2009-2010学年第二学期期末考试《发酵工程》整理版.doc

2009-2010学年第二学期期末考试发酵工程整理版第1页过滤除菌法：采用定期灭菌的干燥介质来阻截流过空气中所包含的微生物，从而获得无菌空气的除菌方法。常用的过滤介质：棉花、玻璃纤维、活性炭、超细玻璃纤维纸、石棉滤板。第七章 发酵过程的工艺控制临界氧浓度：指不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。氧饱和度：发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度。饱和溶氧浓度：在一定温度和压力下，空气中的氧在水中的溶解度。(mol/m3)如何调节摇瓶发酵的供氧水平（影响摇瓶kla的因素）？摇瓶机往复，频率80-120分/次，振幅 8cm。旋转，偏心距转速250rpm。装液量，一般取1/10体积左右。影响发酵罐供氧因素搅拌：搅拌功率增大对氧的利用效果明显，但过于激烈的搅拌，产生很大的剪切力，可能对细胞造成损伤。且增加传热的负担。空气流量：一定限度内，Kla随着空气流量的增加而增加。培养液性质（密度、黏度、表面张力、扩散系数等）微生物生长的影响：细胞浓度增加，Kla值逐渐变小温度的影响：温度降低可得到较高的氧溶解度。发酵液中的体积氧传递方程：OTR=KL (C*CL）以单位体积的液体中所具有的氧的传递面积为 a (m2/m3)，OTR单位体积培养液中的氧传递速率，KL以氧浓度为推动力的容积氧传递系数，反映了设备的供氧能力，C*与气相氧平衡时液相氧浓度（mol/m3），CL：液相溶解氧浓度。如何调节通气搅拌发酵罐的供氧水平发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长会产生不利的影响，所以发酵初期采用小通风，停搅拌，但是通气增大的时间一定要把握好。CO2浓度对发酵的影响溶解在发酵液中的CO2对氨基酸、抗生素微生物的发酵具有刺激和抑制作用，大多数微生物适应低浓度的CO2（0.02%0.04%V/V）。CO2浓度的控制1.发酵过程通过通气量的控制，可以调节CO2浓度的大小，通气量大搅拌速度快CO2浓度就会减小。2.通过控制罐压来调节CO2浓度：罐压升高发酵液中CO2浓度增加，罐压降低CO2浓度随着下降。3.CO2浓度的产生与补料有密切的关系，如：青霉素发酵中，补料可增加发酵液中的CO2的含量和降低发酵液的pH。泡沫对发酵的影响1.占据大量空间，降低生产能力。2.引起原料流失，造成浪费。3.气泡中充满的二氧化碳不能与空气中氧进行交换，影响到菌的呼吸。4.泡沫增多而引起逃液，在排气管中粘上培养基容易长菌。泡沫的控制1.机械消泡法：在搅拌上部安装消泡桨。机械消泡节省原料，减少培养液性质的变化，对提炼无副作用。但消泡的效果不如化学方法消泡。2.消泡剂消泡：发酵工业常用的消泡剂包括天然油脂类、聚醚类、高级醇类、硅树脂类。温度对发酵的影响1.温度影响反应速率：发酵过程，酶反应有一个最适温度：=Ae-E/RT。2.温度对微生物细胞生长的影响：在适合微生物生长的范围内，温度高微生物生长速度快、呼吸强，酶失活速度快，菌体提前衰老。温度低，发酵周期延长，影响设备的利用率。微生物的共同特点是：对低温的适应力要强于对高温的适应力。3.温度对产物形成的影响：如，柠檬酸生产，黑曲霉的生长最适温度3337，积累酸的最适温度为32，若温度高于32，菌体生长快，产酸降低。4.温度影响发酵方向：如，四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于300C时，这种菌合成金霉素能力较强；温度达到350C时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。5.温度还影响氧在基质中的溶解度，从而影响菌对某些基质的分解吸收。引起发酵过程温度变化的因素Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q辐射发酵热是发酵过程中释放出来的净热量，发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。生物热的大小与哪些因素有关？1.生物热与发酵类型有关：微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多一摩尔。2.生物热的产生具有强烈的时间性：培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，产生的热量多。培养后期，菌体已基本上停止繁殖，产生热量不多。pH值对发酵的影响1.pH影响酶的活性。2.pH影响微生物细胞膜所带电荷，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄。3.pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用4.pH值影响代谢方向。5.pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响。pH对菌体生长影响比产物合成影响小。pH值的控制1.调节好基础料的pH(特别注意C/N)。2.在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等。3.通过补料调节pH，在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。4.发酵的不同阶段控制不同的pH值。发酵过程中pH是不断变化的1.糖代谢，特别是快速利用的糖，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一。2.氮代谢，当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升。3.生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降4.某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。5.菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升6.杂菌的污染，pH下降第八章 发酵动力学一类发酵、二类发酵、三类发酵一类发酵：产物形成与底物利用直接相关，为生长联系型，又称简单发酵型，产物直接由碳源代谢而来,产物生成速度的变化与微生物对碳源利用速度的变化是平行的，产物生成与微生物的生长也是平行的。二类发酵：产物形成与底物利用间接相关，为部分生长联系型，又称中间发酵型，产物不是碳源的直接氧化产物，而是菌体代谢的主流产物。三类发酵：产物形成与底物利用不相关，为非生长联系型，又称复杂发酵型，产物的生成在菌体生长和基质消耗完以后才开始，与菌体生长不相关，与基质消耗无直接关系，所形成的产物为次级代谢产物。分批培养菌体的生长动力学：在分批培养中就细胞浓度X的变化而言，一般经历延迟期、对数期、减速期、静止期、衰亡期。延迟期：延迟期的长短与种子的种龄和接种量的大小有关，而培养基的浓度对延迟期的长短影响不大。dx/dt0对数期：营养丰富，有毒代谢物少，细胞生长不受限制，细胞浓度随培养时间呈指数增长。=m细胞浓度的倍增时间(td)：td=ln2/m=0.693/m减速期：培养基营养物迅速消耗，有害物质逐渐积累，细胞比生长速率逐渐下降。静止期：细胞浓度达到最大值，=0，dx/dt=0，x=xmax衰亡期：环境恶化，细胞开始死亡，活细胞浓度不断下降。Monod方程：当培养基中不存在抑制细胞生长的物质时，细胞的生长速率与基质浓度关系如下：菌体的生长比速，S：限制性基质浓度Ks：半饱和常数，max: 最大比生长速度Monod方程的参数求解(双倒数法)：将Monod方程取倒数可得：1/=1/max+ Ks/max S或S/= S/max+ Ks/max这样通过测定不同限制性基质浓度下，微生物的比生长速度，就可以通过回归分析计算出Monod方程的两个参数。单罐连续培养：由于新鲜培养基不断补充，发酵液不断取出，发酵罐内的微生物始终处于旺盛的指数生长期，罐内细胞浓度X、比生长速率、以及t、pH等都保持恒定。连续培养的稀释率(D)：补料速度与反应器体积的比值F/V。F培养液体积流量，V发酵罐体积。连续培养富集微生物的原理：菌的积累速率=生长速率流出速率。调节培养基，使目的菌的流出速率生长速率，就起到富集作用。连续培养的优缺点优点：能维持低基质浓度；可以提高设备利用率和单位时间的产量；便于自动控制。缺点：菌种发生变异的可能性较大；要求严格的无菌条件。菌体的比生长速率：单位重量的菌体瞬时增量。=（dx/dt）/x；单位为1/h，其中x菌体浓度（g/L ）产物的形成比速：单位时间内单位菌体形成产物（菌体）的量=（dp/dt）/x,；单位为1/h，其中p产物浓度（g/L ）基质的比消耗速率:单位时间内单位菌体消耗基质的量=（ds/dt）/x；单位为1/h，其中s底物浓度（g/L ）第九章 发酵设备发酵罐：进行微生物深层培养的设备统称为发酵罐。分好氧发酵罐和厌氧发酵罐。生物反应器：是指有效利用生物反应机能的系统。包括发酵罐、酶反应器、细胞反应器、光合生物反应器、废水处理反应器等。好氧发酵罐（通风发酵罐）几种类型：（1）通用式发酵罐（通风、搅拌式发酵罐）（2）气升式发酵罐（3）自吸式发酵罐通用式发酵罐：具有通气和搅拌装置的立式圆筒形发酵罐。是目前大生产中最常用的发酵罐。其容积可从几升到几百吨不等。包括罐体、搅拌系统、传热系统、通气系统。罐体：（1）大罐罐体由碳钢或不锈钢材料制成，长圆柱形，椭圆形或拱形封头。罐体由圆柱体及椭圆形或碟形封头焊接而成，小型发酵罐罐顶和罐身采用法兰连接。（2）直径与高度之比（D/H=1：1.54），罐身越长，氧的利用率较高。（3）内壁应光滑无死角，耐腐蚀。（4）发酵罐能承受一定压力；（5）罐体上设人孔、示镜、爬梯及各路接管。进料管、补料管、排气管、接种管和压力表接管。在罐身上的接管有冷却水进出管、进空气管、取样管、温度计管和测控仪表接口。（6）罐体几何尺寸：D/H=1：1.54轴封有填料函密封圈和端面式轴封等。填料函式轴封是由填料箱体、填料底衬套、填料压盖和压紧螺栓等零件构成，使旋转轴达到密封的效果。优点是结构简单。主要缺点是：死角多，很难彻底灭菌，容易渗漏及染菌；轴的磨损情况较严重；填料压紧后摩擦功率消耗大；寿命短，经常维修，耗工时多。多采用端面式轴封，基本构件是动环和静环。垂直于轴线的动环和静环光滑表面紧密地相互贴合，并作相对转动而达到密封。优点：清洁；密封可靠；无死角，可以防止杂菌污染；使用寿命长；摩擦功率耗损小；轴或轴套不受磨损；它对轴的精度和光洁度没有填料密封要求那么严格，轴的震动敏感性小。传热系统：夹层传热优点是：结构简单；加工容易，罐内无冷却设备，死角少，容易进行清洁灭菌工作，有利于发酵。缺点是：传热壁较厚，冷却水流速低，发酵时降温效果差。夹层的传热系数一般是400630kj/m2h蛇管传热优点是：冷却水在管内的流速大；传热系数高，但弯曲位置比较容易蚀穿(试漏）。蛇管的传热系数则为12001890kj/m2h通气系统：通风搅拌式发酵罐（气升式）：通气不仅提供微生物所需氧气，而且还用来搅拌培养基。特点：结构简单，无搅拌装置节省动力50%，操作时噪音小，减少死角。但搅拌效果不及机械搅拌式。第十章 工业发酵染菌的防治染菌的危害：1.分解产物。2.导致发酵过程异常。菌体生长速度缓慢、代谢异常或过早老化、pH发生异常变化、发酵过程中泡沫异常增多，发酵液颜色异常变化、代谢产物含量下跌、发酵液黏度异常增加。3.影响产物的过滤、提取和质量。4.染菌对三废处理的影响。使过滤后的废菌体无法利用。BOD含量增高，增加三废治理费用和时间。不同染菌时间对发酵的影响发酵前期染菌：杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成。发酵中期染菌：严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成。发酵后期染菌：如杂菌量不大，可继续发酵。如污染严重，可采取措施提前放罐。不同染菌途径对发酵的影响种子带菌：使发酵染菌具有延续性。空气带菌：使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐。培养基或设备灭菌不彻底：不具有延续性。设备渗漏：发酵环境与外界连通，这种途径造成染菌的危害性大。染菌的途径原料，菌种，空气，设备染菌的检查与判断1.无菌试验a.无菌肉汤培养基空培养接入样品培养观察b.平板划线检查或斜面培养检查：2.显微镜检查染色镜检，多在染菌程度较深时，用于判断杂菌的种类，靠显微镜无法发现染菌初期的杂菌。3.通过发酵的生理生化指标检查a:降糖速度 b:产酸速度，pH值 c:溶解氧 d:光密度 e:排气中CO2含量 f:产物含量 g:O2的消耗各种检查方法的比较显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜捡取样少，视野的观察面也小，因此不易检出早期杂菌。平板划线法和肉汤培养方法的缺点是需经较长时间培养才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能检出更少的杂菌，而且结果也更为准确。检查结果应以平板划线和肉汤培养结果为主要根据污染杂菌的原因分析总染菌率：指一年内发酵染菌的批次与总投料批次数之比。1.从染菌的规模来分析染菌原因大批发酵罐染菌：空气系统。部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的。个别发酵罐连续染菌和偶然染菌：设备问题。2.从染菌的时间分析发酵早期染菌。可能是从种子中带入，或由于培养基灭菌不彻底，或设备有“死角”，清洗不干净而染菌。发酵中后期染菌。可能是无菌空气或中间补料带入杂菌，或发酵设备渗漏，以及操作不合理逐渐侵入杂菌而造成的。3.从染菌的类型来分析耐热性芽孢杆菌：可能是由于原料中原有的芽孢未能杀灭，或者死角或灭菌不彻底。球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的，或者设备渗漏。浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌、球菌)：发酵罐的冷却管或夹套渗漏。霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格。噬菌体：很可能是空气系统，种子污染。发酵染菌的预防1.原料染菌的防治对于液体原料：采用连消方式。对颗粒状淀粉质原料或者小发酵罐，采用实消为好。而且升温时需搅拌，或加入-淀粉酶。2.种子带菌的防止无菌室的基本要求：无菌室面积不宜过大，要有13个套间(缓冲过道)，每个套间一般都用紫外线灭菌，内部的墙壁、天花板要求无裂缝，墙角最好做成圆弧形。种子培养基灭菌的注意事项：灭菌操作时需要注意排气管是否畅通。固体培养基可采用两次灭菌的方法。种子摇瓶培养的注意事项：保证摇瓶间的清洁卫生，摇瓶内液体装料不宜过多，瓶口包扎的纱布一般为八层以上。对种子培养基的染菌的处理：一般均应灭菌后坚决弃去，并对接触过的设备，管道全部灭菌，加长灭菌时间等。3.空气带菌的防治过滤器蒸汽灭菌完毕应立即缓慢通入压缩空气，将水分吹干。超细纤维纸作过滤介质，灭菌时必须将管道中冷凝水放干净，以免介质受潮失效。在生产实践中，空气管道大多与其它物料管道相接，要装上止逆阀防止其它物料窜入空气管道污染过滤器，导致过滤介质失效。记录过滤介质的使用时间，适时更换。4.发酵设备带菌的防治对于设备的灭菌主要是为了避免“死角”和渗漏。5.操作不当导致染菌的防止常见的“死角”a.法兰连接的死角发酵工厂的有关管路要保持光滑、通畅、密封性好，以避免和减少管道染菌的机会。b.渣滓在罐底与用环式空气分布管所形成的死角c.不锈钢衬里的死角d.接种管路的死角发酵染菌后的措施种子培养或种子罐中发现污染及时倒罐，清洗。发酵早期染菌可以适当添加营养物质，重新灭菌后再接种发酵。中后期染菌可以加抗生素或正常发酵液，降低温度、降低通风量、停止搅拌等措施。对于发酵后期产物已积累到一定浓度应该提早放罐。第十一章 微生物培养过程的参数检测物理参数的测定1温度：温度传热器一般用热电阻，经过仪表进行温度的测量。2空气流量：一般控制在0.51L/L.min，采用转子流量计测量。3罐压力：用压力表或压力敏感膜。4搅拌转速：通常以r/m表示，控制转速能调节溶氧、CO2浓度。用测速电机。5黏度：黏度可以作为细胞生长或细胞形态的标志，也能反应发酵罐中菌丝分裂的情况，由搅拌功率的变化推算出发酵液的表观黏度。6浊度：能及时反应单细胞生长状况的参数，目前浊度只限于取样测定，可用浊度计或分光光度计测定。化学参数的测定1.pH测量2.CO2的测量（1）溶液中CO2的检测:CO2电极测量CO2时，气体透过电极膜，CO2和水反应，达到以下平衡：CO2+H2OHCO3-+H+产生的氢离子引起pH的变化，就可以测出溶解CO2的浓度。(2)尾气CO2的测量常用的尾气测定仪是红外线二氧化碳测定仪（简称IR）。3.溶氧的测定（相对溶氧）用复膜溶氧电极测定溶液中的溶解氧。电极的构造：由半透膜和电极两部分组成。复膜氧电极的结构在阴极银（铂）片的前面包一张半透膜，氧可以透过半透膜达到阴极上进行电极反应。该半透膜固定在阴极表面。复膜氧电极的工作原理电极部分包括阳极、阴极、电解液，阴极由铂、银、金等贵金属组成，用于还原氧分子，贵金属起传递电子的作用。阳极由铅、锡、铝等组成。溶液中的氧就在阴极被还原。当产生的电流与溶液中氧含量成正比时，此时的电极电流为饱和电流。氧浓度与饱和电流成正比关系。在阴极表面发生的电极反应：O2+2H2O+4e-4OH-阳极上的反应是：PbPb2+2e-电极反应：Pb+O2+2H2O2Pb(OH)2于是在二电极之间形成电流，将氧的信号转变成电信号。氧浓度越高，电流越大。化学信号转变成电信号溶氧电极可分为原电池型和电解型（极谱型）。原电池型简单便宜，不需要外加电压就有电流产生。电解型（极谱型）：所用的参比电极（阳极:银构成）的电位比阴极(白金或金构成)的高或相等，需极化电压使之维持在-0.6-0.8V的氧极谱电压内。电极的标定一般测定中应进行以下二点标定（1）零点标定用饱和Na2SO3作无氧状态的溶液，将氧电极放入该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降稳定后，调节零点旋钮显示零值。（2）饱和校正（满刻度）进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至100%即为饱和值。抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（U）来表示。以最低抑菌浓度(50ml肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育的最小青霉素剂量）为一个单位，如青霉素0.6微克1U。生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准。第十三章 发酵生产实例（一题论述）一、青霉素生产工艺1.菌种：产黄青霉菌株。2.孢子和种子制备：为了获得丰富的高质量的孢子。3.种子制备：目的是使孢子发芽、繁殖以获得足够的菌丝。4.培养基母斜面培养基：葡萄糖、蛋白胨、甘油孢子培养基：大米/小米一级种子罐：葡萄糖、乳糖、玉米浆二级种子罐：葡萄糖、玉米浆发酵培养基：碳源：葡萄糖氮源：玉米浆、花生饼粉、棉籽饼粉、硫酸铵、尿素前体：苯乙酸或苯乙酸铵（分多次加入）无机盐：包括S、P、Ca、Mg、K等5.发酵培养温度控制：前期（60h前）2526，中期（60h后）23，后期适当升温。pH控制：通过流加葡萄糖控制6.46.6。溶氧控制：通气比一般为1：0.8。补料：流加葡萄糖、硫酸铵、氨水、苯乙酸或苯氧乙酸、消泡剂。周期：180h240h6.青霉素下游提取工艺发酵液的预处理：5左右，加絮凝剂絮凝。发酵液的固液分离：鼓式真空过滤器。溶媒（BA）萃取：15%硫酸酸化至pH22.2，加醋酸丁酯（BA）抽提。一次水提取：1.5%的NaHCO3萃取二次溶媒（BA）萃取