实时荧光定量PCR技术的原理及应用.ppt

实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 提纲： n实时荧光定量PCR原理 数学原理 化学原理 n实时荧光定量PCR的方法应用 绝对定量 相对定量 n定量PCR的实验要素 n平台定量PCR仪器介绍 实时荧光定量PCR定义： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号累积实现了实时监测整个PCR 进程，对起始模板进行定量分析的方法 。 与普通PCR的区别 n普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。 n实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起 始模板进行定量。 n荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个 值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意 位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景） 荧光信号的标准偏差的 10 倍。 n每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所 经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。 定量PCR的数学原理 斜率与扩增效率 荧光定量PCR化学原理 非特异性荧光标记： 1、SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 1、SYBR Green 法 SYBR Green 熔解曲线分析 SYBR Green法优缺点 n优点: n对DNA模板没有选择性 n适用于任何DNA n使用方便-不必设计复杂探针 n非常灵敏 n便宜 2、TaqMan探针法 TaqMan作用机理 TaqMan法优缺点 Real-time PCR 方法应用 n绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 n相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究 绝对定量与相对定量的定义 绝对定量通过标准品定量 n绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。 标准样品的种类： n含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 n含有和待测样品相同扩增片段的cDNA nPCR的产物 绝对定量：从荧光到拷贝数 相对定量通过内标定量 n内标（Endogenous Control）通常是-actin 、GAPDH基因等看家基因 n在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定 ，受环境因素影响小 n内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组 数量 相对定量：参照因子Calibrator 相对定量分析方法1 -Ct 前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏 差在 5以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值： CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校准样本的CT值归一试验样本的CT值： CT= CT（test) - CT（calibrator) 3、计算表达水平比率： 2 CT=表达量的比值 相对定量分析方法2：双标准曲线法 目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度 定量PCR的实验要素 样品 DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间 DNA用量：0.05 ng 100 ng RNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取 1 uL 标准品 标准品梯度稀释方法 复管测试 样品和标