荷叶碱的制备及类似物的合成毕业论.doc

兰州理工大学生命科学与工程学院毕业论文 荷叶碱的制备及类似物的合成专业名称：制药工程 学号：00000 姓名：XXX指导教师：XXX 职称：副教授中文摘要： 随着我国人口老龄化的到来，老年痴呆症疾已成为继癌症、糖尿病、心脑血管病后的又一重大疾病。目前研究发现了一些具有乙酰胆碱酯酶抑制的活性成分，主要为生物碱、萜、黄酮和香豆索等结构类型的化合物。其中生物碱类乙酰胆碱酯酶抑制剂如石杉碱甲、 加兰他敏等因活性高、选择性强而受到广泛的关注。研究表明，在目前发现的天然乙酰胆碱酯酶抑制剂中，生物碱占绝大多数，约占60%以上，但这些成分应用到临床上还不多，主要是由于活性不是很强，选择性不好的原因。因此，进一步开展对具有乙酰胆碱酯酶抑制活性成分的筛选，寻找新的具有高抑制活性和选择性的先导化合物对发现新的治疗老年性痴呆症具有重要意义。本实验以具有较好乙酰胆碱酯酶抑制活性的荷叶碱初步改造物为先导物，通过乙酰胆碱酯酶与乙酰胆碱酯酶抑制剂的双中心原理，对荷叶碱进行一系列的结果改造，以期获得一种活性更强、专业性更好的体外乙酰胆碱酯酶抑制剂，进而为今后的临床应用提供条件。关键词：老年痴呆症 乙酰胆碱酯酶抑制剂 荷叶碱 结构改造AbstractWith the arrival of population aging, Alzheimers disease has become the another major diseases after the cancer, diabetes, cardiovascular and cerebrovascular. Many acetylcholine- sterase inhibitory activity has been found,such as alkaloids, terpenoids, flavonoids and coumaric cable structure of the type of compounds .It has showed that in the current discovery of natural, about 60% or more acetylcholinestera1se in hibitors is alkaloid. But these havent be used in our life,because of the low activity or low choice. Therefore, working on acetylcholinesterase inhibit- ory activity of constituents, looking for the new high inhibitory activity and selecting lead compounds on the discovery of new Alzheimers treatment have becoming more and more important. In this experiment, we used the good inhibitory activity of acetylcholinesterase nuciferine initial to get the lead compound materials,by acetylcholinesterase acetylcholinesterase inhibitors ,with the dual center principle.Keywords: acetylcholinesterase inhibitors Alzheimersdisease nuciferine restructuring 目录中文摘要1Abstract2一、综述4(一)老年痴呆症4（二）生物碱类乙酰胆碱酯酶抑制剂4（三）荷叶碱及其系列改造7二、材料与方法8（一）、材料和仪器8(二)、试验方法8三、结果与分析12（一）、生物碱提取结果12（二）、荷叶碱G-1制备结果12（三）、荷叶碱G-2制备结果12四、讨论13五、结论13参考文献13一、综述(一)老年痴呆症老年痴呆症亦称阿尔茨海默病(Alzheimer,s Disease)简称 AD。 1907年由德国病理学家阿尔茨海默发现。指的是一种持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、 分析判断、视空间辨认 、辨认等方面的障碍，常发生于 50岁以上的老年人 。 随着我国经济的飞速发展和广大人民生活水平的日益提高，人均寿命也随之延长，使我国60岁以上老年人日益增多，预计我国2015年老年人口将超过2亿，本世纪40年代后期可能突破4亿。老年痴呆的发病率随着人口老龄化的进展呈逐年上升的趋势。目前全世界患病人数已超过1800万，我国患病人数约有500万，是世界上患病人数最多的国家。据报道，目前我国60岁以上每20人中有1人，80岁时每6人中有1人，90岁时每3人中有1人患此症， 已成为继心 脑血管疾病后，威胁我国老年人健康的主要疾病。在美国，AD继心、 脑血管疾病，癌症之后，成为成人死因的第四位。预计在今后20年内其患病的人数将增长3倍，由于AD的病因、发病机制还不十分清楚，不能早期诊断，更无有效的治疗措施，因此加速对AD致病机理的研究和寻找有效的AD治疗药物有着重要的医学和社会意义，已经成为国际医药界瞩目的热点和前沿领域。AD的生化机理和发病机制的研究普遍认为，AD患者脑内胆碱能功能的减退是认知障碍和记忆能力缺损的直接原因，13淀粉样蛋白(13amyloidpeptide，A B)是引起患者病理学特征的根本原因，A 13的聚集沉积诱发一系列的生化反应，从而导致神经功能紊乱。因此治疗AD可以通过增加脑内乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)含量，减少A B的产生和聚集，促进A13的分解等方法。（二）生物碱类乙酰胆碱酯酶抑制剂目前临床使用的AD治疗药物主要是乙酰胆碱酯(Acetylcholinesterase，AChE)抑制剂，该类药物能够选择性抑制脑内AChE的活性，延长ACh在大脑内的存留时间，提高AD病人的胆碱神经功能和认知能力。美国食品和药品管理局(FDA)批准上市的五个AD治疗药物中有四个为AChE抑制剂，包括他克林(tacrine)、多奈哌齐(donepezil)、利斯的明(rivastigmine)和加兰他敏(galanthamine，GNT)。但是，已有的AChE抑制剂通常只能减轻症状而不能从根本上治愈AD，而且存在肝中毒、半衰期短、中枢选择性差等缺点而在临床应用上受到限制。因而，世界各地对新型、低毒、高效的胆碱酯酶抑制剂的研究日趋激烈，特别是从天然动植物中寻找并发现乙酰胆碱酯酶抑制剂或着是根据构效关系推测其有可能成为胆碱酯酶抑制剂前体物质，以期获得新型胆碱酯酶抑制剂的的思路和方法成为了共同的做法。研究表明，生物碱类乙酰胆碱酯酶抑制剂因活性高、选择性强而受到广泛的关注，在目前发现的天然乙酰胆碱酯酶抑制剂中，生物碱占绝大多数，约占60%以上。因此进一步开展对天然生物碱的研究具有极其重要的意义。目前对生物碱的研究取得了以下的成果：1.石杉碱甲 石杉碱甲(HuperzineA，图1)是从石杉属植物千层塔( 蛇足石杉，Hu perzia serrata)中分离得到的一种新型生物碱有效单体【2】。与其它目前开发用于治疗AD的药物相比，石杉碱甲对脑内乙酰胆碱酯酶具有极高的选择性、抑制性和可逆性抑制， 提高脑内AChE水平作用持续达6h，优于加兰他敏,多奈哌齐和他克林【3】。该品口服可改善AD患者的记忆和认知行为障碍，无严重不良反应，已由中国科学院上海药物所研制开发为一种可逆性治疗AD药物【4】。但石杉碱甲在植物中的含量很低， 其复杂结构又使人工合成成本远远高于植物提取，使得在保留活性基础上的结构简化工作显得非常迫切。为阐明石杉碱甲抗乙酰胆碱酯酶活性的构效关系和寻找更有效的治疗早老性痴呆的药物，合成了大量石杉碱甲的衍生物和类似物。起初对石杉碱甲的结构改造在它易于修饰的部位,用苯环、嘧啶酮环、苯酚、邻苯二酚等相似结构替代石杉碱甲的吡啶酮环(A环)，生物活性大大降低。而三碳桥环及其双键、 桥头的甲基和环外双键对于其抗胆碱酯酶的活性是必须的，如失去或被其他基团替代，活性就大大降低。在石杉碱甲的氨基位置引入胺甲基、羟甲基或叠氮等取代基，活性也几乎丧失。这些实验表明，石杉碱甲是个紧凑的结构，已有的结构要素一个都不能少。1996年，Kozikowski 等在过去为人们所忽略的石杉碱甲的C一1O位进行了改造，合成了在C一1O位引入2个甲基取代的消旋类似物 A,其活性与消旋的石杉碱甲相当,如用一个环丙烷基替代2个甲基，其体外活性可与(一)石杉碱甲相比拟。进一步的研究表明，当1O位甲基在直立键时,它的乙酰胆碱酯酶抑制活性比消旋石杉碱甲强8倍，而消旋石杉碱甲的活性比平伏的1O位甲基类似物强 1.5倍；如取代基为乙基、 正丙基等稍大的基团，其活性大大降低。分子模拟研究显示，石杉碱甲的ClO横键附近酶的蛋白质残基是亲水性的,竖健附近则是疏水性的,而且此酶有一空穴,大小恰好能容纳甲基。对石杉碱甲的氨基修饰所得的众多席夫碱衍生物中，有的生物活性接近石杉碱甲,如 isovanillinhupA,只是在稳定性方面有待改进。在此基础上， 中国科学院上海药物研究所合成了在稳定性和选择性等方面都要强于 isovanillin hupA的ZT一1,已申请了中国、美国、欧洲和日本专利。在欧洲已完成I期临床,在国内也已批准进入临床研究。石杉碱甲的特殊结构,使保留其整体骨架的类似物合成在难度上不亚于石杉碱甲的全合成。科学家们期待能应用一些结构简化的片段代替石杉碱甲,然而已合成的可能的单环或双环结构几乎没有活性， 人们开始转向用石杉碱甲的结构判断与现有的结构最简单的乙酰胆碱酯酶抑制剂 tacrine结合。一个烷烃( n=7 )连接的双分子tacrine(BISTacrine)和石杉碱甲的桥头环结合tacrine的化合物huperineX和Y显示，有比石杉碱甲和 tacrine更好的乙酰胆碱酯酶抑制活性。一系列tacrine与石杉碱甲的( A+B ) 环用烷链相连接的 化合物也显示了较好的活性，其中化合物 B( n=1O )的活性是石杉碱甲的13倍,tacrine的25倍，不过选择性远远低于石杉碱甲【5】。 图1 石杉碱甲及其类似物的结构2. 加兰他敏 加兰他敏(Galanthamine,图2)是从石蒜科植物中分离得到的一种生物碱,主要来源于黄花石蒜(Lycoris aurea)、石蒜(L.radiata)及白水仙(Narcissus papyraceus )鳞茎、夏雪片莲(Leucojumaestivum) 、雪片莲(L.vernum)、沃氏雪花莲(Galanthus woronawii)的叶、球茎、克氏雪花莲 (G.krasnovii)、雪花莲(G.nivalis )的全草、斯特伦伯石蒜(Sternbergia sicula)球茎和波斯石蒜(Ungernia spiralis)叶等【6】。加兰他敏是一种可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂，能刺激烟碱受体【7，8】，提高胆碱功能和记忆,其疗效与他克林相似,稍弱于毒扁豆碱,有效时间长,半衰期56h,不良反应少,且无肝毒性【9】。薛寿儒等报道，分别应用加兰他敏胶囊和吡拉西坦胶囊治疗37例老年痴呆和单纯性记忆障碍，加兰他敏组总有效率达70，而吡拉西坦胶囊组总有效率仅达40%【10】。 图2 加兰他敏的结构3. 毒扁豆碱 毒扁豆碱(Physostigmine，图3)为豆科植物毒扁豆(Physostigma venenosum)种子的主要生物碱，是一种非选择性可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂,它能抑制G1和G4AChE的形成【11】，提高大鼠记忆和改善东莨菪碱所致学习记忆障碍【12】,易于吸收和透过血脑屏障,毒性大,半衰期较短,t1/2为30min,治疗窗较窄【13】。 酒石酸庚基毒扁豆碱(Eptastigmine)为毒扁豆碱的亲脂性衍生物， 能适度抑制血浆及红细胞内的乙酰胆碱酯酶活性。疗效强于毒扁豆碱,酶抑制时间可达24h,毒性仅为毒扁豆碱的160【14】。 图34.其他生物碱 小檗碱(Berberine)、巴马亭(Palmatine)和去氢吴茱萸碱(Dehydroevodiamine)能改善东莨菪碱所致大鼠学习记忆障碍【15，16】。石蒜科文殊兰属植物C.jagus和C.glaucum在尼日利亚作为治疗老年性痴呆的传统用药,从中分离得到的网球花碱(Haemanthamine )、Hamayne 、Crinamine和石蒜碱(Lycorine)能提高脑内乙酰碱胆碱含量【17】。党参总碱有改善东莨菪碱所致学习记忆障碍和促进胆碱乙酰基转移酶生成乙酰胆碱的作用【18】。但是，这些成分应用到临床上还不多，主要是由于活性不是很强，选择性不好的原因，还有待继续筛选。因此，本次实验就着重开展荷叶碱及其结构改造物对乙酰胆碱酯酶的体外高活性抑制能力的研究。（三）荷叶碱及其系列改造在本实验前期的研究工作中表明，荷叶中存在大量生物碱，其乙酰胆碱酯酶抑制活性研究显示荷叶碱胆碱酯酶抑制活性一般，但荷叶碱初步改造物具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制力。根据构效关系的研究，推测若对荷叶碱加以改造，其乙酰胆碱酯酶抑制活性会得到较大的提高，因此本实验设计对其进行结构改造，以获得活性更高专一性更强的新型药物1.荷叶碱荷叶碱为荷叶中的主生物碱，约占荷叶总碱的50%以上。荷叶碱由四个相连的六元环组成，其中环1、2位为甲氧基，7位为氮甲基，根据乙酰胆碱酯酶抑制剂的双中心原理推测，若将1、2为的甲氧基消解羟基，则其乙酰胆碱的专一性结合能力将会的到加强，并且其极性将得到一定的增大。根据结构类似物的许多乙酰胆碱酯酶抑制剂结构研究，7位的与氮相连的集团的大小、极性等对乙酰胆碱酯酶抑制剂的活性有直接的影响。2.荷叶碱G-1 使用无水DMF为溶剂，二苄基二硒、硼氢化钠对荷叶碱进行一位甲氧基消解，以获得荷叶碱G-1。已实验获得该化合物具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性。 3.荷叶碱G-2使用乙氰、三溴化铝对荷叶碱G-1进行进一步改造，将其2位甲氧基消解为羟基，的荷叶碱G-2。二、材料与方法（一）、材料和仪器1、药材 荷叶（购自兰州安宁医药公司复兴厚药庄，由兰州理工大学杨林副教授鉴定。）2、试剂工业乙醇 氯仿（分析纯） 浓盐酸（分析纯） 浓氨水（分析纯） 氢氧化钠（分析纯） 浓盐酸（分析纯）浓硫酸 硼氢化钠 乙氰(分析纯) 二苄基二硒 三溴化铝 柱层析硅胶 GF-254薄层硅胶 3、仪器HH-2数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司） ZF-7型三用紫外分析仪（上海金达生化仪器有限公司） RE-5286A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂) SHB-IIIA循环水式多用真空泵（保定高薪区阳光科教仪器厂） KQ-250DE型数控超声波清洗器（40KHz，80W，）DL-3005低温循环水浴（江苏金坛市医疗器械厂） 冰箱 移液枪（200mL，1000mL） 分析天平 容量瓶 冷凝管 烧杯（500mL）玻璃棒 玻璃柱 圆底烧瓶（1000 mL，500mL，100,5L）三口圆底烧瓶（100ml，50ml）分液漏斗（3000 mL，100ml）布氏漏斗 抽虑瓶 电吹风(二)、试验方法1、生物碱提取过程(1) 药材预处理将药材用粉碎机粉碎（在粉碎药材前要将粉碎机清理干净，避免上种药材混入，造成实验误差）（2）生物碱提取 称取荷叶粉沫500g加入到5L的大圆底烧瓶中，按照质体比1:7加入3500ml工业乙醇，85水浴加热回流两次，每次2h，抽滤并合并回流液。将抽滤液分批加入1000ml圆底烧瓶减压蒸馏，浓缩至粘稠浸膏。在浸膏中加入约600ml水溶解，使用2mol/L的HCL将PH调至2-3，充分搅拌并静止过夜。对过夜后的溶解液进行抽滤，滤液使用2mol/L NaOH将PH调至10-11，将溶液转入分液漏斗中使用氯仿萃取4次，每次氯仿700ml，减压蒸馏氯仿。既得荷叶总碱。 实验现象：所得荷叶醇提物为深深的砖红色，经浓缩后获得大量黑色浸膏，此浸膏在加入水后并不溶解，此时水中显淡淡的砖红色，在调PH至2-3后，水的颜色有加深，考虑到浸膏太过粘稠并不溶于水，所以使用玻璃棒对其进行了充分的搅拌，此时水溶液的颜色已变为较深的砖红色。在抽滤后的酸性溶液中加入NaOH调碱时，在PH调至5-6时溶液开始出现大量砖红色絮状沉淀，继续加NaOH后絮状沉淀继续增加，在PH调至9后，絮状沉淀的增加减少。在萃取时，氯仿溶液显浅绿红色。2.荷叶总碱的细分离2.1荷叶总碱的粗分离（1）样品的预处理及装柱根据资料得知荷叶总碱有四种主要成分，其中荷叶碱含量最高，既为薄层板上的最主点。将所得的荷叶碱点准备上样与薄层硅胶色谱柱上进行分离，点总样于4*8的小型号GF254薄层板硅胶板上，使用氯甲比为1:1混合液为展开剂，展开，所点样品主点Rf值大于0.5,并且样品混合未得到分离。重新点样，使用氯甲比为10:1混合液展开，所点样品主点分离任然较模糊，使用氯甲比为35:1混合液展开，展开结果显示较好。荷叶碱的展开主点Rf值约为0.3由此确定使用氯甲比为35:1的混合液为洗脱剂。 将所得的荷叶总碱称取2.8g（2.823g），使用少许氯仿溶解（约3ml）转移至小型蒸发皿，称取1.5g硅胶，将硅胶加入蒸发皿中的氯仿溶解液中，适当搅拌溶液，将蒸发皿静止与通风厨下，待其挥干。称取薄层色谱柱硅胶70g，置于 250ml烧杯中，使用氯甲比为40:1的洗脱液溶解并搅拌至悬浊液，玻璃棒引流装入中型玻璃柱中，静止待其沉降，打开玻璃柱活塞，适量的放出少许溶剂至溶液上端略高于硅胶层2cm时关闭活塞。将蒸发皿中已挥干了溶剂的的硅胶使用研磨棒研细，并使用漏斗加入玻璃柱中，尽量保持硅胶曾的平整，使用少许洗脱剂冲洗漏斗及玻璃柱壁中所粘的硅胶粉末。再称取1.5g柱层析硅胶将其再加入柱中作为最上层的覆盖。 （2）样品的洗脱加入足量洗脱剂于柱中（刚开始需用吸管缓加，以免将硅胶被冲起），使用100ml锥形瓶接收洗脱液，开始冲柱，每次洗脱液接受至70ml左右换接受瓶，并将所接受的洗脱液移入200ml圆底烧瓶中进行减压蒸干，再使用少许氯仿（约1ml）溶解并移入小青霉素瓶中，再次使用少许氯仿（约1ml）冲洗烧瓶两次，将冲洗液移入同一个青霉素瓶中，并对所对应的青霉素瓶进行标签编号(共约45瓶，在冲至三十瓶左右时所得冲洗液中所含有效成份太少，所以改用氯甲比为30:1洗脱液冲洗)。（3）样品的点样粗分离对上步所得的青霉素瓶中的溶液从第一瓶开始点样于GF254硅胶2*5薄层板上，每瓶对应一个点，每板点三个样品点及一个荷叶碱对照点，使用氯甲比为20:1为展开剂依次进行展开，将所得的薄层板使用电吹风吹干，于254荧光灯下观察结果。结果显示所得样品整体可分为5部分既瓶35:；69；1019；2129；3045，根据对照判断大体得知8号为较纯荷叶碱，3-5主组份相似，6-9主组份为荷叶碱，10-19主组份相似，20-29主组份相似，30-45主组份相似。将成份相似的各组分合并，并依次标好标签，得五瓶样品液，静止于通风厨中待其挥干。2.2荷叶碱的细分离（1）样品的预处理及装柱将上步所得的荷叶碱主成份样品称重，得1.523g，使用约1ml氯仿溶解并点样于GF254硅胶4*8薄层板上，使用氯甲比为20:1展开剂进行展开，结果显示混合样品略微展开，再使用氯甲比为20:1的展开剂尝试展开，结果显示混合样品有较好的分离，所以决定使用氯甲比为20:1溶解为洗脱剂。 将样品溶液转移至小型蒸发皿中，称取1g柱层析硅胶，加入蒸发皿中混合并搅拌，将蒸发皿静止与通风厨下，待其挥干。称取薄层色谱柱硅胶45g，置于 250ml烧杯中，使用氯甲比为20:1的洗脱液溶解并搅拌至悬浊液，玻璃棒引流装入小型玻璃柱中，静止待其沉降，打开玻璃柱活塞，适量的放出少许溶剂至溶液上端略高于硅胶层2cm时关闭活塞。将蒸发皿中已挥干了溶剂的的硅胶使用研磨棒研细，并使用漏斗加入玻璃柱中，尽量保持硅胶曾的平整，使用少许洗脱剂冲洗漏斗及玻璃柱壁中所粘的硅胶粉末。再称取1.5g柱层析硅胶将其再加入柱中作为最上层的覆盖。（2）样品的洗脱加入足量洗脱剂于柱中，使用100ml锥形瓶接收洗脱液，开始冲柱，每次洗脱液接受至50ml左右换接受瓶，并将所接受的洗脱液移入200ml圆底烧瓶中进行减压蒸干，再使用少许氯仿（约1ml）溶解并移入小青霉素瓶中，再次使用少许氯仿（约1ml）冲洗烧瓶两次，将冲洗液移入同一个青霉素瓶中，并对所对应的青霉素瓶进行标签编号，共28瓶。（3）样品的点样粗分离对上步所得的青霉素瓶中的溶液从第一瓶开始点样于GF254硅胶4*8薄层板上，每瓶对应一个点，每板点三个样品点及一个荷叶碱对照点，使用氯甲比为10:1为展开剂依次进行展开，将所得的薄层板使用电吹风吹干，于254荧光灯下观察结果。结果显示所得样品整体可分为3部分既瓶37:；716；17-28，根据对照判断大体得知7-16号为荷叶碱。将7-16号瓶样品合并，并置于通风厨下挥干，得纯度较高荷叶碱。3荷叶碱的结构改造 3.1荷叶碱1位脱甲氧基（1）反应制备荷叶碱G-1取三口圆底烧瓶一个，将其架于油浴上，使用磨口塞塞住左口，橡皮塞塞住右口（目的是下步注入反应剂及催化剂），使用磨口旋塞塞住中间一口并连接上N2排气装置，进行氮气排气。称取二苄基二硒111mg（0.325mmol），使用无水DMF5ml溶解，并注入三口圆底烧瓶中。继续启动氮气排气操作，在氮气保护下，从三口瓶左口加入150mgNaBH4，塞上左口，停止氮气排气操作，将烧瓶置与提前升温为60度的油浴锅中，使用磁力搅拌器搅拌反应二十分钟。在反应时间到后，将事先使用6mlDMF溶解的141mg（0.5mmol）荷叶碱使用注射器从橡皮塞口注入烧瓶，调节温度至140度，反应2h，停止反应。现象：二苄基二硒为黄色粉末，易容与DMF中，显淡绿色，在加入NaBH4后无明显现象，温度60度下反应二十分钟后，溶液渐渐变为浅棕色。当加入荷叶碱反应1h后，溶液显橙黄色，反应2h后溶液显棕色。（2）分离纯化荷叶碱G-1使用毛细管吸取并点样反应所得的反应液于2*5cmGF254薄层板，同时点荷叶碱对照，使用氯甲比20:1展开，观察结果。结果显示反应有新化合物产生，且主产物极性略大于荷叶碱，推测其为荷叶碱G-1。在反应液中加入10%稀H2SO4调节PH至3左右，此时观察到烧瓶中的沉淀逐渐溶解，将溶液转入100ml分液漏斗中，分出下层水层。使用1mol/L的NaOH调节水层PH至9，发现析出大量沉淀，加入100ml氯仿萃取溶液两次，将氯仿萃取液旋蒸浓缩至1ml，吸取浓缩液点样于GF254薄层板上，并且点荷叶碱做对照，于氯甲比20:1的展开剂中展开，观察结果。结果显示，反应杂质得到初步分离，浓缩液中位荷叶碱及反应产物。将浓缩液点样于20*20的GF-254薄层板上，使用氯甲比为20:1的展开剂重复展开两次，在254nm荧光下观察与产物所在区带，使用铅笔划出并用刮刀刮下该层。将刮下的硅胶块研碎，装柱于小玻璃管中，使用氯甲10:1混合溶剂充分冲柱，浓缩所得洗脱液，将浓缩液转移至青霉素瓶中，点样于小GF254薄层板上，并点荷叶碱对照，使用氯甲比20:1展开，观察浓缩液是否较纯，结果显示反应主产物的到有效的浓缩，纯度较高。待其风干，称重。3.2荷叶碱G-1二位脱甲基制荷叶碱G-2（1）反应制备荷叶碱G-2取三口圆底烧瓶一个，使用磨口塞塞住左口，橡皮塞塞住右口，使用磨口旋塞塞住中间一口并连接上N2排气装置。取青霉素瓶一个，小心称取三氯化铝1g，并立即盖上瓶子瓶塞（三氯化铝极易吸收，并且开瓶时有大量白烟生气），称取荷叶碱G-1的182mg。将反应物投入装置，开始反应。 将称量好的荷叶碱G-1加入三口圆底烧瓶中，并使用N2排气装置对烧瓶进行充分排气。取5ml无水乙氰缓慢加入三氯化铝瓶中（乙氰加入三氯化铝时会产生大量烟雾，需在通风下小心进行，并需不断搅拌，防止三氯化铝结块），使用10ml注射器吸取乙氰三氯化铝混合液，从橡皮塞一口注入圆底烧瓶中，再使用5ml乙氰洗涤三氯化铝小瓶两次，均吸取并注入圆底烧瓶中。开启磁力搅拌器，在室温下反应24h。反应24h后，使用毛细管吸取少量反应底液，点样于4*8cmGF254硅胶薄层板上，并点荷叶碱G-1为对照，使用氯甲比为10:1展开液进行展开。展开结果显示反应得到了预期的产物，产率约为60%。使用滴管吸取少许蒸馏水，加入反应装置，崔灭反应。（2）分离纯化荷叶碱G-2在上步终止的反应中滴加盐酸，调节PH至2-3（目的是将生物碱溶入水相易于分离），将混合液移入100ml分液漏斗，静止待其分层分液。在滴加盐酸过程中，反应液起始颜色为棕黄色，在滴加过程中出现分层现象，有机相颜色变淡，溶液乳化严重。静止后，发现溶液乳化层任存在，所以使用2000r/min离心机离心30min，再移入100ml分液漏斗分离。通过密度比对得知上层液位有机相，下层液为水相，放出下层水相于100ml烧杯中。缓慢滴加2Mol/L NaOH溶液于烧杯中，调节PH至9左右。此步PH值不可调太高，因为反应预期所得的产物荷叶碱G-2会存在两个相连的酸性苯羟基，如果调节PH过高会使其继续溶解于水相中而是产物损失严重。在滴加NaOH溶液时发现产生大量白的沉淀，初步估计为铝盐和少量反应产物。将调解好PH的水溶液移入50ml的分液漏斗中，加入10ml氯仿进行对荷叶碱G-1和荷叶碱G-2的萃取。萃取是溶液乳化严重，所以使用2000r/min离心机离心30min，分出有机层，使用旋转蒸发仪减压浓缩至2ml左右，使用毛细管吸取少量浓缩液，点样于GF-254薄层板上，放置于254nm荧光下进行观察点样结果，结果显示有机相中不存在反应物G-1和荷叶碱G-2。随取样风干的沉淀物少量，使用氯甲比为10：1的混合溶剂溶解，使用毛细管吸取少量溶液，点样于GF-254薄层板上，放置于254nm荧光下进行观察点样结果，结果显示沉淀物中可能存在产物，继续点样荷叶碱G-1和荷叶碱G-2作为对照，使用氯甲比为10:1的混合溶剂做展开剂进行展开。结果显示混合物有较好的展开分离，反应产物存在于沉淀物中。将沉淀风干，进行进一步分离产物。 将上步所得的沉淀混合0.5g柱层析硅胶，加入蒸发皿中搅拌均匀。称取薄层色谱柱硅胶30g，置于 100ml烧杯中，使用氯甲比为10:1的洗脱液溶解并搅拌至悬浊液，玻璃棒引流装入小型玻璃柱中，静止待其沉降，打开玻璃柱活塞，适量的放出少许溶剂至溶液上端略高于硅胶层1cm时关闭活塞。将蒸发皿中的粉末使用漏斗加入玻璃柱中，尽量保持硅胶曾的平整，使用少许洗脱剂冲洗漏斗及玻璃柱壁中所粘的硅胶粉末。再称取1g柱层析硅胶将其再加入柱中作为最上层的覆盖。加入足量洗脱剂于柱中，使用100ml锥形瓶接收洗脱液，开始冲柱，每次洗脱液接受至30ml左右换接受瓶，并将所接受的洗脱液移入100ml圆底烧瓶中进行减压蒸干，再使用少许洗脱剂（约1ml）溶解并移入小青霉素瓶中，再次使用少许洗脱剂（约1ml）冲洗烧瓶两次，将冲洗液移入同一个青霉素瓶中，并对所对应的青霉素瓶进行标签编号。对上步所得的青霉素瓶中的溶液从第一瓶开始点样于GF254硅胶4*8薄层板上，每瓶对应一个点，每板点两个样品点及一个荷叶碱G-1和一个荷叶碱G-2对照点，使用氯甲比为10:1为展开剂依次进行展开，将所得的薄层板使用电吹风吹干，于254荧光灯下观察结果。结果显示17至19号瓶中存在反应产物，将它们合并浓缩至1ml左右。使用毛细管将浓缩液点样于20*20cm的GF-254硅胶薄层板上，使用氯甲比为10:1的混合溶剂展开。将展开后的薄层板吹干，置于254nm荧光下观察并使用铅笔画出荷叶碱G-2所在的区带。将上步画出的区带用挂刀挂下，填柱于小型号玻璃柱中，使用足量甲醇溶液冲洗，浓缩冲洗液，并移入下青霉素瓶，风干的荷叶碱G-2.。称重得m=5.3mg。三、结果与分析（一）、生物碱提取结果荷叶总碱：2.8g荷叶碱： 1.523g荷叶总碱中荷叶碱为主成份，试验中使用柱硅胶层析使荷叶碱得得到了较好的分离，而荷叶总碱中的其他成分，经后续分离只获得了一种个物质，剩余的其它成份因含量较少而未得到分离纯化。（二）、荷叶碱G-1制备结果在荷叶碱G-1的制备实验中，荷叶碱得到了较好的转化，转化率约在68%，其中有两种产物,一种为主产物既荷叶碱G-1，另一种为杂质，含量较少。荷叶碱： 0.141g荷叶碱G-1：0.097g（三）、荷叶碱G-2制备结果在荷叶碱G-2的制备实验中，荷叶碱G-1的转化较好，反应安全性较高，转化率约在60%左右,反应较专一，无副产物出现。荷叶碱G-1：0.182g荷叶碱G-2:0.0053g四、讨论 在实验初期荷叶碱的提取过程中，本次实验使用乙醇提取荷叶，进而酸提碱沉氯仿萃获得荷叶总碱，那么我们也可以考虑直接使用强酸水溶液进行提取，再进行碱沉，氯仿萃，进而获得荷叶总碱，省去了好多步骤。在荷叶碱细分离及后续的合成产物分离过程中，考虑物质是否被硅胶柱所吸附而不能被有效的洗脱，经过对比发现目前此些物质并无明显吸附，但后续的氮脱甲基结构改造物可能会出现吸附。因此，在分离纯化氮脱甲基化合物时要加入少量的三乙胺。在荷叶碱G-2的制备过程中，由于后续的分离工作工序多步，进而导致最终所得的产物比反应所得的产物要少的多，应重新考虑此反应的产物纯化方式，以提高有效收率。因后续工作还要进行荷叶碱结构的系列改造，因此在查找参考反应时因考虑到此点，尽量发现反应产率高、反应安全性高、反应要求低、反应产物易分离的改造反应。五、结论本次实验系统的进行了荷叶碱的提取、分离、纯化，获得了较大量的高纯度荷叶碱。在荷叶碱的结构改造中，两步实验都有较高产率，达到了实验的目的，也为下步的进一步结构改造奠定了基础。本实验的后期还要在荷叶碱G-2的基础上进氮上脱甲基，氮上连接丙基、异丙基、甲酰基等操作。在获得五个及五个以上结构改造物后，进行酶标法测定各组改造物活性，进而对比发现高活性化合物，且可进一步指导下一步的实验，最终达到获得新型高效、专一的乙酰胆碱酯酶抑制剂。参考文献1邹垒，全明海，程永强等。乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究进展。食品科学,2005,26增刊：105。2Liu J S，Zhu Y L，Yu C M,et a1The structure of Huperzine A and B,two new alkaloids exhibiting marked anticholinesterase activity JCan J Chem,1986。64(4)：837。3Wang H,Tang X CAnticholinesterase effects of huperzine A,E2020，and tacrine in ratsJActa PharmSin,1998，19(1):27 30 4Tang X C.Huperzine A(shuangyipping)：a promising drug for Alzheimers diseaseJActa Phar m Sina，1996。17(6):4811 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