雌激素对妊娠期肝内胆汁淤积症患者免疫功能的影响.doc

雌激素对妊娠期肝内胆汁淤积症患者免疫功能的影响张丽娟 张凤华 (中南大学湘雅二医院妇产科 湖南长沙 410011) 通讯作者:张丽娟, Email: , Tel摘要】目的：探讨雌激素对妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)免疫功能的影响。方法：采用ELISA技术检测15例正常妊娠晚期孕妇及30例ICP患者（其中轻度、重度患者各15例）外周血清中TNF-、IL-4的水平，采用免疫组织化学方法检测15例正常妊娠晚期孕妇与30例ICP患者胎盘组织中TNF-、IL-4的表达及不同浓度雌激素灌注正常妊娠晚期孕妇离体胎盘绒毛叶后胎盘组织中TNF-、IL-4的表达。结果：1.ICP患者外周血TNF-、IL-4的水平：外周血中TNF-水平：ICP组（887.68592.83）、轻度组（579.86339.25）、重度组（1195.51640.21）高于正常孕妇组（256.81174.98），IL-4 水平：ICP组（195.29140.66）、轻度组（277.41155.22）、重度组（113.1749.41）低于正常孕妇组（426.12232.58），均与ICP病情程度相关，与正常孕妇组比较及两两比较，差异有统计学意义（P0.05）。2.ICP患者胎盘组织TNF-、IL-4的表达：TNF-、IL-4均主要在滋养细胞胞浆内表达，在细胞膜和细胞核上均无表达，胎盘间质组织无表达。胎盘组织中TNF-的表达： ICP组（10950.187.65）、轻度组（5380.279.05）、重度组（16520.089.81）强于正常孕妇组（361.256.18），IL-4的表达：ICP组（4080.397.23）、轻度组（9194.787.23）、重度组（152.144.08）低于正常孕妇组（14309.167.39），且与ICP病情程度相关，与正常孕妇组比较及两两比较，差异有统计学意义（P0.05）。3.ICP患者胎盘组织与外周血中TNF-、IL-4的相关性：ICP组患者胎盘组织中TNF-的表达与其外周血中TNF-呈正相关（P0.001），胎盘组织中IL-4的表达与其外The effect of estrogen on immune function in ICP. ZHANG Li-juan，ZHANG feng-hua Department of Obstetrics and Gynecology, Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410011, ChinaCorresponding author: Zhang-Li-Juan, Email: . 周血中IL-4呈正相关（P0.001）。4.不同浓度雌激素灌注正常孕妇离体胎盘绒毛叶后胎盘组织中TNF-、IL-4的表达：正常孕妇组、KRB液灌注组、20ugE3灌注组、80ugE3灌注组TNF-的表达分别为：（361.256.18），（466.797.50），（4914.668.48），（13838.438.25），正常孕妇组、KRB液灌注组、20ugE3灌注组、80ugE3灌注组IL-4的表达分别为：（10206.575.36），（9859.396.10），（7903.466.26），（192.144.08），正常孕妇组与KRB液灌注组胎盘组织中TNF-、IL-4的表达无明显改变，差异无统计学意义（P0.05），TNF-表达随着灌注雌激素浓度的升高而增强，而IL-4表达随着灌注雌激素浓度的升高而减弱，与正常孕妇组比较及两两比较，差异有统计学意义（P0.05），20ugE3灌注组与ICP轻度组、80ugE3灌注组与ICP重度组TNF-、IL-4的表达差异无统计学意义（P0.05），20ugE3灌注组与ICP重度组比较、80ugE3灌注组与ICP轻度组比较TNF-、IL-4的表达差异有统计学意义（P0.001）。结论：1. ICP患者TNF-升高，IL-4降低，与病情程度相关，胎盘组织与外周血中TNF-、IL-4水平呈正相关，说明其系统免疫及局部免疫功能增强，向Th1偏移，与病情程度相关。2. 雌激素灌注后胎盘TNF-表达增强，IL-4减弱，呈浓度依赖性；这种改变与ICP胎盘免疫改变一致，提示雌激素可导致胎盘局部免疫功能的改变。【关键词】妊娠期肝内胆汁淤积症，雌激素，免疫功能，影响【Abstract】 Objective：To investigate the effect of estrogen on immune function in ICP. Methods：The samples were obtained from 15 cases of healthy placenta, health pregnanct woman peripheral serum and 30 cases of ICP patients including mild group(n=15)and severe group(n=15). The level of TNF-a and IL-4 from serum were measured by ELISA,the expression and localization of TNF-a and IL-4 in placenta which was perfusion by estrogen. Results: 1. The level of TNF- and IL-4 of peripheral serum in ICP: The level of TNF- of ICP group（887.68592.83）, MG（579.86339.25）,SG（1195.51640.21） were higher than NG （256.81174.98） of peripheral serum, while The level of IL-4 ICP group（195.29140.66）, MG（277.41155.22）, SG（113.1749.41）lower than NG（426.12232.58）, compared to NG and two comparition (P0.05). 2. The expression of TNF- and IL-4 of placenta in ICP: The TNF- and IL-4 were mainly found in the intracytoplasm of trophocyte, and there were no expression in epicyte, nucleolus and mesenchymal. The expression of TNF- of ICP group（10950.187.65）, MG（5380.279.05）, SG（16520.089.81）higher than NG（361.256.18）, while the expression of IL-4 of ICP group（4080.397.23）, MG（9194.787.23）, SG（152.144.08）lower than NG（14309.167.39）, compared to NG and two comparition (P0.05).3.The correlation of TNF-、IL-4 between Placenta and peripheral serum:There were positive correlation between the expression of TNF-、IL-4 in placenta and peripheral serum（P0.001）.4. The expression of TNF- and IL-4 in placenta perfused by different concentrations estrogen: NG, KRB perfused group, 20ugE3 and 80ug E3 perfused group the expression of TNF- were: (361.256.18）, （466.797.50）,（4914.668.48）,（13838.438254.36）, NG, KRB perfused group, 20ugE3 and 80ugE3 perfused group. The expression of IL-4were: (10206.575.36), (9859.396.10), ( 7903.466.26), ( 192.144.08). The expression of TNF- and IL-4 between NG and KRB perfused group were no significant different(P0.05). While the expression of TNF- were step up by the concentration of estrogen, The IL-4 were step down by the concentration of estrogen, compared to NG and two comparition (P0.05). The expression of TNF-,IL-4 of 20ug E3 perfused group and MG, 80ug E3 perfused group and SG were no significant change(P0.05),while 20ug E3 perfused group and SG, 80ug E3 perfused group and MG have significant change(P0.001).KEY WORDS Intrahepatic cholestasis of pregnancy, estrogen, immune function, influenceICP是妊娠中晚期特发性疾病，临床上以皮肤瘙痒、血清中胆汁酸升高为特征，对胎儿极具威胁。目前普遍认为ICP与雌激素升高密切相关，且存在免疫耐受-免疫排斥不平衡现象。近年来有学者1,2 研究发现ICP患者雌激素变化与免疫功能变化有一定相关性。本研究制备雌激素灌注离体胎盘单绒毛叶模型3，以不同浓度游离雌三醇(fE3)灌注之，观察灌注前、后及不同浓度fE3灌注后胎盘组织中TNF-、IL-4的表达是否发生改变，再与ICP患者（轻度组、重度组）胎盘组织中TNF-、IL-4表达情况进行比较是否有差别，旨在探讨雌激素对ICP患者免疫功能的影响。资料与方法1.研究对象与分组选择2011年3月至2011年12月在中南大学湘雅二医院妇产科分娩的孕妇共45例作为研究对象。正常妊娠晚期孕妇15例，年龄2334岁，平均27.63.81岁，孕周37+541+4周，平均39+41.00周，经阴分娩11例，剖宫产4例；同期ICP患者30例，其中轻、重度组各15例，年龄2138岁，平均29.34.49岁，孕周31+138+5周，平均36+21.21周，经阴分娩10例，剖宫产20例；两组年龄差异无显著性（P0.05），孕周差异有统计学意义（P0.05）。妊娠期肝内胆汁淤积症的诊断标准分别参照文献4，5。两组孕妇均为单胎妊娠，无其他妊娠并发症及内外科合并症。正常妊娠组剖宫产的指征为：胎位异常，社会因素，头盆不称。ICP组剖宫产指征：重度ICP；既往死胎死产、新生儿窒息或死亡史；胎盘功能严重下降或高度怀疑胎儿窘迫；存在其他阴道分娩禁忌症者。2方法2.1正常孕妇组、ICP组患者血生化标本的收集及处理：在患者就诊时或入院用药前患者空腹812小时抽取2ml外周静脉血，经凝集、离心、分装处理后编号，冻存于-70冰箱，待测TNF-、IL-4的水平。2.2 ICP组及正常孕妇组（灌注前）胎盘标本的收集与处理：于胎盘娩出5分钟内在胎盘母体面中央取1块胎盘组织约1cm1cm1cm大小，固定编号，石蜡包埋、切片，待测TNF-、IL-4的水平。2.3 fE3灌注离体绒毛叶后胎盘标本的收集和处理：于胎盘娩出1小时内制备离体胎盘单绒毛叶灌注模型3，见附录1。根据ICP患者血清fE3浓度6设置低浓度（20ug）、高浓度（80ug）fE3灌注离体胎盘单绒毛叶，灌注后取材，方法同上。 2.4 正常孕妇组、ICP组外周血清、胎盘组织中TNF-、IL-4水平的测定（1）主要试剂：Estriol(E1149)雌三醇购自美国Sigma公司；肝素购自上海晶纯实业有限公司；TNF-a、IL-4ELISA试剂盒购自美国 R&D SY公司；兔抗人STAT6多克隆抗体购自Proteintech公司；羊抗人TNF-多克隆抗体购自北京中杉金桥；TNF-、IL-4二抗试剂盒购自康为世纪公司。（2）操作步骤：ELISA操作严格按照人TNF-、人IL-4试剂盒使用说明书操作，为保证实验结果有效性和精确性，每次实验均使用新的标准品溶液。免疫组织化学方法参照说明书：切片烘烤后，经脱蜡、梯度脱水后，再高压修复抗原，然后加入内源性过氧化物酶，依次加入山羊血清、一抗、二抗、HRP，DAB显色，苏木素复染、脱水、透明、封片。用PBS液代替一抗作为阴性对照。2.5 统计学方法数据以s表示，用SPSS17.0统计软件做统计学处理，多组间比较采用ANOVA分析，组内多个样本的两两比较方差齐采用LSD-t检验，方差不齐采用DunnettsT3检验，不同因素间相关性分析采用Pearson相关分析，显著水准=0.05。结 果1ICP组患者外周血清中TNF-、IL-4的表达ICP组、轻度组、重度组外周血TNF-的水平高于正常孕妇组，而IL-4的水平低于正常孕妇组，均与ICP病情程度相关，与正常孕妇组比较及两两比较，差异有统计学意义（P0.05）。见表3-1。表3-1 ICP组患者外周血清中TNF-a、IL-4的水平（s，ng/l）组别例数TNF-IL-4正常孕妇组ICP组 轻度组 重度组15 30 15 15256.81174.98887.68592.83a,b579.86339.25a,b1195.51640.21a,b426.12232.58195.29140.66a,b 277.41155.22a,b113.1749.41a,b注：a表示与正常孕妇组比较，P0.05，b表示两两比较，P0.052.正常孕妇组、ICP组患者胎盘组织中TNF-、IL-4的表达TNF-染色的阳性细胞为滋养细胞胞浆内出现深棕色颗粒，IL-4染色的阳性细胞则为滋养细胞胞浆呈棕黄色，在细胞膜和细胞核上均未见明显染色，见附录2。ICP组、轻度组、重度组胎盘组织中TNF-的表达强于正常孕妇组，IL-4的表达弱于正常孕妇组，均与ICP病情程度相关，与正常孕妇组比较及两两比较，差异有统计学意义（P0.05）。见表3-2.表3-2 ICP组患者胎盘组织中TNF-、IL-4的IOD值（s）组别例数TNF-IL-4正常孕妇组ICP组 轻度组 重度组 15 30 15 15361.256.1810950.187.65 a,b5380.279.05 a,b16520.089.81 a,b14309.167.394080.397.23 a,b9194.787.23 a,b152.144.08 a,b注：a表示与正常孕妇组比较，P0.05，b表示两两比较，P0.053. ICP组患者胎盘组织中TNF-、IL-4表达与其外周血中TNF-、IL-4及TNF-IL-4比值相关分析 ICP组患者胎盘组织中TNF-的表达与其外周血中TNF-呈正相关（r=0.414,P=0.000），胎盘组织中IL-4的表达与其外周血中IL-4呈正相关（r=0.672,P=0.000），见表3-3。表3-3 ICP组胎盘组织中TNF-、IL-4表达与其外周血中TNF-、IL-4的相关分析 胎盘组织外周血 TNF- IL-4 r值 P值 r值 P值 TNF- 0.414 0.000 - IL-4 - 0.672 0.000 4.不同浓度雌激素灌注正常孕妇组胎盘绒毛叶后TNF-、IL-4的表达 正常孕妇组与KRB液灌注组胎盘组织中TNF-、IL-4的表达无明显改变，差异无统计学意义（P0.05），TNF-表达随着灌注雌激素浓度的升高而增强，而IL-4表达随着灌注雌激素浓度的升高而减弱，与正常孕妇组比较及两两比较，差异有统计学意义（P0.05），见表3-4. 20ugE3灌注组与ICP轻度组、80ugE3灌注组与ICP重度组TNF-、IL-4的表达差异无显著性（P0.05），20ugE3灌注组与ICP重度组比较、80ugE3灌注组与ICP轻度组比较TNF-、IL-4的表达有统计学差异（P0.001）。表3-4 正常孕妇组雌激素灌注胎盘绒毛叶后TNF-、IL-4的IOD值（s）组别例数TNF- IL-4正常孕妇组KRB液灌注组20ugE3灌注组80ugE3灌注256.18466.797.50a,b4914.668.48 a,b13838.438.25 a,b10206.575.369859.396.10a,b7903.466.26 a,b192.144.08 a,b注：a表示与正常孕妇组比较，P0.05，b表示两两比较，P0.05讨 论ICP是妊娠中晚期特发性疾病，主要危害胎儿，是目前公认的对胎儿极具威胁的高危妊娠7。其发病机制尚不完全清楚，绝大部分ICP患者存在高雌激素水平及免疫功能异常，而高雌激素是否可导致免疫功能异常，尚不清楚。1.ICP患者免疫功能的改变ICP患者外周血中存在免疫功能失衡。研究发现8，9，ICP患者外周血T淋巴细胞群发生改变， 向Thl偏移，细胞免疫功能显著增强，Th1型细胞因子水平升高可能直接导致肝脏损伤，导致肝内胆汁淤积，最终导致不良妊娠结局。本研究结果显示，ICP组外周血中TNF-水平高于正常孕妇组， IL-4低于正常孕妇组，均与ICP病情程度相关，说明ICP患者外周血中免疫功能增强，且向Th1偏移。母胎界面是产生免疫应答的重要部位，ICP主要危害胎儿，胎盘娩出后病情迅速好转，因此ICP患者胎盘免疫功能是否改变成为研究热点。国内外已有大量研究证明，ICP患者母胎界面存在免疫失衡。Yayi H等10,11研究发现免疫平衡失调及蜕膜中NK细胞、NKT细胞的增多、T细胞的减少及IFN-r的过度分泌可能是ICP的发病原因之一。ICP患者胎盘组织病理改变表现为退行性改变，细胞凋亡升高，胎盘功能遭到损害。Shao Y等12应用雌孕激素建立ICP大鼠模型，光镜下胎盘组织部分滋养细胞颗粒变性和空泡变性，合体滋养细胞变性更为明显，绒毛间隙内胆汁淤积，提示ICP对胎盘有毒性作用，可造成胎儿宫内窘迫、胎儿生长受限等不良后果。本研究显示TNF-、IL-4均主要在滋养细胞胞浆内表达，在细胞膜和细胞核上均无表达，胎盘间质组织无表达。ICP组、轻度组、重度组胎盘组织中TNF-表达强于正常孕妇组，IL-4表达弱于正常孕妇组，与ICP病情程度相关，提示ICP患者母胎界面免疫系统Thl/Th2型细胞因子平衡由Th2向Thl方向偏移，胎儿对其母体的免疫反应增强，母-胎界面存在免疫失衡。本研究还显示ICP组患者胎盘组织与其外周血中TNF-、IL-4的水平呈正相关，即胎盘组织与外周血中Th1、Th2型细胞因子的表达呈正相关，提示ICP患者母胎界面局部免疫与系统免疫存在一定的相关性。ICP患者系统免疫及母胎界面局部均存在免疫平衡失调，Thl/Th2细胞因子平衡向Thl方向偏移。而胎盘组织TNF-水平明显高于外周血TNF-水平，考虑母胎界面的免疫改变在ICP患者免疫功能改变中起着更重要的作用。但ICP患者母胎界面免疫功能的失衡的具体机制尚不清楚，有待进一步研究。2.雌激素对胎盘局部免疫功能的影响目前研究认为ICP发病与雌激素升高密切相关。但有研究发现13部分ICP患者血清和尿中雌激素水平及其前体物质硫酸脱氢表雄酮与正常孕妇相比不升反降。因此雌激素学说不能完全解释ICP发病机制。雌激素学说及免疫失衡学说均不能完全解释ICP的发病机制，二者之间是否有联系，雌激素升高是否可导致胎盘局部的免疫功能异常，未见相关报道。近年来有学者对ICP患者E3变化与免疫功能改变的相关性进行了研究。时青云等1研究发现ICP患者血清中fE3与CD8+T细胞呈负相关，与CD4+/CD8+比值呈正相关，但有不同报道2ICP患者血清中fE3水平与CD8+T细胞呈正相关，与CD4+/CD8+比值呈负相关。因此Yukio Y等14研究发现ER可介导17-炔雌醇导致肝脏损伤。已有研究发现在胸腺、脾脏及外周血CD4+、CD8+细胞上均有雌激素受体(estrogen receptor ,ER)表达且表达量不同15,16,17，推测雌激素可能通过与CD4+CD8+细胞上的ER结合而减弱抑制性淋巴细胞（Ts）的抑制活性，改变机体的免疫功能。为排除体内其他因素的影响，研究单因素雌激素对胎盘免疫功能的影响，我们复制了离体胎盘单绒毛叶灌注模型3，并以不同浓度fE3灌注离体绒毛叶模型，结果显示TNF-表达随着灌注雌激素浓度的升高而增强，而IL-4表达减弱，表现为Th2向Thl方向偏移，提示雌激素可导致胎盘局部免疫功能的改变，这可能是ICP的发病原因之一。且我们设置的低浓度、高浓度雌激素灌注胎盘绒毛叶后胎盘组织与ICP轻度、重度患者胎盘组织中TNF-、IL-4的表达无显著性差异，这说明我们成功建立了雌激素灌注离体胎盘单绒毛叶导致免疫功能改变的模型，这为以后进行深入研究雌激素对免疫功能的影响奠定了理论和实践基础。为进一步研究雌激素对ICP患者免疫功能的影响，可在灌注液中加入雌激素抑制剂、雌激素受体抑制剂，观察胎盘组织免疫功能的变化；亦可在灌注液中加入思美态、熊去氧胆酸、地塞米松等药物，检测胎盘免疫功能是否改善；还可在灌注液中加入其他调节因子，用以研发治疗ICP的新药。参考文献1 时青云,刘淑芸,熊庆.妊娠肝内胆汁淤积症患者雌孕激素水平及免疫功能的变化J.中华妇产科杂志,1998,33(12):724-726.2 陈英.ICP患者血清FE3 及免疫功能指标测定的临床意义J.放射免疫学杂志,2009,22(4):315-317.3 Schenker S,Yang YQ,Johnson RF,et al.The transfer of cocaine and its metabolites across the term human placentaJ. 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