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第 十 六 章 RNA的生物合成 RNA Biosynthesis n n 掌握：掌握：DNADNA复制和转录的区别复制和转录的区别 n n 掌握：转录模板的特点和所需的酶掌握：转录模板的特点和所需的酶 n n 理解：原核和真核生物转录的过程及二者间的差理解：原核和真核生物转录的过程及二者间的差 异异 n n 熟悉：真核生物熟悉：真核生物mRNAmRNA的加工过程（的加工过程（掌握断裂基掌握断裂基 因、内含子、外显子的概念）因、内含子、外显子的概念） n n 了解：了解：tRNAtRNA和和rRNArRNA的加工的加工 学习目标 学习目标 n在生物界，RNA合成有两种方式： n n 一是DNA指导的RNA合成，也叫转录，此为生物 体内的主要合成方式，也是本章介绍的主要内 容。 n另一种是RNA指导的RNA合成(RNA-dependent RNA synthesis)，也叫RNA复制(RNA replication), 由RNA依赖的RNA聚合酶(RNA- dependent RNA polymerase)催化，常见于病毒， 是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒 的单链RNA为模板合成RNA的方式。 转录 (transcription) 生物体以DNA为模板合成RNA的过程(原料 、原则、酶、方向） 。 转 录 RNADNA 目录 q 复制和转录的相同点 v 酶促的核苷酸聚合； v DNA为模板； v 依赖DNA的聚合酶； v 生成3，5磷酸二酯键； v 5 3方向聚合； v 遵从碱基配对规律。 复制和转录的区别 引物 需要 不需要 参与转录的物质 原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: DNA 酶: RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA-pol) 其他蛋白质因子 模板和酶 Templates and Enzymes 第一节 5 3 3 5 模板链编码链 编码链模板链 转录方向 转录方向 一、转录模板 n不对称转录 不对称转录(asymmetric transcription) 在DNA分子双链上某一区段，一股链用作 模板指引转录，另一股链不转录 ； 模板链并非永远在同一条单链上。 DNA分子上能转录出RNA的区段，称为结构基因 (structural gene)。 DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA 的一股单链，称为模板链(template strand)，也称 作无意义链或Watson链。相对的另一股单链是编 码链(coding strand)，也称为有意义链或Crick链 。 5GCAGTACATGTC 3 3 c g t g a t g t a c a g 5 5GCAGUACAUGUC 3 NAla Val His Val C 编码链 模板链 mRNA 蛋白质 转录 翻译 目录 Roger Kornberg Won Nobel Prize for chemistry 2006. 二、 RNA聚合酶 （一）RNA聚合酶催化RNA链合成的机制 nRNA合成的化学机制与DNA依赖的DNA聚合酶 催化DNA合成相似。 ( NMP )n + NTP ( NMP ) n+1 + PPi RNA延长的RNA nDNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引 物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能 直接启动RNA链的延长。 （二）原核生物的RNA聚合酶（1种） 核心酶 (core enzyme) 全酶 (holoenzyme) 参与转录延伸 参与转录起始 利福平和亚基结合抑制 RNA聚合酶 目录 种类 转录产物 rRNA的前体45S rRNA mRNA前体hnRNA, lncRNA, piRNA, miRNA tRNA, 5S rRNA snRNA 对鹅膏蕈碱 的反应 耐受敏感 高浓度下敏感（ 中度敏感） 细胞内定位核仁核内核内 （三）真核生物的RNA聚合酶 （3种） 均由多个亚基构成，抑制剂鹅膏蕈碱（毒蘑 菇“死亡之伞”） 目录 Amanita phalloides （death cap） -amanitin n真核生物RNA聚合酶的结构比原核生物复杂，所 有真核生物的RNA聚合酶都有两个不同的大亚基 和十几个小亚基. nRNA聚合酶由12个亚基组成，其最大的亚基称 为RBP1。 nRNA聚合酶最大亚基的羧基末端有一段共有序 列(consensus sequence)为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser- Pro-Ser的重复序列片段，称为羧基末端结构域 (carboxyl-terminal domain, CTD)。 CTD对于维 持细胞的活性是必需的。 原核生物的转录过程 The Process of Transcription in Prokaryote 第二节 （一）转录起始 一、原核生物的转录过程 起始 延长 终止 2. DNA双链局部解开，形成开放转录复合体 (open transcription complex) ； 1. RNA聚合酶全酶(2)与模板结合，形成闭 合转录复合体(closed transcription complex) ； 3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形 成转录起始复合物： RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3 转录起始复合物: 5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi n转录起始过程： 4. 亚基脱落 1、模板上酶的辨认、结合 5 3 3 5 结构基因 RNA-pol 调节序列 n转录是不连续、分区段进行的。 n每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵 子(operon)。操纵子包括若干个结构基因及其 上游(upstream)的调控序列。 n调控序列中的启动子是RNA聚合酶最先结合模 板DNA的部位，也是控制转录的关键部位。 n原核生物以RNA聚合酶全酶结合到DNA的 启动子上而起动转录，其中由亚基辨认启 动子，其他亚基相互配合。 n对启动子的研究，常采用一种巧妙的方法 即RNA聚合酶保护法。 RNA聚合酶保护法（Footprinting） 开始转录 T T G A C A A A C T G T -35 区 (Pribnow box) T A T A A T A T A T T A -10 区 1-30-5010-10-40-20 5 3 3 5 原核生物启动子保守序列 RNA-pol辨认位点 (recognition site) 5 5 RNA聚合酶保护区结构基因 3 3 nRNA聚合酶全酶在转录起始区的结合: nE.coli开放转录复合体的形成 2. DNA双链局部解开，形成开放转录复合体 (open transcription complex) ； 1. RNA聚合酶全酶(2)与模板结合，形成闭 合转录复合体(closed transcription complex) ； 3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形 成转录起始复合物： RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3 转录起始复合物: 5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi n转录起始过程： 4. 亚基脱落 cycle （二）转录延长 1. 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构， 与模板结合松弛，沿着DNA模板前移； 2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链 不断延长。 (NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi Unwinding generates supercoils in the DNA that can be relieved by DNA topoisomerases. Actinomycin D was the first antibiotic to find therapeutic application in tumor chemotherapy. It binds to the DNA template and interferes with the movement of RNA polymerase along the DNA. 目录 转录空泡(transcription bubble)： RNA-pol （核心酶） DNA RNA 5 3 DNA n原核生物转录过程中的羽毛状现象 核糖体 RNA RNA聚合酶 在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行； 转录尚未完成，翻译已在进行。 这种形状说明： 原原 核核 生生 物物 的的 边边 转转 录录 边边 翻翻 译译 电电 镜镜 照照 片片 uu 识别转录起始部位。识别转录起始部位。 uu 与模板链结合，并使与模板链结合，并使DNADNA双链打开双链打开。 uu 催化催化NTPNTP的聚合。的聚合。 uu 缺乏外切酶活性缺乏外切酶活性, ,无校对功能。无校对功能。 uu 不同的不同的 识别不同的转录起始位点。识别不同的转录起始位点。 RNA聚合酶作用特点 n依赖Rho ()因子的转录终止 n非依赖Rho因子的转录终止 （三）转录终止 指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不 再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱 落下来。 分类 1. 非依赖 Rho因子的转录终止 DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱 基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊 的结构来终止转录，这种方式较普遍。 反向重复序列与发夹 Inverted repeats and hairpins 5NNGAATGCCNNNGGCATTCNN3 3NNCTTACGGNNNCCGTAAGNN5 5NNGAAUGCCNNNGGCAUUCNN3 茎环/发夹结构 茎环结构使转录终止的机理 使RNA聚合酶变构，转录停顿； 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。 5pppG 5 3 3 5 RNA-pol A T P 2. 依赖 Rho因子的转录终止 相对少见，主要见于噬菌体。 Rho factor: AT Pase activity helic ase activity 易与polyC结合 真核生物的转录过程 The Process of Transcription in Eukaryote 第三节 （一）转录起始前的上游区段（一）转录起始前的上游区段 不同物种、不同细胞或不同的基因，转录起始 点上游可以有不同的DNA序列，但这些序列都 可统称为顺式作用元件(cis-acting element)。 一、真核生物的转录起始过程 真核生物的转录起始上游区段比原核生物 多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模 板，其起始过程比原核生物复杂。 顺式作用元件包括顺式作用元件包括启动子启动子、启动子上游元启动子上游元 件件(upstream (upstream promoter promoter elements)elements)或或 promoter-proximal promoter-proximal elements)elements)等近端调控等近端调控 元件和元件和增强子增强子(enhancer)(enhancer)、沉默、沉默子等子等远隔远隔 序列。序列。 n一个典型的真核生物基因上游序列: 53 调控序列TATA盒Inr YYAN YY T A -30+1 TATAAA 起始点上游多数有共同的起始点上游多数有共同的TATATATA序列，称序列，称 为为HognestHognest盒或盒或TATATATA盒盒(TATA (TATA box)box)。 TATATATA盒盒 和和InrInr一起通常被称为一起通常被称为核心启动子。 目录 TATA盒的作用在于决定转录的起点，序列的改 变会使转录位点偏移；缺失TATA盒，转录将在许 多位点上开始。 TATA盒决定转录的效率： 如鸡蛋清蛋白基因启动子的TATA变为TAGA后 ，转录效率大大下降 转录起始点 TATA盒 CAAT盒 GC盒 增强子 顺式作用元件(cis-acting element) AATAAA 切离加尾 转录终止点 修饰点 外显子 翻译起始点 内 含 子 OCT-1 OCT-1：ATTTGCAT八聚体 （二）转录因子 能直接、间接辨认和结合转录上游区段 DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式 作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚 合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)，或基本转录因子/通用转录因子。 参与RNA-pol转录的TF 稳定TFD-DNA复合物，结 合RNA pol 促进RNA pol结合及作为其 它因子结合的桥梁 解螺旋酶，结合TFH 解旋酶，作为蛋白激酶催化 CTD磷酸化 （三）转录起始前复合物 (pre-initiation complex, PIC) 真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结 合，而需依靠众多的转录因子。 POL- TFF A B 由RNA-Pol 催化转录的PIC（pre-initiation complex) POL- TFF H E TBP TAF TFD-A-B-DNA复合物 TATA A B TBP TAF TATA H E CTD-P PIC组装完成，TFH解开双螺旋并使CTD磷酸化 型基因中的四类转录因子 转录因子 具体组分 结合序列 功能 基本组分 TBP,TFA,B, E,G,F和H TBP结合 TATA盒 转录起始定位； 转 录起始和延长 辅激活因子 TAFs和中介 子 在可诱导因子和上游 因子与基本转录因子 、RNA聚合酶结合 中起联结和中介作用 上游因子 SP1、ATF、 CTF等 启动子上游 元件 协助基本转录因子， 提高转录效率和专一 性 可诱导因子 如MyoD、 HIF-1等 增强子等远 隔调控序列 时间和空间（组织） 特异性地调控转录 n n RNARNA聚合酶聚合酶IIII与启动子的结合、启动转录需要多与启动子的结合、启动转录需要多 种蛋白质因子的协同作用。通常包括多种顺式作种蛋白质因子的协同作用。通常包括多种顺式作 用元件与反式作用因子的作用、因子和因子之间用元件与反式作用因子的作用、因子和因子之间 互相辨认、结合，以准确地控制基因是否转录、互相辨认、结合，以准确地控制基因是否转录、 何时转录以及转录的效率。何时转录以及转录的效率。 nPIC的形成 （四） 拼板理论(piecing theory) n n 为了保证转录的准确性，不同基因需不同转录为了保证转录的准确性，不同基因需不同转录 因子。因子。 n n 拼板理论拼板理论(piecing (piecing theory)theory) ：少数几个反式作用少数几个反式作用 因子（主要是可诱导因子和上游因子）之间互因子（主要是可诱导因子和上游因子）之间互 相作用，再与基本转录因子、相作用，再与基本转录因子、RNARNA聚合酶搭配聚合酶搭配 而有针对性地结合、转录相应的基因。而有针对性地结合、转录相应的基因。 二、转录延长 真核生物转录延长过程与原核生物大致相 似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的 现象。 RNA-pol前移处处都遇上核小体。 转录延长过程中可以观察到核小体移位和 解聚现象。 RNA-Pol RNA-Pol RNA-Pol 核小体转 录 延 长 中 的 核 小 体 移 位 转录方向 5-AAUAAA- 5 -AAUAAA- 核酸酶 -GUGUGUG RNA-pol AATAAA GTGTGTG 转录终止的修饰点 5 5 3 3 3加尾 AAAAAAA 3 mRNA 三、转录终止 和转录后修饰密切相关。 复制与转录特点比较复制与转录特点比较 复制复制 转录转录 半保留半保留不对称不对称 双向复制双向复制单向转录单向转录 半不连续复制半不连续复制连续转录连续转录 需引物需引物不需引物不需引物 及时校读及时校读不能校正，易出错不能校正，易出错 真核生物的转录后修饰 Post-transcriptional Modification 第三节 n n 真核生物转录生成的真核生物转录生成的RNARNA分子是初级分子是初级 RNARNA转录物转录物(primary (primary RNA RNA transcript)transcript)， 几乎所有的初级几乎所有的初级RNARNA转录物都要经过加转录物都要经过加 工，才能成为具有功能的成熟的工，才能成为具有功能的成熟的RNARNA。 n n 加工主要在细胞核中进行。加工主要在细胞核中进行。 几种主要的修饰方式 1. 剪接(splicing)2. 剪切(cleavage) 3. 化学修饰(modification) 4. 添加(addition) 5. 编辑 一、真核生物hnRNA的加工包括 首、尾修饰和剪接 （一）hnRNA在5-末端加 “帽” 大多数真核mRNA的5-末端有7-甲基鸟嘌呤 的帽结构。 这个真核mRNA加工过程的起始步骤由两种 酶，加帽酶(capping enzyme)和甲基转移酶 (methyltransferase)催化完成。 帽子结构（5 m7GpppGp） 5 pppGp 5 GpppGp 5 m7GpppGp 甲基转移酶 SAM 帽 子 结 构 的 生 成 5 ppGp （磷酸酶） Pi 加帽酶 pppG ppi （鸟苷酸 转移酶） 加帽酶 m7Gppp m7GpppN1mp m7GpppN1mpN2mp 帽子结构功能： (1)保护mRNA免受核酸酶水解 (2)与帽结合蛋白质复合体结合，并参与mRNA 和核糖体的结合，与翻译起始有关 (3)与mRNA向核外的转运有关 (4)增强mRNA剪接效率 尾结构：polyA 加尾过程：先由核酸外切酶切去3 末端 一些过剩的核苷酸，然后加入polyA （二）前体mRNA在3端特异位点断裂并加上 多聚腺苷酸尾 目录 多聚腺苷酸聚合酶（poly(A) polymerase, PAP） 目录 利用polyA纯化mRNA 尾功能：（1）保护RNA，防止被水解 （2）与翻译起始有关 （3）与mRNA向核外的转运有关 注意：并不是所有基因的转录产物都有polyA 尾。 断裂基因（外显子和内含子 ） hnRNA 二次转酯反应 （三）hnRNA 的剪接 snRNA, 剪接体 1993年诺贝尔生理学或医学奖得主 罗伯茨 Richard J. Roberts 美国贝弗莉新英格兰生物实验室 1943年- 夏普 Phillip A. Sharp 美国麻省理工学院癌症研究中心 1944年- 目录 鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图 DNA mRNA 目 录 真核生物中的结构基因由若干个编码区和 非编码区相互间隔，但又连续镶嵌而构成，因 此真核生物的结构基因称为断裂基因。 断裂基因(split gene) CABD 编码区 A、B、C、D 非编码区 外显子 在断裂基因及其初级转录产物上出现， 并表达为成熟RNA的核酸序列。 内含子 隔断基因的线性表达而在剪接过程中被 除去的核酸序列。 注意：并不是所有外显子均表达，所有内含子均不表达。 目录 目录 u 内含子的分类 根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含 子分为4类。 I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真 核生物的 rRNA基因； II：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是 mRNA； III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数 mRNA基因有此类内含子； IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内 含子，剪接过程需酶及ATP。 剪接体（spliceosome） 2015年8月，酵母剪接体的高分辨率结构 2016年12月又陆续报道了酵母剪接体在不同工作状态下的高分辨 结构 2017年5月12日，人源剪接体的原子分辨率结构 核内的蛋白质 小分子核糖核酸蛋白体 （ snRNP） snRNA snRNA (small nuclear RNA) 种类：U1 ,U2 ,U4 ,U5 ,U6 GUAAGU AGUACUACA 共有序列 支点序列 53 exons（外显子） introns（内含子） hnRNA 内含子的结构 IVS-2-654(CT)剪接突变是 -地中海贫血的一种最常见的基因 突变 据统计，1/3以上的遗传性疾病与RNA剪接异常有关 。 U1 snRNP与U2 snRNP的识别结合 SnRNPs 对内含子的识别结合 branch site sequence U1 snRNA U2 snRNA A 5splice site U1 snRNP U2 snRNP 3splice site 剪接体 U1 U2 U5 U4/U6U4 53 5 5 5 3 3 3 U5,U4/U6 lariat form （套索状结构） 剪接过程 第一次转酯反应 第二次转酯反应 剪接的机制二次转酯反应 鸡卵清蛋白 基因 hnRNA 首、尾修饰 hnRNA剪接 成熟的mRNA 鸡 卵 清 蛋 白 基 因 及 其 转 录 、 转 录 后 修 饰 目录 选择性剪切 选择性剪接 前体mRNA分子可发生可变剪接和可变剪切 目录 剪接小结 对象hnRNA 原因 工具 断裂基因、外显子 、 内含子 剪接体 (snRNPs、snRNA) 过程套索状结构 机制二次转酯反应 （三）. mRNA的编辑(mRNA editing) 概念：对 mRNA外显子的加工过程， mRNA转录后通过插入、缺失或替换（ 碱基），改变和扩大原来模板DNA的遗 传信息，从而表达出不同氨基酸序列的 多种蛋白质的过程。 目录ApoB基因的mRNA在肝和肠黏膜编码