ELISPOT技术实验步骤.doc

/forum-4-1.html （相关网站）ELISPOT技术实验步骤从原理上看ELISPOT的确很简单，但是在操作过程中有许多条件需要摸索，所以这里进一步介绍一下ELISPOT的操作步骤。 （1） 将适量捕获性抗体预先包被于96孔ELISPOT板上，用胶带封板并在4孵育过夜。将板用PBS洗6遍，再用含体积比10%胎牛血清(FCS)的培养基封闭，室温下孵育至少1h。FCS可以封闭所包被抗体的FCS受体以降低非特异性反应。有一种特殊的96孔板底面介质是PVDF膜，利用膜的多孔结构可以让单个细胞坐到其中，然后分泌细胞因子或特定抗体，这样使最后的检测单个细胞灵敏度成为可能。同时，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT与ELISA的不同之处。理论上是可以同时包被两个不同的抗体的，两种不同的抗体可以利用不同的显色系统显出不同颜色，但是这样就要考虑到不同抗体间的不亲和性，必需保证每种抗体包被的数量要足够。如果是使用试剂盒的预包被板，这一步就可以省略啦。 （2） 将阴性对照和细胞样品，如外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，经纯化的CD8+T细胞或去除某种特异细胞群的PBMC，用含10%FCS的培养基稀释至51042105个/孔如果条件可以达到更高的细胞数，建议可以尝试31055105个/孔，特别是在分泌细胞），分装于ELISPOT板孔中，再加入特异的刺激物，如多肽或基因表达产物，提取的抗原等，阴性对照孔中只加入培养基（实验中最好采用无血清的培养基，这样可以避免因为血清批次不同的差异所造成的误差，同时也避免血清的某些成份会引起非特异的反应），阳性对照孔加入植物血凝素(PHA，2g/mL)或阳性多肽，37，体积比为5% CO2培养2448h。要进行ELISPOT实验的细胞必需制备成为悬液的形式。利用ELISPOT的检测是十分灵敏的，频率低至10-12的分泌细胞都可以被检测出来。并且对于那些会贴壁的细胞也可以使用此种方法，虽然细胞生长贴壁后不易被洗去，但是不会妨碍最后斑点的显色。只要细胞可以正常分泌与抗体特异结合的产物，这些产物会逐步扩散到细胞四周，最后还是可以显示出斑点。 （3） 用含体积比0.01%Tween-20的PBS洗6次，以弃去细胞，加入生物素化抗细胞因子的检测抗体，孵育3h。再洗6次后，加入AP或HRP标记的链亲和素，室温孵育3h。 （4） 用PBS-Tween-20 再洗5次，加入底物 室温下显色，待出现紫色(AKP和底物的产物)或红色(HRP和底物的产物)斑点时，即可用立体解剖显微镜或计算机辅助成像分析系统计算斑点数，并用斑点形成单位(sfu/L百万加入细胞)记录结果。每一个斑点代表一个特异分泌CK的细胞。若预先包被抗原，则可用于ASC测定，这时，每一个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞。 完成了以上步骤后其实只是完成了实验的一半。在你不断摸索反应的条件之后，得到了一块布满斑点的板，接下来要如何对这些斑点进行分析呢。如果利用显微镜人工技术无疑是太参有个人因素的实验了，实验结果肯定会被审稿人好好质疑一番。随后，有人使用数码相机拍摄下来后，使用photoshop进行处理、计数，这种方法也存在较多的个人因素。一项技术要普及，为广大研究人员所接受，就必需尽量减小人为的误差。所以，近年许多公司开始开发计算机辅助系统，使用系统设定的阈值对斑点进行人工智能计数。这样，由计算机将阴性对照中非特异反应斑点进行去除，同时由计算机进行统一计数，这样的实验结果置信度便大大提升了。目前判断的首要标准还是斑点的大小，但是做过电泳、同位素等的计算机成像的研究人员都遇到过一个问题：很多时候实验会产生一些较淡的斑点，用肉眼判断绝对是背景。所以在设计软件时也必需考虑到斑点深浅因素。计算机可以利用斑点的深浅、是否以中心为原点向四周减淡等特征对细胞分泌动力学特征进行分析，这项技术的成熟相信会使ELISPOT的应用范围更加扩宽。 （5） ELISPOT 斑点的判读像多数的Cell-based分析技术一样，ELISPOT Cytokine技术也是相当耗时、耗劳力的工作。事实上到目前为止，以目视法判读少量细胞族群的特性如激活T细胞之激素分泌，仍被视为是免疫学技术上的一大挑战。ELISPOT结果的判读常需要专聘、有经验的技术员才可以；有时就算有专职技师判读，使用传统的显微镜计算斑点数仍不免会偶有主观意见，而有所偏颇。 科学实证的本质，在于如何使实验结果能尽可能客观、精确、同时有高重现性，传统的人工计算法显然无法达到此一要求。故而有几个科研团队使自行开发Plate Scanner与自动分析软件，其中以Paul Lehmann教授研究开发之ImmunoSpot? Analyzer自动分析仪最具代表性。分析ELISPOT实验数据的过程中，仪器先以高分辨率镜头捕捉微小孔中膜上呈色影像，而后储存成TIF檔；这些影像可以进一步使用手动、或是自动方式计算斑点数目，如果使用ImmuneSpot分析软件，可以先设定条件，然后同时分析斑点的大小，以推估激素分泌的多寡。预料像ImmunoSpot? Analyzer这一类自动图像扫描分析仪器，将可克服传统显微镜判读方法耗费人力、及人为客观性等缺点，彻底解除ELISPOT分析技术的瓶颈问题，进一步推广该技术的新颖应用。 ImmunoSpot影像扫描分析仪可以提供不同的数据格式，包括未处理与处理过的膜表面影像、每个小孔中的斑点数目、每个小孔中的平均斑点数目、每个小孔中斑点大小的直方统计图。ELISPOT分析仪的出现解决了以下问题 哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有 T 细胞研究价值） 斑点大小的意义 。 在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸 如何从单个细胞基础上分析 实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果 几次重复实验才能使结果更有意义ELISPOT实验具体操作过程ELISPOT实验具体操作过程第一天 包板1、用25ul/孔70%乙醇预湿反应板，室温避光10分钟，弃乙醇，用0.05%吐温PBS洗三遍。2、用75ul/孔适宜浓度稀释于PH9.6碳酸盐包被液中的捕获抗体包板。3、避光4过夜。第二天 制板 1. 弃抗体包被液，0.05%吐温PBS洗板3次。 2. 用200ul/孔15%人AB血清1640封闭反应板，避光室温2小时。 制备效应细胞 3. 纯化你所感兴趣的细胞。 4. 用2%NCS1640洗细胞两遍，计数，用无血清1640配成适宜浓度的细胞悬液。 制备靶细胞 5. 用2%NCS1640洗细胞两次，用无血清1640配成1106/ml。 6. 加载你要研究的抗原肽，37，2小时。 7. 2%NCS1640洗细胞，计数，用无血清1640配成适宜浓度的细胞悬液。铺板8. 弃掉封闭液， 0.05%吐温PBS洗板3次。9. 小心加入效应细胞悬液100ul/孔，37，30-60分钟。10.小心加入靶细胞悬液100ul/孔，37，5%CO2孵育箱18-20小时(IFNr为例)。第三天1. 弃细胞。2. 用0.05%吐温PBS洗反应板6次。3. 加入100ul/孔用5%BSA-PBS配制的适宜浓度的生物素标记的检测抗体，37，2小时。4. 用0.05%吐温PBS洗反应板6次。5. 加入100ul/孔平衡至室温的用PBS配制的酶-亲合素复合物（1：1000），室温或37，避光1小时。6. 弃酶-亲合素复合物，0.05%吐温PBS洗板3次，PBS洗板3次或更多次。7. 配制底物溶液，加入100ul/孔，室温10-20分钟，视 显色结果而定。8. 用自来水终止显色反应。9. 弃掉底托，将底部膜冲干净，倒扣，避光，风干。10.过夜后，计数各孔斑点数。ELISPOT关键步骤无菌操作步骤 包板: 每孔75&C过夜。micro;l包被抗体,避光, 4封闭: 每孔加150 µl 10%AB血清1640, 避光室温2 小时。细胞活化: 每孔加 100µl 103-2105 C细胞悬液，及特异抗原，肽，丝裂原等2-24hr,37以上资料由“北京赛智创业科技有限公司”与“北京大学医学部T细胞研究中心”提供 本帖最后由 自主创新 于 2008-3-17 10:53 编辑 ELISPOT实验技术要点ELISPOT实验技术要点技术要点1、捕获抗体包被量需要滴定，它会影响斑点的形成。2、待测细胞的有效诱导，刺激剂剂量，效果。首次实验细胞浓度梯度是必要的。3、加样细胞和试剂时枪头千万不能碰触孔底的PVDF膜，以防止其损坏。4、往板中所加液体切勿存有气泡。5、放孵箱孵育时切勿经常扰动。6、整个实验过程中， 96孔板外最好包裹锡箔纸，直到显色结束再弃去，以防边缘影响。7、一块板最好一次用完，实验开始之前设计的实验方案，尽量最大程度地利用板孔和试剂。冻存细胞对实验无影响。8、检测抗体和酶标抗体最好现用现配。9、保证结果准确，最好做复孔。10、实验结束后，板孔要阴干，不要在温度过高及干燥环境下干燥孔板。11、洗板时也要小心，切勿损坏孔膜。12、加检测抗体之前，最好在无菌环境下操作。13、设对照： 阳性对照：重组细胞因子或细胞因子分泌细胞 阴性对照：未刺激细胞，单纯靶细胞对照 背景对照：无菌培养基14、操作BCIP/NBT显色液时最好戴上手套。15、试剂平衡到室温，尤酶标抗体和底物。以上资料由“北京赛智创业科技有限公司”与“北京大学医学部T细胞研究中心”提供ELISPOT技术流程1 针对被分析物的 捕获抗体包被在贴有PVDF膜的微孔板上。2在孔内加入蛋白质 封闭空的位点。3加入抗原、肽段或有丝分裂素等刺激剂，加入细胞悬液孵育一定时间以激活细胞细胞受刺激后分泌的蛋白紧靠在细胞周围，与已固定的捕获抗体结合。4吸出细胞悬液，用去离子水和清洗缓冲液洗涤细胞和未结合的蛋白被除去。5加入生物素标记的针对被分析物的检测抗体检测抗体与被分析物结合，形成 夹心三明治复合物。6加入与辣根过氧化物酶(HRP)连接的亲和素亲和素与检测抗体上的生物素结合。7加入底物溶液,与酶发生显色反应，监测颜色斑点的形成，终止底物反应，室温风干，避光保存于封口塑料袋中直至分析颜色斑点。以上资料由“北京赛智创业科技有限公司”与“北京大学医学部T细胞研究中心”提供 本帖最后由 自主创新 于 2008-3-19 12:01 编辑 ELISPOT技术实验步骤从原理上看ELISPOT的确很简单，但是在操作过程中有许多条件需要摸索，所以这里进一步介绍一下ELISPOT的操作步骤。 （1） 将适量捕获性抗体预先包被于96孔ELISPOT板上，用胶带封板并在4孵育过夜。将板用PBS洗6遍，再用含体积比10%胎牛血清(FCS)的培养基封闭，室温下孵育至少1h。FCS可以封闭所包被抗体的FCS受体以降低非特异性反应。有一种特殊的96孔板底面介质是PVDF膜，利用膜的多孔结构可以让单个细胞坐到其中，然后分泌细胞因子或特定抗体，这样使最后的检测单个细胞灵敏度成为可能。同时，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT与ELISA的不同之处。理论上是可以同时包被两个不同的抗体的，两种不同的抗体可以利用不同的显色系统显出不同颜色，但是这样就要考虑到不同抗体间的不亲和性，必需保证每种抗体包被的数量要足够。如果是使用试剂盒的预包被板，这一步就可以省略啦。 （2） 将阴性对照和细胞样品，如外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，经纯化的CD8+T细胞或去除某种特异细胞群的PBMC，用含10%FCS的培养基稀释至51042105个/孔如果条件可以达到更高的细胞数，建议可以尝试31055105个/孔，特别是在分泌细胞），分装于ELISPOT板孔中，再加入特异的刺激物，如多肽或基因表达产物，提取的抗原等，阴性对照孔中只加入培养基（实验中最好采用无血清的培养基，这样可以避免因为血清批次不同的差异所造成的误差，同时也避免血清的某些成份会引起非特异的反应），阳性对照孔加入植物血凝素(PHA，2g/mL)或阳性多肽，37，体积比为5% CO2培养2448h。要进行ELISPOT实验的细胞必需制备成为悬液的形式。利用ELISPOT的检测是十分灵敏的，频率低至10-12的分泌细胞都可以被检测出来。并且对于那些会贴壁的细胞也可以使用此种方法，虽然细胞生长贴壁后不易被洗去，但是不会妨碍最后斑点的显色。只要细胞可以正常分泌与抗体特异结合的产物，这些产物会逐步扩散到细胞四周，最后还是可以显示出斑点。 （3） 用含体积比0.01%Tween-20的PBS洗6次，以弃去细胞，加入生物素化抗细胞因子的检测抗体，孵育3h。再洗6次后，加入AP或HRP标记的链亲和素，室温孵育3h。 （4） 用PBS-Tween-20 再洗5次，加入底物 室温下显色，待出现紫色(AKP和底物的产物)或红色(HRP和底物的产物)斑点时，即可用立体解剖显微镜或计算机辅助成像分析系统计算斑点数，并用斑点形成单位(sfu/L百万加入细胞)记录结果。每一个斑点代表一个特异分泌CK的细胞。若预先包被抗原，则可用于ASC测定，这时，每一个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞。 完成了以上步骤后其实只是完成了实验的一半。在你不断摸索反应的条件之后，得到了一块布满斑点的板，接下来要如何对这些斑点进行分析呢。如果利用显微镜人工技术无疑是太参有个人因素的实验了，实验结果肯定会被审稿人好好质疑一番。随后，有人使用数码相机拍摄下来后，使用photoshop进行处理、计数，这种方法也存在较多的个人因素。一项技术要普及，为广大研究人员所接受，就必需尽量减小人为的误差。所以，近年许多公司开始开发计算机辅助系统，使用系统设定的阈值对斑点进行人工智能计数。这样，由计算机将阴性对照中非特异反应斑点进行去除，同时由计算机进行统一计数，这样的实验结果置信度便大大提升了。目前判断的首要标准还是斑点的大小，但是做过电泳、同位素等的计算机成像的研究人员都遇到过一个问题：很多时候实验会产生一些较淡的斑点，用肉眼判断绝对是背景。所以在设计软件时也必需考虑到斑点深浅因素。计算机可以利用斑点的深浅、是否以中心为原点向四周减淡等特征对细胞分泌动力学特征进行分析，这项技术的成熟相信会使ELISPOT的应用范围更加扩宽。 （5） ELISPOT 斑点的判读像多数的Cell-based分析技术一样，ELISPOT Cytokine技术也是相当耗时、耗劳力的工作。事实上到目前为止，以目视法判读少量细胞族群的特性如激活T细胞之激素分泌，仍被视为是免疫学技术上的一大挑战。ELISPOT结果的判读常需要专聘、有经验的技术员才可以；有时就算有专职技师判读，使用传统的显微镜计算斑点数仍不免会偶有主观意见，而有所偏颇。 ELISPOT技术原理在免疫学领域中，对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答（B细胞免疫），细胞介导的免疫应答(cell mediated immune response，CMI)也是人们所关注的，而T细胞在CMI中起关键作用。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。 80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ ELISPOT ）。作为一项新型的免疫酶技术酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)，是从单细胞水平检测分泌抗体细胞(ASC) 或分泌细胞因子(CK) 细胞的一项细胞免疫学检测技术。由于该方法具有较高的特异性和敏感性，易操作，成本相对流式细胞分析术也较低，已被广泛用于分泌CK细胞检测或ASC测定中，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。 ELISPOT 法源自 ELISA，又突破传统 ELISA 法，是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于： （1） ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。 （2） ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率） 由于是单细胞水平检测， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体为高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。 下面将从发展、原理、具体实验操作、技术优势和应用几方面进行介绍。ELISPOT技术的发展（1） ELISPOT技术的过去 ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。Czerkinsky 等人率先在1983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。从那时起世界各国免疫学者便开始一长期的ELISPOT Cytokine技术竞赛，每个团队都希望能率先将此一技术推广来研究T细胞免疫，其绝妙之处在提供一接近体内实验的环境，藉由侦测T细胞分泌的各类细胞因子，来定量机体内免疫反应启始者Precursor T的clonal size族群大小，同时预测体内免疫系统即将进行的下游免疫反应。ELISPOT Cytokine技术虽说操作简单，但该技术并没能如预期地很快地被成功应用在ex vivo T细胞功能研究。要让ELISPOT技术从B细胞免疫走向T细胞免疫的产生的第一个主要问题，便是灵敏度的提升，因为T细胞因子较之B细胞免疫球蛋白产量极少。早期ELISPOT的分析条件不是非常理想，成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题，使当时多数研究团队很难获得清晰的斑点，结果是敏感度不够、数据分析重现性低。这问题直到1996美国俄亥俄卅Case Western Reserve大学Paul Lehmann团队引进PVDF薄膜的应用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体，使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏，让呈色斑点集中、清晰、对比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。图一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）与传统标准薄膜（Panel B）并行实验的比较结果。同样的人体 PBMC样品，在通过完全相同的实验，Panel A呈现较清晰的小色点。 第二个技术性问题是ELISPOT Cytokine实验分析的几个基本假设缺乏科学实证，也使得该技术在当时并没受到该有的广泛重视。没有科研人员尝试去厘清一些基础但很重要的问题，诸如； 实验所得的斑点是抗原特定T细胞所生产，还是旁观细胞受Cytokine刺激的次级效应？ 斑点的小或大有何生理意义；如何决定cutoff值？ 能否相信斑点是由单一的细胞造成？ ELISPOT Cytokine分析技术能准确测量的频率范围？ 如果效应相互拮抗的cytokine同时产生，它们是否会互相妨碍？及到什么程度？ （2） ELISPOT 技术的现在1996年以来随着抗体制备、PVDF膜材篁等技术改良，ELISPOT 分析技术已经逐渐达到科研人员的期待，它已是当世公认最灵敏抗原特定T细胞的体外检测技术。藉由检验新鲜分离PBMC细胞所分泌cytokine的指纹，ELISPOT 分析技术可提示T细胞免疫系统的两个重要参数：抗原特定T细胞的clone族群大小；和免疫效应细胞的信号传导路径Th1/Th2。多年来经过数十个研究团队的致力研究，对于ELISPOT分析技术本身的几个问题，也有了科学上的验证。目前一般公认，ELISPOT技术允许科研人员在单细胞水平上识别抗原特定T细胞，主要针对经由CD4或者CD8细胞的免疫反应。在适当的实验设计下，ELISPOT Cytokine 斑点的数量分析显示斑点是由一个单细胞所生成，同时斑点形态学与Time Response分析则显示斑点直径大小直接反映该细胞族群的产能。也因为如此，ELISPOT是个免疫学上的标竿技术，它可以允许科研人员在几乎自然生理条件下，观察细胞实际分泌Cytokine的进程，进而可以得到药理学信息，阐明免疫调节药物如何影响T细胞分泌各类cytokine的速率。药物抑制T细胞免疫一般可通过两程截然不同的机转；使能分泌Cytokine的Precursor T细胞族群变小，或减少每Precursor T细胞的cytokine产能，而ELISPOT技术能提供双份信息。ELISPOT分析技术的几个特点已经让它在抗原特定T细胞免疫学上独占鳌头。此技术是当世唯一准许百万分之一1:1000,000的准确分析，如此强效的解析力使流式细胞技术也望其项背，以目前国内外常规的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技术的灵敏度一般限制在1:10,000。这样的高灵敏度对T细胞免疫学研究是必须的，因为抗原特定T细胞一般在机体周边循环系统发生的频率通常低于万中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技术被证实适用于冰冻后复苏的人类淋巴球，解冻后PMBC与新鲜分离样品有相当的效价，没有丧失功能。这一点对临床试验非常重要，它使科研人员得以并行分析免疫治疗前、后的病人血样，如果试验牵涉全国多个临床试验机构，病人血样可冰存并同时集中在中央实验室一齐被测试。同理，一个血样或标准对照品可被分装小份，被送到不同检验中心进行测试，以交互比对，同时有利LISPOT Cytokine技术流程的规范化、标准化。 （3） ELISPOT 未来展望ELISPOT 分析技术正在欧美各国发挥它的完整潜能，它让免疫学家可以直接洞察活体内T细胞相关生理学或病理学，就像是心脏外科医师手上的那张心电图，经由这个技术科研人员可以在活体内直接进入一个器官系统，在那里视察、发掘，得到全新的智识。从各国文献可见ELISPOT技术已经达到标准化、规范化的要求，并被广泛地应用在多项领域，包括监视癌症病人接受免疫疗程时的反应(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、肿瘤(Nagorsen, 2000)、或自体免疫病人体内的一个特定的免疫反应型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技术同时也在数个疫苗效价评估人体试验中，被当成重要的终结指针。2003年1月，世界卫生组织通过与大陆北京性艾中心合作，将应用ELISPOT技术来监测HIV疫苗研究免疫应答反应技术，该计划将是首次利用ELISPOT技术对亚洲国家从事HIV疫苗研究和临床试验的有关研究。我们期待未来此一技术能在我国免疫学界得到广泛地应用。 原理 ELISPOT就其原理来说实在是很简单的，从本质上说和ELISA的原理是一样的，理解起来并不难。细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过北京赛智创业科技公司的ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。传统的ELISA与ELISPOT都是根据酶免疫学检测原理，通过酶的高催化频率，放大反应效果，从而达到很高敏感度的检测效果。ELISPOT全名为Enzyme-linked Immunospot Assay，其技术原理与ELISA相似。其实验设计是在96微孔培养盘底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含sodium azide、内毒素endotoxin）的单株抗体。静脉血PBMC细胞经适当分离处理后，会被分配到微孔盘上，再接受适当的抗原刺激，并将微孔盘放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言，记忆型T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞激素，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞激素会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞激素可进一步使用生物素（Biotin）标记的二次抗体来标志，其后再以结合酵素的StreptAvidin与之作用，并加入酵素受质使其呈色，有反应作用的细胞会留下染色斑点。反应步骤可大致分为： （1） 利用特定细胞因子的单克隆抗体包被96孔板，封闭剩余的空白位点； （2） 加入细胞悬液，用特异性抗原刺激、活化细胞，产生细胞因子，细胞因子会往附近扩散与之前包被的抗体进行特异结合； （3） 洗掉细胞； （4） 加入酶标二抗特异与细胞因子进行结合，通过底物的显色反应，一个细胞所在位置就会显出斑点，最后利用显微镜或者特定的读板机（reader）就可以计算出样品中被激活细胞的数目。 以上是检测分泌细胞因子细胞的流程，如果是检测分泌特异抗体的细胞只需把包被特异抗体变为包被特异抗原即可。 本帖最后由 自主创新 于 2008-3-15 22:25 编辑 Elispot知识 Elispot与51Cr Release;Elisa;IC/Flow Cytometry的比较文件大小24.0 KB (24,576 字节)文件类型 DOC文档 随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用,使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于 游离的循环抗体或CK的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体 及CK的水平。80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分 泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探 索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义(ELISPOT)酶联免疫斑点法文件大小20.5 KB (20,992 字节)文件类型 DOC文档 ELISPOT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。本文介绍了ELISPOT法的原理,方法和应用领域等知识. ELISPOT诊断结核病更快速更准确文件大小19.5 KB (19,968 字节)文件类型DOC文档 英国的研究人员最近报道了一种比结核菌素皮肤试验（TST）更为有效的快速血液试验方法。这一灵敏的酶联免疫点化验方法(ELISPOT)可用来探测对结核杆菌抗原特异的T细胞。英国牛津大学Nuffield临床医学系Dr.Ajit Lalvani及其同事报告：这些抗原不存在于牛 结核分支杆 菌BCG和大多数环境中的分枝杆菌。新的免疫学测定法(ELISPOT)文件大小22.5 KB (23,040 字节)文件类型DOC文档 免疫方法学进展迅速，近年不断出现新的种类。现介绍检测人IFN为例的PVDF Elispot法，仅供参考。ELISPOT法用于计量单个细胞悬浮液中的细胞因子生成细胞。此方法可测定细胞受到刺激后，产生细胞因子生成细胞的量，及未接受和/或接受治疗的病人中细胞因子生成细胞的量。它的优点是：减少体外操作步骤，使对细胞因子生成过程的分析结果尽可能与体内一致。收藏 分享 评分 【摘要】 目的 构建肝癌多表位基因和含Tat PTD的多表位基因的原核表达载体，表达纯化融合蛋白，比较其细胞免疫反应。方法 人工合成多表位和Tat基因；分别克隆入原核表达载体pBVIL1，构建含Tat PTD及不含Tat PTD的肝癌多表位基因原核表达载体pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T；诱导表达、纯化目的蛋白；IFN- ELISPOT法检测免疫小鼠的细胞免疫应答。结果 正确构建复合表位基因的原核表达质粒，目的蛋白质在大肠杆菌中获到高效表达，并得到有效纯化；ELISPOT检测显示Tat+T蛋白免疫组能更有效地激发特异性T细胞免疫反应。结论 所构建的含Tat PTD的新型复合表位抗原能激活特异性CTL反应，为基于CTL表位的肝癌免疫治疗提供了实验依据。 【关键词】 肝细胞癌 T细胞表位 ELISPOT Tat PTD 【Abstract】 Objective To construct the prokaryotic recombinant plasmid to express HCC multiple epitopes gene, then purify the fused protein for ELISPOT analysis.Methods The gene of multi-epitope were gained and it was cloned into prokaryotic expression vector and expressed in E.coli. An recombinant eukaryotic expression vector was constructed and its eukaryotic expression was determined in transfected cells. Balb/c mice were immunized with different forms of antigen. The cell immune response was tested by ELISPOT.Results The recombinant prokaryotic plasmid was correctly constructed. The gene was expressed in E. coli. highly and the expressed protein was purified efficiently. The antigen specific T cell response IFN- release was much stronger in protein Tat+T group than in the other groups.Conclusion This preliminary result showed that immunization with those improved recombinant polyepitope antigen has high antigenicity, especially in induction of high CTL response. This research may be useful to further development of immunotherapy for HCC. 【Key words】 hepatocellular carcinoma;T-cell epitopes;ELISPOT;TatPTD 肝细胞癌（HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，我国肝癌患者约占全世界的50%，在我国加强肝癌的防治研究意义重大。随着分子免疫学、肿瘤免疫治疗学的迅猛发展，使免疫治疗可能成为治疗肝癌的有效手段13。主动特异性免疫治疗即肿瘤疫苗因其特异性高、针对性强又成为免疫治疗的方向与主流。寻找肿瘤特异性/相关性抗原，增强其免疫原性，提高肿瘤免疫治疗的效果已经成为肿瘤疫苗研究的核心问题。因此，本研究拟采用肝癌中高表达的AFP、MAGE-1分子作为模式肿瘤抗原，从抗原递呈方式角度提高肝癌复合表位的免疫原性，为基于CTL表位肽的肝癌免疫治疗打下基础。 1 材料与方法 1.1 材料 DNA限制性内切酶（EcoR、BamH、Xho和Xba）；PCR产物纯化试剂盒和质粒提取试剂盒购自博大生物公司；原核表达载体pET22b为Novagen公司产品，原核表达载体pBVIL1由本室构建并保存4；Ni-NTA superflow 购自 QIAGEN公司；ELISPOT检测采用法国DIACLONE公司的Murine IFN ELISPOT 试剂盒；多肽由上海博亚生物公司合成与纯化，纯度达90%以上；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。 1.2 肝癌复合表位基因的克隆 选取肝癌高表达的AFP和MAGE-1作为模式肿瘤抗原58，选中6个CTL表位作为研究对象，以-NG-为连接臂对各表位加以连接9。以HIV Tat蛋白的4757位氨基酸和通用PAPRE表位作为Tat 序列。 人工合成Tat（中间含EcoR、BamH）和多表位基因。通过原核表达载体pET22b将Tat和多表位基因连接。将含Tat PTD及不含Tat PTD的肝癌多表位基因加入6个his分别克隆于原核表达载体pBVIL1中，构建原核表达载体pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T，并对其进行酶切及DNA序列鉴定。 1.3 目的蛋白的表达、纯化 挑取单个克隆于37振荡培养过夜，次日按1%接种量接种于LB（Amp+）培养基中，37活化至A值达0.40.6时，42水浴摇床继续培养5h，收集菌体，取1ml诱导后的菌体沉淀15%SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色，选取表达量最高的作为蛋白纯化的工程菌。 制备包涵体，选用Ni-superflow进行重组蛋白的纯化，具体步骤按说明书进行。收集各部分洗脱峰，SDS-PAGE鉴定。凝胶过滤脱盐复性重组蛋白。 1.4 小鼠免疫方案 进行将6周龄Balb/c小鼠分为AC组，每组6只。A组为Tat+T重组蛋白组；B组为T重组蛋白组；C组为PBS对照组。重组蛋白免疫初次采用与弗氏完全佐剂1:1混合，50g/只，皮下多点和腹腔注射免疫小鼠；加强免疫使用弗氏不完全佐剂，皮下多点和腹腔注射免疫小鼠。初次免疫后，分别于第3周和6周各加强1次。末次免疫后2周处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，分离脾细胞作为效应细胞，用于IFN-的ELISPOT检测抗原的细胞免疫反应。 1.5 免疫小鼠脾淋巴细胞的分离 断颈处死小鼠，无菌取出脾脏，在 200目不锈钢网上研磨脾组织。将脾细胞悬液8ml缓慢沿管壁加入装有4ml Ficoll淋巴细胞分离液的透明离心管中，1500r/min离心20min，小心吸取白膜层，用10ml预冷的培养基洗2次。计数分离得到的淋巴细胞，最后将细胞重悬于20%胎牛血清的RPMI1640培养基。 1.6 免疫小鼠IFN-的ELISPOT检测 ELISPOT检测具体操作按Murine IFN ELISPOT 试剂盒产品说明书进行，主要步骤如下：（1）在用100l/孔70%乙醇清洗ELISPOT板，室温下放置10min；（2）弃去乙醇，100l/孔PBS洗板3次；（3）用10ml PBS稀释100l捕获抗体（capture antibody），混匀，加入PVDF板中，100l/孔，4静置过夜（16h）；（4）次日清空孔内液体，100l/孔PBS洗板1次，加入100l/孔2%脱脂奶PBS，室温封闭2h；（5）轻轻晃动ELISPOT板，弃去孔内液体，在纸上轻轻拍干，100l/孔PBS清洗1次；（6）在每孔中加入合适浓度的细胞悬液和刺激原混合液共100l，盖好板盖，于37 5%CO2孵箱中培养20h；（7）轻轻晃动ELISPOT板，清空孔内液体，在纸上轻轻拍干；（8）加入100l/孔洗液（含0.1%Tween20的PBS），4静置10min；（9）100l 0.1%Tween20 PBS清洗ELISPOT板3次，每次静置1min；（10）用10ml 1% BSA 的PBS稀释100l检测抗体（detection antibody），混匀，每孔加入100l，37 CO2孵箱中孵育1.5h；（11）清空孔内液体，100l 0.1%Tween20 PBS清洗ELISPOT板3次；（12）用1%BSA PBS稀释链亲和素标记的碱性磷酸酶（Streptavidin-Alkaline Phosphatase Conjugate），每孔加入1:5000的稀释酶液100l，37孵育1h；（13）清空孔内液体，100l 0.1%Tween20 PBS清洗ELISPOT板3次，拍干ELISPOT板直至没有残留液体；（14）在每孔中加入100l即用型BCIP/NBT底物反应液。室温避光显色210min，肉眼观察斑点的形成；待斑点形成后，用蒸馏水终止反应；（15）拍干ELISPOT板，4放置过夜，ELISPOT仪读取结果（ImmunoSpot 3.2 Beta 1软件），室温避光保存。转贴于 中国论文下载中心 2 结果 2.1 原核表达载体pBVIL1/T、pBVIL1/Tat+T的构建与鉴定 将Tat、多表位（T）基因克隆于原核表达载体pET22b,构建原核表达载体PET/Tat、PET/T,用EcoR和BamH双酶切PET/Tat和T基因，连接转化大肠杆菌JM109，连接Tat和多表位基因。 将含Tat PTD及不含Tat PTD的肝癌多表位基因克隆入原核表达载体pBVIL1，原核表达载体的构建过程见图1。酶切鉴定pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T的阳性克隆，经测序与设计序列完全一致，成功构建的原核表达载体可进行表达纯化。 2.2 目的蛋白的诱导表达与纯化 将测序正确的重组表达质粒转化大肠杆菌HB101，工程菌经IPTG诱导后，经 15% SDS-PAGE电泳pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T分别在分子量22103和21103处出现一新增的蛋白条带，其大小与预计值相符，而空载体pBVIL1对照表达17103的蛋白条带。融合蛋白主要以包涵体形式表达（图2）。 我们对不同的诱导条件进行了摸索，如诱导时的菌液浓度、诱导培养时间等。最终确定诱导前培养约2.5h至A达0.5，42诱导5h为最佳条件,进行重组蛋白的大量诱导表达与纯化。采用Ni柱法纯化目的蛋白，洗脱峰中的目的蛋白纯度较高（图3）。 2.3 ELISPOT检测免疫小鼠IFN- ELISPOT结果示意图见图4。检测结果显示：A组（重组蛋白Tat+T免疫组）产生的斑点数明显多于B组（重组蛋白T免疫组）和PBS对照组，差异有显著性（P0.05）。含Tat融合肽的重组蛋白Tat+T比不含Tat融合肽的重组蛋白T产生的细胞免疫反应水平高（图5）。图1 原核表达载体pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T的构建示意图 3 讨论 如何评价肿瘤抗原特异性T细胞反应，是抗肿瘤免疫治疗的基础。从T细胞免疫反应检测的方法来看，ELISPOT法是近年来逐步建立起来的通过检测细胞因子来评价T淋巴细胞功能和特异性的新方法，可检测单细胞水平上的细胞因子产生、分泌情况。这一方法的特异性和敏感性都很高，广泛应用于CTL表位鉴定，疫苗疗效监测1014。自从首次发现TatPT