实验RNA提取方法及原理.ppt

实验一、RNA提取方法及原理 一、研究背景 二、方法及原理 一、研究背景 1. RNA研究的重要性 DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生 物大分子，是生命现象的分子基础。 DNA 的遗传信息决定生命的主要性状，而 mRNA在信息传递中起很重要的作用。其 它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋 白质的生物合成中发挥不可替代的重要功 能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信 息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的 过程中举足轻重。 2 RNA分布 不同丰度组织名称 样品 量 总RNA含量 高丰度肝脏1mg2-4g 脾脏1mg 心脏1mg 中丰度大脑1mg0.05-2g 胚胎1mg 肾脏1mg 肺1mg 低丰度膀胱1mg0-0.05g 骨1mg 脂肪1mg 高丰度成纤细胞1050.5-1g 人白细胞105 中丰度酵母1050.5-1.5g 拟南芥叶片1mg0.2-0.5g 低丰度烟草叶片1mg0.05-0.1g 玉米叶片1mg 二、方法及原理 1 、 RNA的提取流程 （1）样本前处理 （2）细胞裂解 （3） RNA的纯化及获得 RNA提取流程 样品前处理注意点 选择新鲜血液，不得超过4小时 选择新鲜的幼嫩组织 选择处于生长旺盛的时期收集细胞 选择新鲜组织，生长旺盛的组织 可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞 然后加入一定量的TRNzol，-70保存较长时间 去掉培养基，加入一定量TRNzol -70 保存较长时间 推荐使用专门的RNA样品 储存液进行储存 液氮或加入RNase抑制剂中保存， 避免反复冻融 RNA提取流程 样品前处理中如何保存样本 RNA提取流程细胞裂解，以释放RNA 异硫氰酸胍/酚TRNzol总RNA提取试剂 独特配方-RNAplant植物RNA提取试剂 胍盐/-巯基乙醇RNAprep系列RNA提取试剂盒 RNA提取流程 RNA的纯化及获得 RNA纯化要求 1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质 2 排除有机溶剂和金属离子的污染 3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 4 排除DNA分子的污染 2. RNA提取的注意事项 杜绝外源酶的污染 a.严格戴好口罩，手套。 b.实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆 ，电泳槽，实验台面等要彻底处理。 c.实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须 确保 RNase-Free。 阻止内源酶的活性 a.选择合适的匀浆方法。 b.选择合适的裂解液。 c.控制好样品的起始量。 明确自己的抽提目的 a.任何裂解液系统在接近样品最大起始量时 ，抽提成功率急剧下降。 b.RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实 验的一次成功，而不是得率。 Rnase 污染的10大来源 1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子 (Ca, Mg) 10：后续实验所用 的酶 复习核酸的提取方法 lRNA的提取 l苯酚水溶液提取 l细胞破碎 匀浆等体积90苯酚水溶液 振荡RNA、Pro分开RNA、多糖（水 层）； DNA、Pro（苯酚层） l冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂 复习核酸的提取方法 l DNA提取 l浓盐法：1mol/L氯化钠溶液提取，含少 量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质 l或：先用稀盐除去RNAPro，再用浓盐 提取 l也可用苯酚法，苯酚层得到 DNA、Pro 复习核酸的提取方法 l核酸的沉淀 lDNA的等电点4-4.5，RNA的等电点2-2.5. l收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异 丙醇沉淀。 l在除去水样层后，样品中的DNA 和蛋白也 能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析 出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇 能沉淀出蛋白。 Trizol 试剂提RNA的原理 lTrizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相 的快速抽提总RNA的试剂 。Trizol中含苯酚和异 硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。 lTrizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的 试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整 性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与 DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和 有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水 样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除 去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉 淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA， 在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。 TRIzol法提取流程 1. 样品处理： 组织：取 100mg 组织（新鲜或 -70 及液氮 中保存的组织均可）置匀浆器中 ，加入 1ml Trizol 充分匀浆，匀浆液转1.5ml 离心管中,室温 静置 min 。 2 .加入 0.2ml 氯仿，振荡 15s ，静置 2min 。 3 .4 离心， 13000g 15min ，取上清。 4 .加入 与上清1:1的异丙醇(约0.5ml)，将管中液 体轻轻混匀，室温静置 20min (-20 ，时间长 效果更好)。 取200-300ul从5步往下做。 TRIzol法提取流程 5 .4 离心， 13000g 10min ，弃上清。 6 .加入 1ml 75% 乙醇，洗涤沉淀,将沉淀打 碎。 4 ， 13000g 5min ，弃上清。 7.100%乙醇,轻轻洗涤沉淀.(不用将沉淀打碎 ) 8. 晾干，加入适量的 H 2 O 溶解（100ul） （ 65 促溶 10-15min ）。 9.定量。 细胞 基因组DNA 水相 有机相 RNA 氯仿 纯化 pH5.7 离心 加入裂解液 (TRNzol-A+) 实验流程图 细胞选择 贴壁细胞 悬浮细胞 RNARNA提取常见问题提取常见问题 q RNA 的降解 q OD260 /OD280 比值偏低 q 电泳带型异常 q 下游实验效果不佳 RNARNA降解降解 q 新鲜细胞或组织： 裂解液的质量 外源RNase的污染 裂解液的用量不足 组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很 难避免 RNA 的降解。 建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更 多裂解液。 RNARNA降解降解 q 冷冻样品： 样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至 -70冰箱保存。样品要相对小一点； 先用液氮研磨，再加裂解液匀浆； 样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须 预冷，碾磨过程中及时补充液氮。 OD260 /OD280 比值偏低 q 蛋白质污染： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分 层的离心力和时间要足够。 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 q 苯酚残留： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分 层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 OD260 /OD280 比值偏低 q 抽提试剂残留： 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。 解决办法:再沉淀一次后，溶解。 q 设备限制： 测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。 q 用水稀释样品： 测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用 水作为稀释液将导致比值的降低。 电泳带型异常电泳带型异常 q 非变性电泳： 上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧 ，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。 q 变性电泳条带变淡： EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量， 变性电泳比非变性电泳要淡一些； 甲醛的质量不高 。 下游实验效果不佳下游实验效果不佳 q RNA 降解 q 抽提试剂的残留 75% 乙醇洗涤 q 样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀 q DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA RNA的保存 l短期保存：可将RNA溶解于TE缓冲液(10mmolL Tris ，1mmolL EDTA)或无：RNA酶水(0.1mmolL EDTA)中，保存于一20。在保存RNA样品时，通常使 用EDTA来螯合RNA酶以防止其降解RNA。值得注意的 是，许多实验室配制EDTA后常使用很长时间甚至数年 ，这种长期使用的EDTA溶液常有微生物存在，反而会 造成RNA酶的污染。 l中长期保存：相对于一20，一80可进一步防止RNA 降解。可将RNA溶解于TE缓冲液或无RNA酶水中，