌注引起的肝损伤中的作用有些矛盾。Navapurkar等报道了在氧化应激的大鼠肝细胞中异丙酚具有抗凋亡作用，但最近Shimono等的研究却显示异丙酚对低氧引起的大鼠肝损伤没有任何显著作用26, 27。导致这些不一致的原因可能如下：1，为了有效的检测异丙酚作用机制，我们实验采用的浓度范围比较广，超出了临床使用剂量；2，L02细胞是体外培养的来自单一克隆的肝细胞，排除了他类型细胞的干扰，如Kupper细胞、中性粒细胞等会产生ROS、对抗氧化效应；3，考虑到异丙酚的药理结构是高度脂溶性具有酚基团28，易在脂质环境药效。而体外实验不能完全模拟体内环境，前者需要更高的浓度才能起效。虽然我们的研究表明ERK磷酸化可以被异丙酚激活并且对于它的抗凋亡作用是必需的，我们并不能排除其他一些激酶也参与这个过程的可能，如PI-3K、PKB等29, 30。基于我们目前的研究，有必要进一步检测在其他缺血再灌注模型中，如低渗应激、缺养/复氧或者机械过载等，是否异丙酚也能激活MEK-ERK通路。此外，Acquviva等发现异丙酚可以通过改变HO-1的表达，是否参与其抗凋亡作用尚不清楚31。并且，对于ERK是否涉及异丙酚处理后的Bcl-2家族蛋白磷酸化也未知。所以有必要继续深入进行探索研究。纵观本文，我们的结果揭示在H2O2引起的应激，异丙酚对肝细胞的保护作用可能部分的通过激活ERK通路以及下调Bax和Bad的表达起作用。因而，我们的研究提供了新的证据：异丙酚对肝细胞没有潜在的损害性，适用于肝移植及其他外科手术的麻醉。参考文献1. 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(A) L02 cells were preconditioned with 0, 50, 100, or 300 M propofol for 1 h, and then exposed to 200 M H2O2 for 8 h. Apoptotic cells were labeled by TUNEL assay (green), and all nuclei were stained by DAPI (blue). Bar: 200 m. (B) Percentage of apoptotic cells at various concentrations of propofol was determined by the ratio of apoptotic nuclei to total nuclei number (10 fields per experiment, n=3). * # P0.05 versus DMSO (0 M propofol) treated cells. (C) Caspase-3 cleavage was determined by western blot analysis. (D) The quantified data was analyzed from separate experiments (mean SEM, n=3), and value of propofol preconditioned cells was set as 1. * # P0.05 versus DMSO (0 M propofol) treated cells.Fig 2ABFig. 2. Propofol activates ERK1/2. (A) L02 cells preconditioned with DMSO or 300 M propofol for 1 h were exposed to 200 M H2O2 for 1 h. Expression levels of pERK1/2 and total ERK1/2 were determined by western blot analysis. (B) The amount of pERK/ERK was determined and normalized to the values obtained from DMSO treated cells. All data are presented as mean SEM from three separated experiments. * # P0.05 versus DMSO treated cells, $ + P0.05 versus DMSO+ H2O2 treated cells.Fig 3 ABCDEFFig. 3. Propofol activates MEK-ERK pathway in dose- and time-dependent manners. (A) L02 cells were treated with 0, 50, 100, or 300 M propofol for 1 h. Expression levels of pERK1/2, total EKR1/2, pMEK1/2, and total MEK1/2 were determined by western blot analysis. (B-C) The amount of pERK/ERK and pMEK/MEK was determined and normalized to the values obtained from DMSO treated cells. All data are presented as meanSEM from three separated experiments. * # P0.05 versus DMSO treated cells. (D) L02 cells were treated with 300M propofol for 0.5, 1, 2, or 4 h. Expression levels of pERK1/2, total EKR1/2, pMEK1/2, and total MEK1/2 were determined by western blot analysis. (E-F) The amount of pERK/ERK and pMEK/MEK was determined and normalized to the values obtai