受体介导的胞吞作用.ppt

受体介导的胞吞作用 Receptor-Mediated Endocytosis 生科院02级1班 郭政、闫佳洁 前言 v受体介导的胞吞作用是一种特殊类 型的胞吞作用，主要是用于摄取特 殊的生物大分子。如不同的蛋白质 ，包括激素、生长因子、淋巴因子 和一些营养物都是通过这种方式进 入细胞。 问题的提出 v胚胎发育起始于一个微小的的精子 和一个更大的卵细胞的结合。卵细 胞是由卵母细胞发展而来的，并且 积累卵黄。而这些卵黄是在雌性个 体中其他部位合成的。那么，这些 高分子量的卵黄蛋白是怎么能够进 入卵母细胞的呢？ 1964年，哈佛大学的Thomas Roth和Keith Porter报道了有关蚊子的卵黄进入卵母细 胞的可能的机理。他们注意到在卵母细胞 快速增长时期，在卵母细胞表面有许多压 低的纹孔，数量呈戏剧性的增长。这些纹 孔，是由原生质膜的凹陷构成的。在它们 的内表面被一层粗糙的表层所覆盖。 在一项有远见的计划中，Roth和Porter 假定卵黄蛋白是被特别的吸附在有被小 窝(coated pits)的膜的外表面，并将作为 有被小泡（coated vesicles)而吸入。这些 有被小泡脱离粗糙的表层后，一个与另 一个结合，使得它们变得更大。 v第一次观察到有被小 泡的结构是直到1969 年，由大阪大学的 Toku Kanaseki和Ken Kadota发现的。电子 显微镜检测到天然的 小泡部分与豚鼠大脑 相隔离，显示出有被 小泡被一个多边形的 柳条编制物覆盖。（ 图1 ）这些调查表明 胞被能够起到控制在 小泡的形成中原生质 膜的包裹作用。 有被小泡表面的网格模型 高倍电子显微镜下的照片 在生化自然杂志中的第一份有关有 被小泡的研究是由Barbara Pearse于 1975年在英国剑桥大学的一次医学研 究会议上发表的。Pearse揭露了一个过 程。此过程是通过将猪大脑的小泡膜 通过一个连续的蔗糖浓度梯度做离心 ，直到有被小泡达到纯化分离。有被 小泡中的蛋白质通过SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳被溶解和分离。 这个结果表示被膜含有一个分子 量大约在180000道尔顿的占优势 的蛋白质种类。Pearse命名这个蛋 白为网格蛋白（clathrin)。他通过 对几种不同类型动物细胞的分离 ，都发现了有被小泡在形成中的 与此相同的蛋白质（从分子量和 多肽图考虑的）。 新的研究 v在上述的研究之后，1973年，在达拉斯 的Texxas Medical学校的实验室中，由 Michael Brown和Joseph Goldstein又共 同提出了一个新的研究方向。Brown和 Goldstein开始对家族性血胆脂醇过多（ familial hypercholesterolermia FH）这 种遗传病产生了兴趣。 Brown和Goldstein开始了对FH的研究 ，他们分别取正常人和FH患者的皮肤 所派生的成纤维细胞(fibroblast)进行培 养，检测胆固醇(cholesterol）的代谢 过程。他们发现在胆固醇合成中酶的 控制率，HMG辅酶A还原酶可以在正 常的成纤维细胞中被环境中的脂蛋白 （lipoprotein)（例如LDL）抑制。（图 2） 测量正常成纤维细胞中的HMG CoA还原酶活性。 v正方形表示在胚胎血 清中有部分脂蛋白。 v实心圆表示全部脂蛋 白。 v三角形表示非脂蛋白 。 v从图中明显看出脂蛋 白可以降低酶的活性 ，而非脂蛋白对酶活 性几乎没有影响。 蛋白质浓度 血清百分数 v这样，在正常成纤 维细胞生长的培养基 质中加入LDL(low- density lipoprptein 低密度脂蛋白)的添 加物，会导致HMG 辅酶A还原酶活性水 平的降低，并且伴随 成纤维细胞的胆固醇 合成的减少。 在发生FH的成纤维细胞中测量 HMG辅酶A还原酶水平，发现它 们是正常成纤维细胞的4060倍 。另外，全部FH成纤维细胞中的 酶活性不受在环境媒介中LDL出 现的影响。（图3） v在第六天时，培养基被新 鲜的培养基替代。其中含 有5%人类缺脂蛋白的原 生质。 v在测量初期可以明显看出 细胞有很低的酶活性，这 是因为培养基中含有足够 的含胆固醇的脂蛋白，所 以细胞不需要再合成。 v一旦培养基换成缺脂蛋白 的基质，细胞就不能利用 基质中的胆固醇，于是就 增加了细胞中酶的数量以 便自身合成。 v而相反的，在FH中显示出 无论存不存在脂蛋白，细 胞中的酶都无反应。 实心圆表示培养于含有10%胚胎血清的成 纤维细胞。 空心圆表示纯合FH患者的成纤维细胞。 环境中的脂蛋白是怎样影响人工培 养细胞的细胞质中的酶活性呢？ 为了解释这个问题，Brown和 Goldstein开始了对细胞和脂蛋白之 间相互影响的研究。 他们向培养皿中加入了放射性标记（ radioactively labeled)的LDL，培养皿中 包含有从FH患者或正常人中获得的成纤 维细胞。正常的成纤维细胞以高亲和力 特性结合被标记的LDL分子，但是突变的 细胞显示出实际上没有能力与这些脂蛋 白分子结合。（图4） v圆形表示放射性125I 标记的LDL在37与正常的细胞结合 。三角形表示与FH的细胞结合。 v空心圆和三角为细胞在含有5mg/ml125ILDL缓冲液的 250mg/ml非放射性LDL中生长。实心圆和三角则不含有非 放射性LDL。 v在没有添加非放射性LDL的细胞中很明显看出，正常细胞结 合了一定数量的LDL，而FH患者细胞则不能结合。 v而在添加了非放射性LDL的细胞中标记LDL大量减少。因为 非标记脂蛋白与标记的LDL竞争结合。 这些结论表示出正常细胞有一 个LDL的高特异性受体，这个 受体在有缺陷的或者在FH病 人的细胞中丢失。 为了显像受体结合和内化作用（ internalization)的过程，Brown和 Goldstein与Richard Anderson合作 ，Richard Anderson利用电子显微 镜对细胞的结构有所研究。 v这个研究小组从正常的和带有LDL的FH 中慢慢提取成纤维细胞，这个LDL被共 价的连接于铁蛋白中。因为铁原子，铁 蛋白分子可以分散成电子带，就可以在 电子显微镜下被显像。 v当在4时，正常的成纤维细胞和LDL 铁蛋白慢慢形成。在这个温度下配体可 以与细胞表面结合，但不能被内化吸收 ，LDL铁蛋白微粒被发现结合于细胞 表面。 v最近的检测解释 LDL微粒不是随便 的分散在细胞表面 ，而是在原生质膜 上形成一个固定的 小的片段（ 0.5m）。这个 膜被一个“绒毛的 ”物质切割和覆盖 。（图5） 电子显微镜下观察的人成纤维细胞中结合了 LDL的有被小泡。LDL在结合了高密度电子 铁蛋白微粒中很明显。 在这些膜上的片段是有被小窝，最初被 Roth和Porter描述，并且在各种细胞类型 中被发现。尽管来自FH病人的的细胞的 表面被发现有相似数量的有被小窝，但没 有LDL铁蛋白结合在这些突变细胞上。 这结果支持了突变的FH等位基因翻译成 受体，而这个受体并没有能力结合LDL。 后来用电子显微镜对LDL铁蛋白的内化 作用进行研究，显示出胞吞作用的路径是 这些脂蛋白的内化。 基于这些结论，这个小组假定受体结合 LDL的内化作用是在有被小窝中LDL受 体的某部位密切相关的。接着这个假定 ，如果一个LDL受体不能在有被小窝上 固定的，它就不能传递它的结合配体给 细胞的溶酶体（lysosome），并且这样 将不能影响在细胞中胆固醇的合成。 这时，一个不同类型的突变的LDL受体被 发现。LDL受体提供了这个新的缺陷（通 过病人发生J.D突变所了解的）结合放射 性标记的LDL的正常总数，受体结合脂蛋 白不能被内化，所以就不能被传送至细 胞质的溶酶体进行加工。 Anderson和他的合作者假定LDL受体 是一个跨膜蛋白，正常的会固定的在 有被小窝上，因为它的细胞质区域是 与有被小窝的成份特别的结合。可能 网格蛋白（但是后来有关联的，例如 适应物的小亚基，正如下面讨论的） 因为这个在细胞质区域的缺陷，J.D突 变受体是不能在细胞的有被小泡固定 。有这种突变的人表现出相同的表现 型，因为病人的受体是不能结合到LDL 上的。 后来的研究决定了正常的LDL受体是个 有839个氨基酸的跨膜糖蛋白，并在蛋 白的C末端有50个氨基酸从膜延伸至 内部作为细胞质的一个区域。在对J.D 突变受体的分析中显示出蛋白质包括 了一个简单的氨基酸代谢：一个酪氨 酸残基正常定位的807位置被半胱氨酸 取代。这个简单的在氨基酸序列上的 变化消除了蛋白质在有被小窝上变得 集中的能力。 vLDL与LDL受体结合，内吞入细胞使其获 得脂类，主要是胆固醇，这种代谢过程 称为LDL受体途径（LDL receptor pathway），该途径依赖于LDL受体介导 的细胞膜吞饮作用完成 。 在接下来的几年中，他们的注意力转向了其 他受体的细胞质尾部的氨基酸序列，这些受 体在有被小窝中变得固定。那么，有没有一 个共同的“内化作用信号”？有许多不同的 受体比如胞吞作用的中间受体包括一个必要 的酪氨酸残基，这些残基通常位于序列的 YXX，这其中的Y是酪氨酸，而X可以是 任意的氨基酸，而是一个含有大的疏水链 的氨基酸。研究表明受体的YXX序列与 AP2结合素的一个多肽(亚基)结合。 X光射线显示出结合素和内化作用信号之间相互作用的特性。 v紫色表示膜受体上内化 信号的X光下的结构。它 结合在AP结合素的链 上。 v灰色表示亚基。 亚 基几乎全部由折叠片 组成，有两个疏水的凹 陷，其中一个与酪氨酸 残基（Y）结合，另一个 结合了内化作用信号的 一个大的疏水侧链。L 为 亮氨酸。 这种类型的相互作用就像是电线末端 的两个分叉的插头与插座之间的对应 关系。一旦内化作用信号的残基结合 到结合素上，一种额外的吸引力被引 起，通过在受体的中枢和亚基一段 片段之间结合氢的构造。这些不同分 子间的联系的结果，结合素在有被小 窝中被优先的胞吞作用捕捉。 我们再来回忆一下受体介导的LDL的 胞吞作用的过程 家族性血胆脂醇过多 （familial hypercholesterolemia FH） 纯合体的个体含有致病基因（FH等 位基因）会导致严重增加血清胆固醇浓 度。（正常人为200mg/dl，而FH为 800mg/dl），这种病常常导致阻断动脉 （动脉粥样硬化），并且通常在患者20 岁之前就死于心脏病。在当时，几乎没 有人知道这种致病的生理原理。而且， 目前尚无特效药物可以治疗。 LDL受体 vLDL受体是一种多 机能蛋白，由839 个氨基酸组成的 36面体结构蛋白 ，分子量约115kD 。由五种不同的 区域构成，各区 域有其独特的功 能 。 vLDL受体广泛分布于肝脏、动脉壁 平滑肌细胞、肾上腺皮质细胞、血 管内皮细胞、淋巴细胞、单核细胞 、巨噬细胞，各组织或细胞的