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cGMP系列分析方法验证 （Analytical Method Validation) 伍蔚萍 2010.10.10 主 要 内 容 一. 法规对分析方法验证的要求 二. 分析方法验证定义和目的 三. 分析方法分类 四. 标准分析方法验证/确认 五. 分析方法验证类别和验证内容 六. 常见典型的验证参数/项目 七. 分析方法验证的程序 八. 方法再验证 九. 分析方法验证方案内容 十. 参考文献 一. 法规对分析方法验证的要求 （一）中国法规 【注：以下摘自2009GMP征求意见稿】 第七章 确认和验证 第一百四十八条 企业的厂房、设施、设备和 检验仪器应经过确认和验证，应采用经过验证 的生产工艺、操作规程和检验方法进行生产、 操作和检验，并保持持续的验证状态。 一. 法规对分析方法验证的要求 （一）中国法规 第十章：质量控制与质量保证 第二百三十六条： 检验 2.符合下列情形之一的，应对检验方法进性验证： A. 采用新的检验方法； B. 检验方法需要变更的； C. 采用中华人民共和国药典未收载的方法； D. 法规规定的其他需要验证的检验方法； 3.对不需要进行验证的检验方法，企业应进行方法 确认，以确保检验数据准确、可靠。 一. 法规对分析方法验证的要求 （二）欧盟GMP的额外要求 12.82 应在分析仪器/设备完成确认后，再着手 分析方法的验证。 12.83 对已验证分析方法的任何修改均应有完 整的记录，这类记录应包括修改的理由和充分 的数据，以证实经修改的方法与规定的方法同 样准确、可靠。 一. 法规对分析方法验证的要求 （三）ICH指南 关于分析方法验证部分内容见ICH Q2 A 、 Q2B, 这次培训主要也是根据ICH这个指南为依据， 具体内容见后面章节。 (四）其他法规文献 v中国药典05版附录 A 药品质量标准分析方 法验证指导原则 vUSP Validation of compendial method 二.分析方法验证定义和目的 v定义：是指确保某分析方法得出的结果可以持续地 准确反映所测产品特性的书面证明。 v目的：是为了证明该分析方法与其预期目的的相适 应。（ICH） 通俗来说，验证目的是判断采用的分析方法是否科 学、合理，是否能有效控制药品的内在质量。 三.分析方法分类 v标准分析方法：指法定分析方法，包括各国 现行药典或其他公认的标准参考资料中的方 法。 v非标准分析方法：新建立的分析方法或修改 了的标准分析方法都属于非标准分析方法。 四. 标准分析方法验证/确认 v标准分析方法一般不需要验证方法的准确性和 可靠性，但在实际使用条件下方法的适应性。 v两个要求：实验室必须满足标准方法规定性能 指标；标准分析方法验证的数据必须充分满足 实验室测定要求。 v对标准方法进行评价，以确定需要进行验证的 程度。 四. 标准分析方法验证/确认 v对标准分析方法验证有三种选择： A.不需要验证：用户的仪器、人员、试剂和环境条件 证明可以满足方法规定的分析要求，则只需规定和 执行系统适应性试验即可。注：具体要求可参见 USP Verification of compendial procedures 药典 分析方法确认 方法无须再验证。 B.部分验证：一些临界项目如杂质检查的定量限和检 测限； C.完全验证：化合物类型（晶型）、辅料、仪器类型 、存放地点和环境条件与药典标准有差异，则需要 做全验证。(注：具体要求可参见USP Validation of compendial procedures 药典分析方法验证 ） 四. 标准分析方法验证/确认 vUSP Verification of Compendial Procedures 药典分析方法确认 v目的：提供对药典分析方法确认的信息，这些方法 是第一次执行，使用适当的人员、设备、试剂，来 生成可接受的结果。而不是为了对已经成功确立的 实验室规程/方法进行追溯操作。 v说明： （1）药典分析方法的使用者无须在初次使用药典方 法时对方法进行验证，但方法在实际使用条件下的 系统适应性的数据应当以文件形式记录。 （2）一些常规的药典测试方法无须确认:如干燥失重 、炽灼残渣、酸度、pH测定等。 四. 标准分析方法验证/确认 vUSP Verification of Compendial Procedures 药典分析方法确认 v说明： （3）本规程不适用于微生物测试方法。 （4）如果药典方法确认不成功，并且USP员工 的协助也未能解决问题，则可推断此方法或许 并不适合在此实验室进行该供试品检测。因此 须当按照药典要求重新开发替代方法进行验证 。 四. 标准分析方法验证/确认 vUSP Verification of Compendial Procedures 药典分析方法确认 v不同方法类型的确认要求（仅列出部分测试方 法） （1）鉴别试验：专属性或许需要做（对IR、 UV);专属性须做（HPLC)。 （2）纯度测试：有关物质测试：专属性、LOQ 精密度须做。 （3）含量测试：专属性和精密度须做，准确度 或许需要做。 五.分析验证的类别和验证内容 （一） ICH Q2对验证分析方法分类及对应 验证项目列表 v 列出以下常见的四种类型： 类别：鉴别试验 类别：杂质的定量试验 类别：杂质控制的限度试验 类别：原料药或制剂中活性成分以及制剂 中选定组分的定量试验 五. 验证的方法类型与验证内容 （一）ICH 方法类别及验证内容 项目 类别I类别类别 类别 鉴别杂质定量杂质限度含量/效价/溶出度 准确度 -+-+ 精密度 重复性-+-+ 中间精密度- + - + 专属性 + 检测限- - +- 定量限-+- 线性-+-+ 范围-+-+ 五. 验证的方法类型与验证内容 v注意事项： （1） “-”表示 该项目通常不需要评价 “+”表示该项目通常需评价 （2）假如已评价重现性，可不需再评价中间精密度 缺乏专属性的分析方法，应由其他分析方法来作补充 。 有些情况下需要。 （3）表中没有列出耐用性（Robustness),但在分析方法研究 的适当阶段或特殊要求是应予以考虑进行验证。 （4）效价 表达1：指某一物质引起生物反应的功效单位,可用理化方法 检测,也可用生物检测方法测定。 表达2：生物制品活性（数量）高低的标志，通常采用生物学 方法测定。 五. 验证的方法类型与验证内容 （二）USP对验证方法的分类及对应的验证项目 列表 v方法分类： 类别：原料药或制剂中活性成分以及制剂中选定组 分的定量试验 类别：对制剂或药品中杂质或降解杂质进行测定 的方法，包括杂质的定量测定和限度测定。 类别：对一些特定性能如溶出度、药物释放度测 测定方法。 类别：鉴别试验。 五. 验证的方法类型与验证内容 (二）USP方法类别及验证内容 项目 类别 类别类别 类别 含量测试杂质定量杂质限度特性测试 鉴别 准确度 YesYesMaybeMaybeNo 精密度 YesYesNoYesNo 专属性 YesYesYesMaybeYes LOD NoNoYesMaybeNo LOQ NoYesNoMaybeNo 线性 YesYesNoMaybeNo 范围 YesYesMaybeMaybeNo 六. 常见典型的验证参数/项目 （一）专属性（Specificity) v定义：是指在其他成分（如杂质、降解产物 、辅料等）可能存在的情况下，采用的方法 能准确测定出被测物的特性，能反映该分析 方法在有共存物时对供试物准确而不受干扰 的测定能力。 六. 常见典型的验证参数/项目 v专属性测定 v鉴别反应：能与可能共存的物质或结构相似合物区分。 v含量测定和杂质检查 （1）色谱法和其他分离方法（查看两个最接近峰分离度来证明 其专属性） （2）可以获得杂质：对含量测定来说，专属性应提供被分析物 在杂质和或赋形剂存在时能被识别的证明。实际操作中可以 在纯物质（原料或制剂）中加入一定量的杂质或辅料，与未 知杂质或辅料的样品测定结果相比较，以证明其含量测定结 果不受这些物质的影响。 对杂质检查来说，通过在原料药或制剂中加入一定量的杂质 ，证明各杂质能逐个分离，并也能与样品中其他组分分离。 六. 常见典型的验证参数/项目 v专属性测定 （3）无法获得杂质：杂质或降解物的对照品无 法获得，专属性可以通过将一定量的杂质或降 解产物的样品测定结果与另一种成熟的方法测 定结果比较，如药典方法或经论证的其他方法 进行比较证实。必要时，进行强力破坏性试验 对样品进行测定。 （4）DAD峰纯度检查 六. 常见典型的验证参数/项目 （二） 准确度（Accuracy) v 定义：是指用该方法测定的结果与真实值或 参考值接近的程度。 注:（1）结果一般用回收率（%）表示。 （2）准确度应在分析方法规定的范围内建 立。 六. 常见典型的验证参数/项目 v准确度测定 （1）含量测定：对原料药来说， 可采用已知纯度的对照品或 样品进行测定；也可以采用将测定结果与另一种成熟的分析 方法的结果比较而得；也可由线性数据结果推算。 （2）杂质定量测定： A.向原料药或制剂中加入已知量的杂质测定。 B.若无杂质工作对照品，可考虑与其他检测方法的测定结果 比较。 （3）准确度可接受范围应根据方法类型、测定的浓度范围以 及方法本身的要求来确定。主成分含量：98102%，杂质一 般为80120%之间。 六. 常见典型的验证参数/项目 （三）精密度（Precision) v定义：是指在规定的测试条件下，同一个均匀 样品，经过多次取样测定所得一系列结果之间 的接近程度。 v精密度一般用偏差、标准偏差（SD）或相对标准偏 差（RSD）来表示； v精密度可从重复性、中间精密度，重现性三个层次 考虑。 六. 常见典型的验证参数/项目 3.1 重复性（Repeatability) 定义：是在相同操作条件下，由一个分析人 员在较短时间间隔内连续测定所得结果的精 密度，也成为间隙测量精密度（Intra-assay precision) v 不同溶液制备 六. 常见典型的验证参数/项目 v重复性测定 （1）用100%的测试浓度至少6次测定结果进行评价。 （2）或3个不同浓度（如80%、100%、120%）/每个 浓度重复测定3次，即至少9次测定结果来评价。 （3）重复性结果用 RSD来评价。 （4）RSD范围应根据方法的类型、测定的浓度范围及 方法本身的要求来确定。 六. 常见典型的验证参数/项目 3.2 中间精密度（Intermediate precision) v 定义：是指同一实验室内部条件改变，如不 同日期、不同分析人员或用不同仪器测定结 果的精密度。 v变动因素有：不同日期，不同分析人员、不 同设备。 六. 常见典型的验证参数/项目 v中间精密度测定 （1）变动因素如不同日期、不同分析人员、不 同设备可以组合设计，不必逐个考虑每个因 素。 （2）结果可采用SD或RSD来衡量结果之间的 而差异（我部门一般采用）；也可采用t-检验 和F-检验来对结果进行评价。 六. 常见典型的验证参数/项目 3.3 重现性（Reproducibility) v定义：是指不同实验室之间测定结果的精密 度，也称实验室间精密度。 v当分析方法需要标准化时，如收载到药典中 的方法，则应考虑重现性。 六. 常见典型的验证参数/项目 （四）检测限 （Limit of detection,LOD) v定义：是指在某一分析方法条件下，样品中被测物 能被检测出的最低量。 v说明： （1）检测限是一种限度试验的参数，用以表示测量 方法在所述条件下对样品中被分析物的最低检出量 ，但不需要准确定量，只需指出高于或低于该规定 浓度即可。 （2）通常用检测限浓度除以样品浓度来表示结果 （%或ppm） 六. 常见典型的验证参数/项目 v检测限测定 （1）直观评价法 直观评价法可以用于非仪器分析方法，也可以用于 仪器分析方法。一般比色法、TLC等可用此法。 检测限度的测定是通过对一系列已知浓度分析物的 样品进行分析，并以准确地测得被分析物的最小量 来建立。 （2）信噪比法 该方法仅适用于出现基线噪音的分析方法，如 HPLC,GC法多用此法。 信噪比（S/N)一般要求大于3。 六. 常见典型的验证参数/项目 （3）根据响应值的标准差和斜率 检测限=3.3 SD/S SD 响应值的标准差； S校正曲线的斜率 斜率S可从被分析物的校正曲线来估算; SD值可由下述途径获得： A. 根据空白的标准差 （进几份空白，测定空白背 景响应值，计算其标准偏差） B.根据校正曲线 （根据回归线的剩余标准偏差或 回归线的Y-轴截距标准偏差都可以作为标准偏差） v 此法可用于UV、AA等 六. 常见典型的验证参数/项目 （五）定量限（Limit of quantitation,LOQ） v定义：是指在规定的方法条件下，样品中被测物能 被定量检测出的最低量。 v说明： （1）其测定结果应具有一定准确度和精密度。 （2）是一种含量测定的定量参数，杂质和降解产物 的定量测定时应确定。 （3）通常用定量限浓度除以样品浓度来表示结果 （%或ppm） 六. 常见典型的验证参数/项目 v定量限测定 （1）直观评价法 直观评价法可以用于非仪器分析方法，也可以用于 仪器分析方法。一般比色法、TLC等可用此法。 定量限度的测定是通过对一系列已知浓度分析物的 样品进行分析，在准确度和精密度都符合要求的情 况下，被分析物能被定量测得的最小量即为定量限 度。 （2）信噪比法 该方法仅适用于出现基线噪音的分析方法，如 HPLC,GC法多用此法。 信噪比（S/N)一般要求大于10。 六. 常见典型的验证参数/项目 （3）根据响应值的标准差和斜率 v定量限=10 SD/S SD 响应值的标准差； S校正曲线的斜率 v斜率S可从被分析物的校正曲线来估算; SD值可由下述途径获得： A. 根据空白的标准差 （进几份空白，测定空白背景响应值 ，计算其标准偏差） B.根据校正曲线 （根据回归线的剩余标准偏差或回归线的 Y-轴截距标准偏差都可以作为标准偏差） v 此法可用于UV、AA等 六. 常见典型的验证参数/项目 （六）线性（Linearity) v 定义：是指在给定范围内，测试结果与样品 中被检测物浓度（含量）成比例关系的能力 。 v换句话说，就是试验结果（或测得响应信号 ）与供试物浓度（或质量）的变化成线性关 系。 六. 常见典型的验证参数/项目 v线性测定 （1）线性关系饿测定应在规定的范围内进行。 （2）在规定范围内，至少制备5个不同浓度的溶液， 每个浓度测定3次，然后用响应信号平均值对被测 物浓度做校正曲线。 （3）列出线性回归方程，线性相关系数（r), y-轴截 距，剩余方差等。 （4）r越接近于1.0，表明线性关系越好。 （5）方法目的不同，对R要求不同。（常量分析方 法，R0.999,残留溶剂和清洗方法验证要求0.99以上 ） 六. 常见典型的验证参数/项目 （七）范围（Range) v定义:分析方法范围是指样品中被分析物的较 高浓度（量）和较低浓度（量）之间的一个 区间，并已证实在此区间内，该方法具有合 适的准确性、精密度和线性。 v通常以分析方法测定结果相同的单位表示， 如%或ppm。 六. 常见典型的验证参数/项目 v范围确定 （1）确定范围的方法是:样品中含有被分析物 的量，无论在范围内或在范围末端，该分析 方法均能获得良好的线性、精密度和准确性 。 （2）原料药或成品含量测定：80%120%。 （3）制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度 70%130%，其他剂型，参照药典。 （4）对于溶出度试验：应为限度的20%。 六. 常见典型的验证参数/项目 v范围确定 （5）对于杂质检查：拟订出规定限度的 50%120%。 注：通常我部门做杂质分析方法验证，选择范 围为LOQ150%水平，使测定结果涵盖在方 法涵盖的范围之内。 （6）如果含量测定与杂质检查同时测定，用百 分归一化法，则线性范围应为杂质规定下限的 -20%至含量限度（或上限）的+20%。 六. 常见典型的验证参数/项目 （八） 耐用性（Robustness) v定义：是指在测定条件有较小变动时（但仍 在正常允许使用范围内），测定结果不受影 响的程度，也即证明方法的可靠性。 v开始做分析方法研究时，应考虑其耐用性。 v如测定条件要求苛刻，则应在方法中注明。 v通过耐用性评估，建立了一系列的系统适应 性参数（如分离度试验），以确保在任何时 候使用该分析方法都是有效的。 六. 常见典型的验证参数/项目 v耐用性试验通常考虑的变化参数： v典型的参数变化参数是分析溶液、不同设备、不同 分析员的稳定性。 v对液相色谱： A.流动相pH值变化的影响 B.流动相组分比例变化的影响 C.不同色谱柱（不同批号或不同供应商） D.不同柱温 E.不同流速 六. 常见典型的验证参数/项目 v耐用性试验通常考虑的变化参数： 对气相色谱： A. 不同色谱柱（不同批号或不同供应商） B. 不同温度 C.不同流速 六. 常见典型的验证参数/项目 （九）系统适应性试验（System Suitability Test,SST) v 定义：该实验是把分析设备、电子仪器、实验操作和 被分析样品作为一个整体来进行评估。 v系统适应性参数是根据被验证的方法类型，对某一特 定方法而建立的。比如：有关物质着重考虑某两个相 邻的峰分离度，拖尾因子、面积RSD，理论塔板数; 含量分析方法考虑面积RSD,拖尾因子，理论塔板数 等。 七. 分析方法验证的程序 （一）分析方法验证的前提条件： 1.仪器：仪器已经经过验证，并在有效期内； 2.人员：人员应经过充分培训，熟悉方法及所 使用的仪器； 3.物料：所用的物料包括试剂、标准品、样品 、 色谱柱及使用的容器均应符合要求； 4.方法：方法开发及优化已经成功完成，基本 方法草案已经顶出来。 七. 分析方法验证的程序 （一）分析方法验证的前提条件： v5.环境:试验环境符合该分析方法的要求，例 如，有些方法可能对环境温湿度敏感；有些 方法对样品处理环境空气清洁度有要求。 七. 分析方法验证的程序 （二）分析方法验证的流程： 方法开发 优化 预验证 验证 实施 再验证 八. 方法再验证 v定义：化学药物质量控制分析方法验证技术 指导原则给出的定义： 在某些情况下，如原料药合成工艺改变，制 剂处方改变，分析方法改变等，均有必要对分 析方法再次进行全面或部分项目的验证，以保 证分析方法可靠，这一过程称为方法再验证。 v再验证原则：根据改变的程度进行相应的再验 证。 八. 方法再验证 v当原料药合成工艺发生改变时，可能引入新 的杂质，杂质检查方法和含量测定方法的专属 性就要再进行验证，以证明有关物质检查方法 能够检测新引入的杂质，且新引入的杂质对主 成分的含量测定应无干扰。 v当制剂的处方组成改变，辅料变更时，可能 会影响鉴别的专属性、溶出度和含量测定的准 确度，因此需要对鉴别、含量测定方法再验证 。 八.方法再验证 v当原料药产地来源发生变更，可能会影响杂质 检查和和含量测定的专属性