《禽流感病毒研究》word版.docx

燕京理工学院2015届微生物学大作业春季传染病防治研究报告禽流感病毒陈静化工与制药专业 化药1103班 学号110150094指导老师 刘雪凌讲师摘 要禽流感病毒属于正黏病毒科，RNA病毒。自从1997年发现可以感染人类致死以来，引起世界极大的关注。禽流感病毒的基因组由8条独立的单股负链组成，分别编码不同的蛋白质，具有高度的重组性。其中NA和HA变异性最强，也是划分病毒不同亚型的依据。很多研究表明，H5N1型高致病性禽流感病毒基因与1918年的流感病毒有很大的相似性，也暗示了流感病毒进化的一个途径：禽流感猪流感人流感。现阶段预防和治疗的主要方法是抗病毒药物和疫苗，其中，疫苗比较有效而且几乎没有副作用。本文概述了禽流感的概念及生物学分类，感染的临床症状、防治措施，及其历史发展与近年来的现状。还从高致病性禽流感病毒的基因组研究，H5N1 型禽流感病毒可能的起源及其与人的关系，以及针对高致病性禽流感的疫苗研究方面进行了阐述。关键词：禽流感 感染 进化 人流感目 录前 言.1第1章 课题研究价值. 第1.1节 选题背景.第1.2节 研究目的与研究方法.第2章 禽流感病毒. 第2.1节 禽流感病毒的基本概念. 第2.2节 禽流感病毒特征.第3章 培养基的制备. 第3.1节 禽流感病毒的采集分离纯培养. 第3.2节 禽流感病毒分离.第4章 禽流感病毒的显微镜下形态.第5章 禽流感病毒的生长繁殖方式.第6章 禽流感病毒的鉴别方式.第7章 禽流感病毒是怎么传染到人的 第7.1节 禽流感诊断技术. 第7.2节 禽流感病毒是如何传染到人的.第8章 禽流感药物研发. 第8.1节 药物研发理由. 第8.2节 新药研发初现曙光.第9章 基因工程制药 第9.1节 现代生物技术基因工程. 第9.2节 我国基因工程制药产业现状分析. 第10章 微生物对中药发酵的作用. 第10.1节微生物类群为中药发酵提供了充足的选择余地. 第10.2节 发酵制药的意义.结 论参考文献前 言禽流感是禽流行性感冒（Avian Influenza，AI）的简称，这是一种由甲型流感病毒的一种亚型引起的传染性疾病综合征，被国际兽疫局定为类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。禽流感是A型流感病毒引起的，对于鸟类的一种感染性疾病1。由于它可能对所有的鸟类都有感染作用，有些鸟类即使携带了这种病毒也不会产生特定的表状。现阶段科学界讨论最多的是高致病性禽流感，高致病性的病毒最初是1878年在意大利发现，具有突然发作，传染迅速的特点，感染的鸟类一般在48小时内死亡率达到近100%，被称为埃博拉病毒。禽流感病毒基因组由8个负链的单链RNA片段组成。这8个片段编码10个病毒蛋白，其中8个是病毒粒子的组成成分（HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA），另两个是分子质量最小的RNA片段，编码两个非结构蛋白NS1和NS2。NS1与胞浆包含体有关，但对NS1和NS2的功能目前尚不清楚。现在已经获得了包括H3、H5和H7在内的几个禽流感病毒亚型HA基因的全部序列以及所有14个血凝素基因的部分序列。禽流感病毒一般为球形，直径为80120纳米，但也常有同样直径的丝状形态，长短不一。病毒表面有1012纳米的密集钉状物或纤突覆盖，病毒囊膜内有螺旋形核衣壳。两种不同形状的表面钉状物是HA（棒状三聚体）和NA（蘑菇形四聚体）。禽流感病毒粒子大约由0.8%1.1%的RNA，70%75%的蛋白质，20%24%的脂质和5%8%的碳水化合物组成。脂质位于病毒的膜内，大部分为磷脂，还有少量的胆固醇和糖脂。几种碳水化合物包括核糖(在RNA中)、半乳糖、甘露糖、墨角藻糖和氨基葡糖，在病毒粒子中主要以糖蛋白或糖脂的形式存在。病毒蛋白及潜在的糖基化位点是病毒基因组特异的，但病毒膜的糖蛋白或糖类链的脂质和碳水化合物链的成分，是由宿主细胞确定的。感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。研究表明，原本为低致病性禽流感病毒株（H5N2、H7N7、H9N2），可经69个月禽间流行的迅速变异而成为高致病性毒株（H5N1）。第一章 课题研究价值第1.1节 选题背景近年来，禽流感（Avian Influenza）先后在亚洲等一些国家局部爆发，逐渐由东南亚向欧洲扩散，日趋严重，引起了世界各国的高度重视。世界卫生组织（WHO）2005 年10 月24 日公布最新人类感染H5N1 禽流感病例，自2003 年底以来，共有121 件病例，62 未死亡。到现在为止，约有1.5 亿只禽鸟因病死亡，造成的直接经济损失高达30 亿关元。当前，禽流感的发生和流行，不但造成了巨大的经济损失，而且危及到人类身体健康，禽流感的防控已经成为全球瞩目的焦点之一。本文通过对禽流感病毒的病原治病的分子基础、流行病学、临床特征及防治措施等方面的研究现状进行综述，旨在了解感染禽流感的研究进展，为人感染禽流感的有效防控提供科学依据。第1.2节 研究目的与研究方法1.2.1 研究目的禽流感（Avian Influenza，AI），是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）引起的禽类的一种烈性传染病.由于AI 具有临床症状复杂，病死率高，病原体亚型多以及容易发生抗原漂移和转换等特点，使其防治难度加大，相应地造成了严重的经济损失，影响畜禽业的发展。1997 年在香港发生的AIV 感染人的事件，突出了其公共卫生意义。本文就AI 的病原学，流行病学，发病机制，临床表现与诊断，防治等方面进行综述，目的是在丰富专业数据库的同时，增加公众对AI 的大体了解，便于普及AI 的预防知识和应急处理。1.2.2 研究方法1.2.2.1宿主中流感病毒受体的研究通过对多种动物中H5N1毒株的分离及对多种动物血清中抗H5N1的研究, 已发现除禽以外, 多种哺乳类动物也可感染, 其中包括虎、豹、猪、犬等。日本学者Kida认为被AIV感染者中在其咽喉部的细胞具有一种多糖受体a一2,3相连的唾液酸(SA)受体糖链。这一种受体与多数人的主要受体a一2,3相连的SA不同, a一2,6糖链与AIV结合, 导致病毒人侵并复制, 而a一2,6受体仅与人流感病毒结合。目前正在越南寻找经感染后的存活者进行受体研究, 希望发现不同比例a一2,3与a一2,6 , 以证实这一推断是合理的。Ibricevic等对小鼠及人肺细胞受体进行了模拟试验。通过将呼吸道上皮细胞进行培养, 并实施鼠体内感染, 他们发现在人、鼠中, a一2,3连接的SA受体在肺上皮细胞及纤毛呼吸道细胞中均存在。但是a一2, 6相连的受体在鼠中并不表达, 因此有些流感病毒株不会感染鼠。在人呼吸道上皮细胞,a2, 6相连的SA不仅表达而且在纤毛细胞及杯状细胞中都具有功能, 可以与相应的病毒相结合。因此,鼠动物模型可用于研究仅与a一2,3SA结合的毒株,而分化的人呼吸道上细胞培养可用于评估一些毒株是否容易感染人的一种工具。1.2.2.2诊断AIV技术为建立可靠又准确的诊断的方法,Das等建立了一个内参阳性对照设计是应用AIV的基质基因为靶, 可用于实时聚合酶链反应或反转录一聚合酶链反应。应用后一方法在血、肾、肺、脾、肝中发现有对这一技术的抑制物。应用冻干珠子则可提高检测的敏感性。应用这一方法对禽类AIV分离的阳性符合率可达97%100%, 对泄殖腔病毒分离阳性符合率可达81%。Di等则报道了在禽中除用RRT_PCR外, 用1个阴探针进一步排除假阳性结果, 可用于现场标本的检测。 图1.1 禽流感病毒第二章 禽流感病毒第2.1节 禽流感的基本概念2.1.1 禽流感病毒概念甲型流感病毒呈多形性，其中球形直径80120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素（H）/和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性的不同，可分为16个H亚型（H1H16）和9个N亚型（N1N9）。感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。研究表明，原本为低致病性禽流感病毒株（H5N2、H7N7、H9N2），可经69个月禽间流行的迅速变异而成为高致病性毒株（H5N1）。不仅是鸡，其它一些家禽和野鸟都能感染禽流感。按病原体的类型，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。非致病性禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状，食量减少、产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重，发病率和死亡率高，感染的鸡群常常“全军覆没”。2.1.2 禽流感病毒分类禽流感病毒为A 型禽流感病毒，属于正粘病毒科,外观形态为直径80-120nm 的球状或长达数千纳米的丝状。流感病毒依据其核蛋白（NP）抗原性的差异分为A、B、C 三型，而依其外膜血凝素（hemagglutinin，HA）抗原和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的不同,目前可分为15 个H 亚型（H1-H15）和9 个N 亚型（N1-N9）,不同型别和亚型分别在基因组结构、多肽构成、感染性和致病性等方面存在差别。禽流感病毒种类是根据HA和NA的不同来划分的，现已发现病毒有16种HA和9种NA1，因此，理论上应该有144种病毒。但HA和NA都具有很高的变异性，随着病毒的不断进化，新的种类有可能还会产生。到目前为止，所有禽流感的爆发都是由H5和H7亚型引起的。正常情况下禽流感病毒是具有种属特异性的1,2，但近年来，感染人类的报道越来越多，极大地引起人们的恐慌。在众多种的禽流感病毒中，只有四种亚型可以感染人类：H5N1, H7N3, H7N7和H9N2。这其中，除了H5N1型具有较高的致病性，能导致大规模流行以外，其它三种对人群危害不大，只能产生微弱的效应。本文着重介绍了高致病性禽流感病毒的分子进化机制及其与人流感的关系，病毒疫苗和药物的研究进展等。第2.2节 禽流感的特征2.2.1 禽流感的生物学特征禽流感病毒属于正黏病毒科，RNA病毒3,4。形态近似球形，直径80120nm，病毒的外面有包膜，包膜内部为螺旋对称的核衣壳。其基因组由八条独立的单链负股RNA组成：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS。其中，PB2、PB1、PA分别编码病毒的RNA聚合酶的亚基，三者共同组成RNA聚合酶；HA编码血凝素蛋白，参与受体的识别，是基因组中变异率最大的一个片段；NP编码病毒的核衣壳蛋白，与基因组RNA、病毒RNA聚合酶一起构成核酸核蛋白体RNP；NA编码神经氨酸酶，包膜糖蛋白，可裂解唾液酸和附近的糖间的糖苷键，协助子代的释放，还有协助HA切割的功能；M编码基质蛋白，一种多功能因子，可以作为病毒的结构蛋白和调节蛋白；NS编码NS1、NS2两个非结构蛋白，具有控制有关基因表达的功能5,6。高致病性病毒存在于被感染的鸟类的整个身体中及周围环境中，呼吸道和肠胃中含量最大，并可以垂直遗传。一般说来，在4时病毒可以在禽类粪便中存活至少35天，37时仅能存活6天。在有机物中，如动物的粪便，肌肉等受到保护，可以存活更久。禽流感病毒低温下适应能力比较强，而对高温敏感，正常的烧煮70左右即可灭活7。同时，和其他有囊膜的病毒一样，其对乙醚、丙酮等有机溶剂抵抗力较弱，可迅速失活；在直射阳光下，经40-48小时即失去活性8。22.2 感染机制病毒进入体内后，由HA识别特异的受体（一般是唾液酸），进行结合吸附。然后经过内吞作用进入细胞浆，形成吞噬小泡。吞噬小泡与溶酶体的融合可能使细胞内pH值下降，HA 的构象发生改变，经过宿主细胞蛋白水解酶的作用，裂解成HA1和HA2两部分。HA2的氨基端插入小泡脂膜，促使病毒囊膜与吞噬泡膜融合，这样病毒RNA释放到胞浆，开始下一代复制过程9。 2.2.3 分子进化机制从最早的200多年前的爆发，到今天，高致病性禽流感病毒发生了极大的进化变异，并开始跨越种属界限，感染哺乳动物。其主要的分子进化途径有两条： 2.2.4 禽流感与人流感很多专家指出，禽流感很可能是1918年西班牙流感的变种。或者，更确切地说，人类和鸟类的H1N1型病毒源自同一个祖先种。Jeffery K. Taubenberger等在对1918年在哺乳动物分离病毒的HA，NA，NP基因分析表明15：很可能早在1918年以前，就已经有一个祖先种感染过了哺乳动物。而且1918的西班牙流感病毒本身就是一个重组体16，它的HA蛋白的球形头部由部分猪流感病毒的基因编码，而柄由人类流感病毒的部分基因编码。第3章 培养基的制备近年来,国家对家禽禽流感强制免疫和养殖业相关人员对禽流感防控的高度重视,我国禽流感疫情总体上呈逐年下降的趋势。但目前,无论是高致病性禽流感还是低致病性禽流感,仍然是严重威胁养禽业的大敌。自2004年以来,中国内地相继暴发高致病性禽流感,不仅沉重打击了国内的养禽业,而且对我国的经济和贸易发展也造成了严重的影响。自1933年利用鸡胚培养流感病毒获得成功以来,鸡胚就成为人们大量获得流感病毒的主要来源。但是用鸡胚分离流感病毒或传代易引起病毒变异,而且鸡胚残留物还可能引起过敏性反应。鸡胚作为疫苗生产基质,还存在大规模生产时供给困难和潜在的外源病毒污染问题。近年来,随着禽流感的频繁暴发以及跨种属传播,人们认识到需要研究一种可在流感大规模流行时能够替代鸡胚快速、大量生产流感病毒的细胞培养系统。应用MDCK细胞系培养流感病毒不仅解决了鸡胚蛋白遗留物和外源病毒污染的问题,而且培养的病毒免疫原性更为稳定。利用低血清培养基或者无血清培养基培养流感病毒的研究可以进一步解决病毒抗原制备后的血清处理问题,国外已有很多学者对此进行了探讨。笔者探讨3株H9亚型禽流感病毒在3种培养基中的增值效果，旨在确定H9亚型禽流感病毒的培养条件。病毒不具备细胞结构，不能独立生存要借助寄主细胞才能完成繁殖等生命活动。所以培养甲流病毒不能用普通培育基(普通培养基一般指含有细胞或生物生存所需全部营养物质的培养基，不包含活细胞)一般用鸡蛋，活鸡胚等。 第3.1节 禽流感病毒的采集分离纯培养3.1.1 标本的采集与处理 3.1.1.1 标本的采集病毒分离成功与否很大程度上取决于采集标本的质量，及其保存、运输等环节。多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物，有时也采用肺活检材料等。标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，常用的采样液为：普通肉汤，pH7.4-7.6的Hanks、Eagles或水解乳蛋白液。为防止细菌和真菌生长，在采样液中需加入抗菌素，以往抗菌素多用青、链霉素，近来发现不少种类细菌对它们具有耐药性，故近来多用庆大霉素（其终浓度为每ml采样液中加入0.1 ml的10mg/ml）和抗真菌药物（终浓度为每毫升采样液中加入0.008 ml的250ug/ ml）。主要的采集方法有以下几种：1)鼻拭子：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入4-5 ml采样液中，尾部弃去。2)咽拭子：用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将棉签头浸入4-5 ml采样液中，尾部弃去。注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。3)鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器（国外有售）从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器3次。由于该收集器国内难买到，也可采用国内一种设计装置（见郭元吉、程小雯著，流行性感冒病毒及其实验技术。中国三峡出版社P186，1997）。4)鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将1-1.5ml洗液注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使洗液流出，用平皿或烧杯收集洗液。重复此过程数次。洗两侧鼻孔最多可用10-15 ml洗液。5)漱口液：用10 ml洗液漱口。漱时让患者头部微后仰，发“噢声”，让洗液在咽部转动。然后，用平皿或烧杯收集洗液。注：取鼻洗液和漱口液时，需预先了解患者是否对抗菌素有过敏史，如有则洗液和含漱液中不应含有抗菌素。 3.1.1.2 血清标本采集血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。急性期血样应尽早采集，最迟不超过发病后7天。恢复期血样应在发病后2-4周采集。单份血清一般不能用作诊断。血液标本2000-2500rpm离心15min。收集血清，弃血凝块。血清可在4存放一周，长期保存置-20。 3.1.2 标本运送标本应在低温下，24小时内运送至实验室。标本至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，48h内能进行接种的可置于4保存，如未能接种应置-70或以下保存。血清标本可在4存放一周，长期保存置-20或以下。 3.1.3 标本处理标本至实验室后，含棉拭子的标本，先将棉拭子在管壁反复挤压后取出。鼻腔或咽部洗液，用手将装标本的管充分振荡，将粘液打碎。置4待其自然沉淀5-10min，取上清5 ml。上清液可直接接种或低温保存。鼻咽漱液或抽取液：用无菌毛细吸管，在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液，同样置4待其自然沉淀5-10min，取上清5 ml。上清液可直接接种或低温保存。注：如采样液中尚未加抗菌素，应在接种前补加，用量同前，混匀后置4 1-2h后方可接种。第3.2节 禽流感病毒分离病毒分离是流感诊断最常用和最可靠的方法之一。多用鸡胚来分离流感病毒。近来随着分子生物学技术的发展，发现通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与原始标本的有所不同，而通过MDCK细胞分离出的，其抗原性与原始标本的相似。另外由于“O”相毒株的重现，MDCK等一些细胞对“O”相毒株的敏感性大大超出鸡胚的敏感性。因此，MDCK等一些细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此在病毒分离时同时采用鸡胚和MDCK细胞两套系统。流感病毒“O”相毒株不凝集鸡红细胞，故近来在流感病毒鉴定中常用豚鼠或人红细胞来代替。然而，该两种细胞无细胞核，沉积慢，一般在红细胞凝集及凝集抑制测定中需60分钟才能观察结果，同时在“U”型孔板中，很难沉积成像眼泪样的点即当中常有小空洞。 3.2.1 MDCK细胞分离 3.2.1.1 实验材料MDCK细胞、Eagle氏培养液、Hanks溶液、0.25%胰酶和Versene消化液、双抗（青、链霉素）或庆大霉素和抗真菌素、胎牛或小牛血清、5.6%或7.5%的NaHCO3。细胞培养液配制每500 ml Eagles 液加：终浓度双抗 5100U/ml青霉100ug/ml链霉素胎牛或小牛清0.1-0.15ml/ml使用前用NaHCO3 将pH调至7.4-7.6。 细胞维持液配制同培养液，但不含胎牛或小牛血清，而含终浓度为2-3 ug/ ml 胰酶，用前用NaHCO3 将pH调至7.6-7.7。注：目前市场上出售已配好的Eagles试剂有两种：一种已含有谷氨酰胺，另一种不含。如不含，配工作液时需补加。 3.2.1.2 病毒接种和收获1)在低倍光学显微镜下检查MDCK细胞生长状态。2)成片的细胞弃生长液，用Hanks液洗两遍，将残余的牛血清洗净，因牛血清中含有流感病毒非特异性抑制素，会影响流感病毒的复制。3)每瓶加入接种标本0.5-1.0 ml，轻摇细胞瓶，使标本完全覆盖细胞，置35吸附1-2h。4)倒掉感染液，再用Hanks液洗1-2遍，每瓶加入3 ml维持液，置35培养。5)次日起每天检查有无细胞病变（CPE）。CPE特征为：细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或碎裂，严重时细胞部分或全部脱落。6)收获及红细胞凝集活性（HA）检查当CPE出现+ +号时进行收获，收获之前也可将细胞冻融1-2次来提高收获标本的病毒滴度。由于无法证实CPE就是流感病毒所造成。最后还得看维持液中是否有红细胞凝集活性（HA）。用毛细吸管取维持液3-4滴，放入血凝板孔中，而后加入等容量的1%豚鼠或人红细胞，轻摇混之，置室温或4，1h后观察结果。出现红细胞凝集的为阳性标本，收获所有维持液进行病毒鉴定，也可暂冰存之。有时将收获的维持液，离心弃沉渣，上清中加适量无菌甘油或明胶或1%牛血清白蛋白冻存之。由于维持液中无牛血清，同时含一定量的胰酶和NaHCO3，故不应在4保存，否则易造成HA活性丢失和pH变高。如有清晰的CPE，但HA阴性应进行盲传。注：维持液中加适量胰酶的目的是为了提高流感病毒在细胞中的复制能力。绝大多数流感病毒只有血凝素（H）是裂解型的才具有感染性。细胞培养不像鸡胚，它的维持液中不含有蛋白水解酶，无法将病毒粒非裂解型的HA0 变成裂解型的HA1+HA2。故必须在维持液中加入适量的胰酶。CPE出现时间随感染病毒的型别，甚至毒株的差异以及感染量的大小而异。一般标本接种后7天还不出CPE，维持液中又查不出HA活性，可认为阴性标本，弃之。7）传代及盲传如收获的维持液HA滴度不高或量不够用于鉴定，需在MDCK细胞或鸡胚中传代，把HA滴度提高或量增多。如HA可疑，细胞CPE清晰，此时应在MDCK细胞上盲传一代，如仍测不出HA，可认为是阴性。如仍有清晰的CPE并能排除细菌所引起也可认为是非流感病毒。 3.2.1.3 MDCK细胞传代(1)把需用的溶液置室温或37水浴中预热。(2)已成片的MDCK细胞，将其生长液倒掉。(3)把Versene与0.25%胰酶按7：1比例配成消化液，每小瓶加入消化液3 ml（加入量应根据瓶大小不同而异）。(4)置37恒温箱5-10min，在此期间应在光学显微镜下观察1-2次，当细胞变圆，细胞与细胞间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成片，表明消化时间未到。但千万不可消化时间过长，造成大量细胞从瓶壁上脱下，甚至造成破碎。(5)倒掉消化液，每瓶加入9 ml培养液，用毛细吸管将瓶壁上细胞轻轻吹下吹散。(6)吸出6 ml接种2小瓶，3 ml/瓶，将原瓶留下，置37恒温箱培养。(7)一般情况下，1瓶细胞传3瓶，如细胞急用，可一传二。不急用，可一传四等。有时为了控制细胞的代数，可一传八，这样一星期传一代就可以了。一般情况每2-3天需传一代。 3.2.1.4 MDCK细胞保存及复苏 MDCK细胞对流感病毒的敏感性随其代数增加而下降，故各实验室应使用液氮冻存代数较低的细胞作为种子。一般保存液为含10%二甲基亚砜和90%小牛血清。（1）MDCK细胞保存将单层细胞消化分散成为单细胞；加入0.9 ml小牛血清和0.1 ml二甲基亚砜；相混收集于保存小管中；缓慢冻存：放42h，转放-202h，再转放液氮中长期保存，也可置-70短期保存。（2）MDCK细胞复苏细胞冻存管从液氮罐取出后，速放37水浴溶化，溶化后加入3 ml培养液，混均后加入细胞培养瓶中，置37CO2孵箱培养。（3）MDCK细胞对流感病毒敏感性测试前面提到MDCK细胞对病毒的敏感性随其代数增加而下降。故MDCK细胞在实验室传20代以上时，一般需测试一下其对流感病毒的敏感性。其具体测试方法：选一株对MDCK细胞较敏感的流感病毒株，最好为当前在人群中流行的甲型流感病毒。在同一条件下，用早代与要测试的MDCK细胞对其进行TCID50测定。如果测试的TCID50比早代的低2个或以上Lg，表明其对病毒的敏感性已下降，不应继续使用；如果两者相差不超出一个Lg，表明可继续使用。3.2.2 鸡胚分离及HA测定1、实验材料9-11日胚龄鸡胚及验蛋器。禽流感分离时，必需用SPF鸡胚。2.5%碘酒和75%酒精及液体石蜡。钻孔器，蜡和胶布及照卵灯。1 ml注射器和针头。镊子，毛细吸管，橡皮乳头，试管架，试管。采集的标本。2、实验步骤(1)接种（羊膜腔和尿囊腔接种即双腔法）。1)接种前先用验蛋器检查鸡胚，弃去死胚，未受精卵及不健康的鸡胚。画出气室边缘和胚胎位置。2)在气室端靠近胚胎侧之卵壳上钻一长方形裂痕（约106mm）或两条相隔3 mm的10 mm长的平行裂痕，勿损伤壳膜。3)钻口处用75%酒精消毒，用消毒过镊子除去长方形卵壳和壳膜外层（壁层）或将平行裂痕撕成长方形。4)从孔中滴入一滴无菌的液体石蜡，然后，轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在壳膜内层（脏层）铺开，此时在照卵灯下即可清晰地看到鸡胚的位置。5)注射器吸取处理过的标本0.4 ml，将注射针头刺入胚胎的颚下胸前，用针头轻轻拨动下颚和腿，当针头进入羊膜腔时，能见到鸡胚随着针头的拨动而动，此时可注入0.1-0.2ml接种物，而后，将针头退出至尿囊腔再注射0.1-0.2ml接种物。6)注射器取出，用沾有碘酒通过火焰的小块胶布封口。7)置35恒温箱孵育72h。(2)收获1)收获前先将鸡胚移至4过夜，或置-20冷冻1h。快速冷冻时间不易过长，一旦鸡胚冻成冰块就无法收获。4冷藏也不宜过长，过长易造成散黄，影响收获。2)75%酒精消毒鸡胚气室部分。3)用无菌镊子将消毒过的壳打碎，再用另一把无菌镊子将壳膜和绒毛尿囊膜撕开，并将鸡胚轻轻推向一侧，压住。4)用毛细吸管先收尿囊液，然后左手持小镊子夹起羊膜成伞状，右手用毛细吸管插入羊膜腔吸取羊水，平均每胚可收获0.5-1.0 ml羊水。如羊水过少，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取洗液。(3)HA活性测定尿囊液和羊水分别取3-4滴于血凝板孔中，加等容量1 %豚鼠或人红细胞，摇匀，置室温或4 1h，而后观察结果。HA阳性标本须进行鉴定。标本可置4保存3-4天，长期保存应置-70或以下低温冻存。(4)传代与盲传HA滴度过低或收获的量过少（如羊水），应按上法进行传代来获得足够量的病毒。HA测定可疑的标本应按同法盲传一代，如再阴性，可认为阴性，弃之。一般流感监测中，每份标本可只接种2-3个鸡胚，当羊水和尿囊液中查不到HA活性，可认为阴性标本，不必进行盲传。第4章 禽流感病毒的显微镜下形态这是美国疾病控制和预防中心公布的一张电子显微照片，它显示出H5N1型禽流感病毒（金黄色）在MDCK细胞（绿色）培养液中的活动状态。第5章 禽流感病毒的生长繁殖方式病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微非细胞微生物，其本质是一类含DNA或RNA的特殊遗传因子。特征：1、形体十分微小，滤过，电镜可见；2、无细胞结构，分子生物，由核酸和蛋白组成，且一种病毒仅含一种类型核酸；3、专性活细胞内寄生，有宿主专一性，无独立代谢酶系，依赖宿主自身复制；4、对抗生素不敏感，对干扰素敏感。形态、结构和化学组成1、大小：20200nm,多在100nm左右。2、病毒粒子 (病毒颗粒）构造成分：核酸-核心、蛋白-衣壳 核衣壳衣壳粒 包膜（类脂或脂蛋白）病毒粒子对称体制：螺旋对称（TMV）二十面体对称（腺病毒）功能：核酸：遗传物质基础蛋白：构成外壳，保护病毒免受核酸酶及其它因子破坏；决定感染特异性；决定抗原性。形态：球状（动物病毒）；杆状（植物病毒）；蝌蚪状（微生物病毒）群体形态：病毒包涵体、噬菌斑。噬菌体：多为蝌蚪状，结构模式图。头部为二十面体对称，尾部为螺旋对称。病毒的分类：植物病毒：多含DNA，少数含RNA 动物病毒：DNA或RNA 微生物病毒：多含DNA，少数含RNA4类病毒及其繁殖方式噬菌体繁殖（烈性噬菌体为例）1、吸附2、侵入：头部DNA通过尾管注入至细胞中，外壳留在胞外。自外裂解3、增殖：包括DNA复制和蛋白质合成。双链DNA噬菌体三阶段转录，遗传信息转移。4、成熟（装配）：潜伏期5、裂解（释放）：裂解期上述烈性噬菌体的生长方式，称为一步生长。一步生长曲线：（潜伏期（隐晦期，胞内累积期）、裂解期、平稳期）裂解量：每个被感染的细菌释放新的噬菌体的平均数。植物病毒：大多数为ssRNA病毒，基本形态为杆状、丝状和球状（二十面体），一般无包膜。 植物病毒的增值过程与噬菌体相似，但在细节上有所差别。因它们一般无特殊吸附结构，故只能以被动方式侵入。在植物组织中，则可借细胞间连丝而实现病毒粒的扩散和传播。与噬菌体不同的是，植物病毒必须在侵入宿主细胞后才脱去衣壳即脱壳。人类和脊椎动物病毒：脊椎动物病毒的种类有很多，根据其核酸类型可分为dsDNA和ssDNA病毒以及dsRNA和ssRNA病毒，其衣壳外有的有包膜，有的无包膜。增值过程也与噬菌体和植物病毒相似，只是在一些细节上有所不同。大多数动物病毒无吸附结构的分化。少数病毒如流感病毒在其包膜表面长有柱状或蘑菇状的刺突，可吸附在宿主细胞表面的黏蛋白受体上，腺病毒则可通过五邻体上的刺突行驶吸附功能。吸附之后，病毒粒可通过胞饮、包膜融入细胞膜或特异受体的转移等作用，侵入细胞中，接着就发生脱壳、核酸复制和衣壳蛋白的生物合成，再通过装配、成熟和释放，就形成大量有侵染力的子代病毒。第6章 禽流感病毒的鉴别方式从20世纪90年代中期起，我国在禽流感的流行病学、诊断、免疫防治及基础研究等方面做了大量的工作并取得了多项研究结果。禽流感诊断技术方面，已建立：（1）琼脂扩散（AGP）诊断技术。（2）禽流感病毒亚型分型技术。（3）禽流感病毒分子诊断与检测技术。禽流感疫苗研制方面：已研究出了可用于H5亚型高致病性禽流感紧急免疫预防接种的H5亚型禽流感灭活疫苗。H5N1亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗，也已进入环境释放阶段的安全性评价。高致病性禽流感必须通过病毒的分离、鉴定来确诊。病毒的分离及亚型鉴定一般至少需要35天。病毒的致病性必须通过人工静脉接种无特定病原鸡（SPF鸡）来最后确定。根据农业部关于印发高致病性禽流感防治技术规范等7个重大动物疫病防治技术规范的通知（农办牧200274号）规定，有下列情况的，可确认为发生高致病性禽流感：（1）有典型的临床症状和病理变化，发病急、死亡率高，且能排除新城疫和中毒性疾病，血清学检测阳性。（2）未经免疫鸡场的家禽出现H5、H7亚型禽流感血清学阳性。（3）在禽群中分离到H5、H7亚型禽流感毒株或其他亚型禽流感毒株。流感病毒根致病性大小分为高致病性禽流感病毒（HP禽流感病毒）、低致病性禽流感病毒（LP禽流感病毒）与无致病性禽流感病毒（NP禽流感病毒）。鉴于HP禽流感病毒的重要性，特将其有关鉴定标准和程序介绍如下：世界动物卫生组织对高致病性禽流感病毒的分类标准是：（1）用0.2毫升1：10稀释的无菌感染流感病毒的尿囊液，经静脉注射接种8只48周龄的易感鸡，在接种后10天内，能导致67只或8只鸡死亡，这些流感病毒应属于高致病性。（2）分离物能使15只鸡致死，但病毒不是H5或H7亚型，则应进行下列实验：将病毒接种于细胞培养物上，观察其在胰蛋白酶缺乏时是否引起细胞病变或形成蚀斑。如果病毒不能在细胞上生长，则分离物应被考虑为非高致病性禽流感病毒。（3）对低致病性的所有H5和H7毒株和其他病毒，在缺乏胰蛋白酶的细胞上能够生长时，则应进行与血凝素有关肽链的氨基酸序列分析，如果分析结果同其他高致病性禽流感病毒相似，这种被检验的分离物应被考虑为高致病性禽流感病毒。诊断很大程度上依赖于样品的质量、样品在进行实验室处理前的储存和运输过程的情况。用于细胞培养、鸡胚接种、直接检测病毒抗原或核酸的呼吸道病毒的样品，应在流感症状出现的开始3天进行采集。禽流感主要由呼吸道和消化道感染。因此，哺乳动物及禽类上呼吸道采集的样品适合用于流感病毒的鉴定和诊断。上呼吸道拭子分为三种：鼻棉拭子、喉棉拭子和气管棉拭子。已屠宰或已死亡的哺乳动物应在下呼吸道采集样品，样品分为气管棉拭子、支气管棉拭子、肺组织等三种。禽类样品采集的部位应集中在呼吸道和大部分的消化道，采集的病毒样品种类包括泄殖腔棉拭子和粪便，其中泄殖腔棉拭子可从活体鸡或剖杀的鸡群中采集，从鸡舍或环境中采集粪便样品是常用的采样方法，但其具有不能确定样品的准确来源的缺点，如果怀疑死禽体内含有高致病力的禽流感病毒，还应采集有代表性的内脏器官如脑、脾脏、心脏、肺脏、胰腺、肝脏和肾脏以及呼吸道、消化道等部位的标本。如果想通过对感染细胞进行免疫荧光染色的方法直接检测病毒，那么采集的病料应放在冰浴中，在12小时内进行样品处理。用于分离病毒的样品，采完样后应立即将病料放在冰箱中冰冻，并尽可能早地接种于敏感细胞或鸡胚。如果样品不能在4872小时内处理，应冷冻在-70或以下。如果装样品的试管没有被密封，或者装样品的塑料袋封闭不严，则样品不能放在干冰中运输或储存。因为如果一旦干冰接触到病料样品，就能很快地灭活其中可能存在的流感病毒。采集的样品应放在适宜的运输缓冲液中才能确保病毒的分离。目前已有一些适用于不同病毒样品的运输缓冲液，例如Hanks平衡盐溶液、细胞培养液、磷酸盐缓冲液、胰蛋白胨磷酸肉汤、犊牛肉汤和蔗糖磷酸缓冲液等，在这些运输缓冲液中应添加0.5%1%的蛋白质，例如牛血清白蛋白、明胶，还应添加抗生素以防止细菌的生长。病理样品一般应在感染初期或发病急性期从死禽或活禽采取。死禽采集气管、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、泄殖腔等组织样品。活禽用大小不等的灭菌棉拭子涂擦喉头、气管或泄殖腔，带有分泌物的棉拭子放入每毫升含有1000国际单位青霉素、2000微克链霉素、ph7.27.6的肉汤中，无肉汤时可用hanks液或25%50%的甘油盐水。粪便和泄殖腔棉拭子所用抗生素浓度应提高。样品的运送和保存：采集的样品若在48小时内进行检查，可放入4保存；否则应放于低温条件下保存（-70贮存最好）。（1）流行病学禽流感病毒的宿主广泛，鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉鸡等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染。其中以鸡和火鸡感染禽流感病毒后的危害最为严重，而在鸭中分离到的病毒比其他禽类多。各种日龄的禽均可感染。禽流感病毒主要通过患禽间（包括与患禽接触的器具）的直接接触和间接接触传染。此外，带毒的飞鸟或水禽常常成为传染源，引起家禽大批地发病和死亡。（2）临床症状禽流感的潜伏期从几小时到3天不等，潜伏期的长短依赖于感染病毒的毒力和剂量、感染途径、被感染禽的种别和禽体的状态。急性感染的禽流感无特定临床症状，在短时间内可见食欲废绝，体温骤升，呼吸道症状，下痢，后期出现神经症状。伴随大量死亡。（3）病理变化禽流感的病理变化因感染毒株毒力的强弱、病程长短和禽种的不同而变化不一。主要表现为头肿，肉髯、冠出血、小腿和趾部皮下出血、水肿、腺胃乳头出血及输卵管炎等。（4）病原学诊断病毒分离需由国家规定实验室完成。（5）血清学诊断目前用于禽流感检测的方法有禽流感病毒分离技术、琼脂扩散（AGP）试验、血凝抑制（HI）试验、神经氨酸酶抑制（NI）试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、病毒中和试验（SN）、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、免疫荧光技术（IF）及核酸探针技术。禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，按说明书操作。总之，对禽流感的诊断，实验室病毒的分离、鉴定，以及致病性试验都耗时较长，花费也较高，只有极少数的实验室能进行此项检查，在收到检查样品后不能在较短时间（48小时）内做出确诊，确诊滞后于现场采取措施的要求。禽流感这类疫病的确诊越快、越早，损失就越小。当疑有禽流感发生时，应及时上报疫情，以求得有关专家及时诊断是十分重要的。由于禽流感感染引起的流行特点、症状及病理变化与某些禽的传染病相似，必须及时做出鉴别诊断，如鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、传染性鼻炎、支原体病、衣原体病、产蛋下降综合征等；特别是某些疾病的混合感染或继发感染，使病情更为复杂，给诊断带来困难或容易发生误诊。因此，类症鉴别诊断十分重要。首先是与新城疫的鉴别诊断。禽流感与鸡新城疫的流行特点、症状、病变很相似。一般来说，高致病性禽流感的潜伏期和病程比国内目前发生的新城疫为短，新城疫病鸡的呼吸困难，嗉囊和口中的积液，呼吸困难时的咕咕叫声，典型的神经症状等各种表现、常规的典型病变，都较禽流感明显和具有特征性，加之，现场新城疫的紧急免疫效果等，都与禽流感不同。但有的也无明显的不同，两病的准确鉴别诊断，只能依靠实验室的诊断，最简便、实用的方法是病毒分离和血凝抑制试验（HI）。新城疫抗血清抑制不了禽流感病毒的血凝作用，反之亦然。禽流感与其他几种疫病的鉴别，根据流行特点、症状、病理剖检和实验室检查（病原学、血清学）等综合分析，是可以区别开的。同样，继发或并发细菌病或病毒病时，通过病原分离和某些检测方法便可确定。第七章 禽流感病毒是怎么传染到人的第7.1节 禽流感诊断技术禽流感诊断技术可分为血清学诊断技术和分子生物学诊断技术。 血清学诊断技术 HA( 血凝素)HI(血凝素免疫)试验：常用于AIV 的HA 亚型鉴定的方法。试验繁琐，特异性好。但由于用已知HA 型的血清不能检出新的HA 亚型的AIV，所以该方法有一定局限性。l 神经氨酸酶抑制试验：(NW)：用于AIV 另一种表面抗原，即神经氨酸酶的亚型鉴别。80 年代后期已逐渐采用96 孔板微量NIT 试验法，此法不仅可降低Ag(抗原)用量，而且可以对多种分离物进行Ag 分类。WHO(世界卫生组织)推荐此法用于NA 亚型分类。用1-9 型NA 抗血清加入各种试剂，经实验处理后用颜色来鉴别NI 的阳性和阴性。根据结果可判断AIV 的NA 亚型。注意，为了避免病毒扩散污染危险，HA,HI,NIT 试验都必须在P2P3 级试验室进行。 病毒中和试验(VNT):试验操作繁琐，临床上很少使用，但作为经典方法，它可以作为其他新的检测方法的比较标准。 琼脂凝胶扩散试验(AGP)：AGP 是在琼脂凝胶中进行的抗原抗体免疫沉淀反应。简便、快捷，既可定性又可以定量，70 年代以后开始将AGP 用于禽流感Ab 检测。由于禽流感不同亚型均具有共同的型特异性Ag，保守性很强，基本不发生变异，所以可以用一种禽流感的Ag 或Ab 对所有A 型AIV 的Ab 及Ag 进行检测。AGP 常用免疫双扩散法。Ag 制备法可参考三I 节的悬液制备或用超速离心浓缩纯化，福尔马林灭活制备Ag 效果很好。在琼脂板中加入3%的PEG-6000，可以提高AGP 的敏感性。除以上方法外，免疫单辐射扩散试验、单辐射溶血试验，对流免疫电泳等也常用于AIV 及其Ab 的检测。但这几种试验都需在凝胶中进行，敏感性差。AGP 所需试剂及Ag，Ab 量较大，限制了它的使用。 免疫荧光技术(IFT)：60 年代开始用于人流感快速诊断，80 年代美国爆发了禽流感时，将IFT 首次用于AIV 检测。诊断时应注意避免或降低样品中出现的假阳性，即非特异性荧光问题。 酶联免疫吸附试验(ELISA)：80 年代开始用于AIV 亚型检测，20 年来各国学者对此法进行了多种研究和改进，已有试剂盒出售。目前ELISA 已成为AI 流行病学普查及早期快速诊断最有效，最实用的方法。 分子生物学诊断技术： 近年来，分子生物学技术已被大量应用于AI 的快速诊断。PCR ，和我国学者创建的逆转录-聚合酶链反应即RT-PCR 具有高度特异性和灵敏性。此外，用单克隆抗体在免疫过氧化酶染色组织中定位病毒抗原;基因探针原位染交可定位组织中参与病毒复制的感染细胞;核酸分子杂交可检测病毒的核酸等等都有很好的应用前景。第7.2节 禽流感病毒是如何传染到人的7.2.1 禽流感病毒感染人须具备的条件：禽流感病毒必须能够接触到人的某些细胞，而禽流感病毒通常在禽类体内，一般情况下是接触不到人体的。但如果人和禽类经常接触，就为禽流感病毒接触人体细胞创造了条件。髵病毒的高突变率，在禽流感病毒与人体长期的不断接触中，这种高突变率就会带来一些意想不到的后果。7.2.2 病毒在人际间传播须完成的过程：从人体内排出髵在气溶胶或者尘粒中稳定留存髶进入到新宿主完成感染。7.2.3 寻找宿主病毒进入细胞需要长期的进化：在历史长期的进化过程中，病毒通过与动物的不断接触，会在自然界寻找到一个合适的宿主。正如一些动物生活在独特的环境里一样，病毒也生活在特定的细胞里，而每种病毒，也必然有它适宜的环境、适宜的细胞、适宜的宿主。“正如鱼生活在水里是一个复杂的过程一样，一个病毒选择哪种细胞作为它适宜的宿主，同样牵扯到非常复杂的环节。”首先，病毒要想感染任何一个细胞，先要接触到这个细胞。病毒与细胞的接触是其完成感染的必要因素。其次，病毒接触到细胞后，不一定就能完成感染。这是因为病毒进入细胞时需要首先结合细胞表面的受体，而病毒能够结合哪一种受体