高温菌的分离纯化与分子鉴定毕业论.doc

2015届本科毕业论文（设计）高温菌的分离纯化与分子鉴定姓 名： 赵影 院 别： 生命科学学院 专 业： 生物工程 学 号： 110913038 指导教师： 刘秀花 2015年4月6日 2目 录摘要1关键词21 材料与方法31.1实验材料31.1.1实验对象31.1.2实验试剂31.1.3 实验仪器41.1.4培养基41.2 细菌的分离纯化41.3菌落形态与革兰氏染色特征观察41.4菌株的分子鉴定41.4.1细菌DNA 的提取41.4.2 16SrRNA基因扩增51.4.3 16SrRNA基因扩增产物的序列测定51.4.4 DNA序列分析61.5 产耐热-半乳糖苷酶的验证实验62 ：结果及分析62.1 菌体菌落形态及染色特征72.2 分子鉴定结果72.2.1 16SrRNA的扩增72.2.2 16SrRNA的测序结果82.2.3 DNA序列分析82.2.4嗜热脂肪芽胞杆菌的验证实验103 讨论103.1 细菌菌株的鉴定103.2细菌菌株的验证1033高温菌的研究意义104 结论115 参考文献116 致谢12II高温菌的分离纯化与分子鉴定赵影 指导老师：梁峰（商丘师范学院生命科学学院，河南 商丘 476000）摘 要：为了能够更好的充分开发利用高温嗜热菌资源，获得一些耐高温的酶类。本实验以采自不同地方的温泉中的污泥为原料，在培养基（DSM88固体培养基，温度70度，PH7.0）中，运用涂布，四区划线的方法，分离纯化原料中的微生物并进行革兰氏染色，并对其16SrRNA的基因进行序列测定和系统分析，结果发现该菌为革兰氏阳性菌，且产芽孢，与典型的嗜热脂肪芽胞杆菌属的菌种有最高同源性；为进一步验证分析结果对其生理生化又做了研究，最后发现该菌在以乳糖为唯一碳源，x-gal作为显色剂的培养基中能够产生蓝色的菌落，这充分说明该菌株能够产生耐高温的-半乳糖苷酶即确定该菌就是嗜热脂肪芽胞杆菌。关键词：嗜热脂肪芽胞杆菌；16SrRNA；耐高温的-半乳糖苷酶；进化分析；Purification and molecular identification of thermophilic bacteriaZhao ying Supervisor: Liang Feng（Department of Life Science, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)Abstract:In order to take full advantage of high temperature thermophiles resources, so that we can access to some of the high-temperature enzymes. In this experiment, spa collected from different parts of the sludge as raw material. we used a coating method, four dividing line in the culture medium (DSM88 solid medium, a temperature of 70 degrees, PH7.0) and the separation and purification of the raw material and microorganisms Gram stain, and 16SrRNA sequencing and analysis system of its gene, It was found that the strain of Gram-positive bacteria and spore-forming, with the typical Bacillus stearothermophilus Genus species has highest homologyo; To further verify the analysis results, We further make the physiological and biochemical experiments.Finally, the bacteria found in lactose as the sole carbon source, x-gal as chromogenic agent in the medium can produce blue colonies, which fully shows that the strain can produce high temperature - galactosidase . namely, the strain is identified Bacillus stearothermophilus Keywords:Bacillus stearothermophilus; 16SrRNA; temperature of - galactosidase; phylogenetic analysis;近年来,极端嗜热菌耐热酶的发现,促进了分子生物学中聚合酶链反应(PCR)技术的发展和应用,更加引起了人们对研究极端嗜热菌生物学特性的兴趣。由于热泉中具有较广泛的地热资源，为此我们对云南地区的两个热水温泉中嗜热菌进行了初步筛选与鉴定,试图寻找到有意义的嗜热菌株 该实验对菌株的分子鉴定采用的是16SrRNA系统进化分析的方法。 16SrDAN是原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）在基因组上对应的一段DNA序列， 16SrRNA为原核生物的一种核糖体RNA。目前，细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟是rRNA，其种类少，含量大，具有分子大小适中，突变率小等优点。在漫长的进化过程中，其基因序列的变化非常缓慢，可以用来标记生物的进化距离和亲缘关系，具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称，可精确指示细菌之间的亲缘关系，而16SrRNA的大小为1500bp左右，所含信息能反映生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。但是要直接将16SrRNA从细菌中提取出来很困难，因为它易被菌体内广泛存在的RNase降解，因而本实验利用16SrDNA直接测序法来鉴定细菌。在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区段可以设计出细菌的通用引物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌 。目前，用于验证产生耐高温的-半乳糖苷酶的嗜热脂肪芽胞杆菌，可用在以乳糖为唯一碳源，x-gal作为显色剂的培养基中进行生长，看菌体是否能产生蓝色的菌落，若能则证明该菌能产生耐高温的-半乳糖苷酶，即证明该菌株是嗜热脂肪芽胞杆菌。本文是作者以采自不同地方的温泉中的污泥为菌源，从中分离了一种疑似微生态菌株嗜热脂肪芽胞杆菌，在分离、纯化、染色的基础上进行了16rRNA的系统进化分析，在分子水平上进一步鉴定出菌种；为充分验证该菌种属，在以乳糖为唯一碳源，x-gal作为显色剂的培养基中进行生长，发现该菌体能产生蓝色的菌落，得出该菌能产生耐高温的-半乳糖苷酶，进一步验证该菌就是嗜热脂肪芽胞杆菌。1 材料与方法1.1实验材料1.1.1实验对象不同地方的温泉中的污泥里筛选若干菌，其中一种菌标记为3hao,由DSM88固体培养基分离筛选所得，并在实验室保存。1.1.2实验试剂革兰氏染色试剂：草酸铵结晶紫染液、碘液、95%的酒精、番红染液DNA提取试剂：溶菌酶、苯酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、乙酸钠、1mol/L Tris-HCL (pH7.4-8 , 25)、0.5mol/L EDTA(pH8.0)、浓盐酸、20%SDS(50ml)、NaOH、去离子水，PCR试剂：ddH2O、1oxbuffer、dNTPs 、引物1（27f）、引物2(1540r)、 Taq酶、DNA Marker、琼脂糖、1XTAE缓冲液、均为实验室提供配制；其他产品均为国产分析纯。1.1.3 实验仪器平板，250ml三角瓶若干个，接种环，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，干燥器，恒温鼓风干燥箱，恒温水浴锅，冰箱，PCR仪，相差显微镜，移液枪若干，电泳槽，荧光显微镜1.1.4培养基DSM88固体培养基：硫酸铵1.3g 硫酸钙50mg硫酸钴0.046mg硫酸0.25g硫酸锰22mg硫酸铜0.016mgKH2PO40.28gNACL1g硼酸0.5mg氯化铁0.02g蛋白胨1g酵母粉1g定容到1L PH7.0以乳糖为唯一碳源的培养基：乳糖 20g酵母粉 5g 蛋白胨10g 氯化钠 5g 琼脂 15g加入用0,25um的微滤膜过滤除菌的x-gal1.2 细菌的分离纯化 将样品中的污泥称量，用无菌水溶解稀释至10-6 ，分别取10-4,10-5,10-6 三个稀释梯度的悬液50ul涂布于DSM88固体培养基上，并做好标记。30恒温箱培养48h，挑取单菌落反复划线分离直至出现纯菌株，并进行革兰氏染色镜检，经纯化无杂菌者，用斜面接种保存4冰箱备用。1.3菌落形态与革兰氏染色特征观察将分离纯化出来的菌株，分别接种于DSM88固体培养基上进行培养，恒温箱培养24h后，分别进行革兰氏染色实验，恒温箱培养48h后，分别进行菌落观察，并记录该菌的菌落形态特征。1.4菌株的分子鉴定1.4.1细菌DNA 的提取采用溶菌酶裂解细菌释放DNA的方法，来提取DNA。挑米粒大小菌体+50微升溶菌酶+460微升1TE于离心管中,放入37摇床2小时以上（注意摇菌时，离心管要横放）；接着加入20SDS50微升+Pk5 10微升震荡混匀，放入55烘箱30-60min；然后再加入550微升苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）震荡混匀，12000rPm离心10min，吸取上清（不吸到中间渣滓，反复抽提2次）；取上清+2倍上清体积无水乙醇+0.1倍上清体积的乙酸钠，室温放置10min以上；将上述处理液12000r/min离心10min，弃上清，用70乙醇轻摇洗盐1-2次，再次离心5min，弃乙醇7；最后于37-55干燥（确保乙醇完全挥发干净，防止影响PCR），溶解沉淀的DNA，并采用琼脂糖凝胶电泳法检测是否已提取到DNA,检验合格的于-20冰箱保存备用。1.4.2 16SrRNA基因扩增表1 PCR反应体系为252ulTable 1 the PCR reaction system of 25 2ul成分体积DNA模板1ul10xbuffer5uldNTPs4ul引物12ul引物22ulTaq酶0.3ul加ddH2O至50ul扩增程序如下： 1、预变性 94 4min2、变性 941min3、退火 56 1min4、延伸 72 2min5、GOTO 30cyc6、72延伸10min7、在10下保温取5ul扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电压为90v，琼脂糖凝胶为1%，EB染色20min后，用凝胶成像系统观察电泳结果并拍照。1.4.3 16SrRNA基因扩增产物的序列测定将保存的菌种的DNA直接送到生工生物工程（上海）股份有限公司测序部完成测序，这些菌测定的DNA序列要以双链碱基互补的结果为准。 1.4.4 DNA序列分析将所测的分离株的16SrRNA基因序列与GenBank中已录有的相关序列，进行同源性分析，采用基因分析软件MEGA中的邻接法绘制系统发育进化树。 1.5 产耐热-半乳糖苷酶的验证实验将获得的纯种菌株在以乳糖为唯一碳源，x-gal作为显色剂的培养基中进行生长，看菌体是否能产生蓝色的菌落，若能则证明该菌能产生耐高温的-半乳糖苷酶，即证明该菌株是嗜热脂肪芽胞杆菌。2 ：结果及分析图1 菌3hao菌落 图2 菌3hao革兰氏染色Figure1 3haobacteria colony Figure 2 3haobacterium gram stain2.1 菌体菌落形态及染色特征经多次平板划线分离纯化，得出若干菌,其中一种菌编号为3hao，在DSM88固体培养基上划线培养，24h内进行菌落平板观察、拍照、记录，并进行革兰氏染色。经过平板划线及革兰氏染色观察可得到以下结果：菌3hao菌落类球形，呈乳白色，表面湿润。革兰氏染色后，在油镜下可看到短杆棒状，菌体为紫色，产芽胞，为革兰氏阳性菌。2.2 分子鉴定结果2.2.1 16SrRNA的扩增扩增后的产物经电泳后，可检测到16SrRNA在1500kb有较亮的特异性条带，如下图所示: 图3 16SrRNA的PCR扩增产物 Fgure 3 16 SrRNA PCR amplification products 3hao: 分离菌株3hao的16SrRNA的PCR扩增产物 0：空白对照 3hao ：isolates b 16SrRNA PCR amplification products 0: ck 2.2.2 16SrRNA的测序结果经测序之后，菌3hao的16SrRNA对应的DNA序列如下，即：3haoGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCCGCAAGACCGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAAACCGAAGACCGCATGGTCTTTGGTTGAAAGGCGGCCTTTGGCTGTCACTTGCGGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCGACGCCGCGTGAGCGAAAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTTGTGAGGGACGAAGGAGCGCCGTTCGAAGAGGGCGGCGCGGTGACGGTACCTCCGAGGAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAGCGCGCGCAGGCGGTCCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGACTGAGTGCAGGAGAGGAGAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGGGCTCTCTGGCCTGCAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCTAAACGATGA2.2.3 DNA序列分析选取GenBank中已发表的相应序列与该序列进行同源性比对分析，并用分析软件MEGA中的邻位相连法构建包含分离菌株的相应进化树，所得进化树如下在NCBI中对分离的菌株进行同源性分析，分离菌3hao与相关菌的16SrDNA基因间同源性关系，结果如下：表分离菌与相关菌的16SrDNA基因间同源性关系Table 16 SrDNA gene homology relationships among isolates S and two related bacterias菌株BLAST相似性3haoGeobacillus stearothermophilusKJ72252799Geobacillus stearothermophilus KJ095002.1 99表分离菌与相关菌的16SrDNA基因间同源性关系Table 16 SrDNA gene homology relationships among isolates S and two related bacterias由进化树分析可得，所有菌株都属于同一属即为嗜热脂肪芽胞杆菌属由表中在NCBI分析可得出，3hao菌与Geobacillus stearothermophilusKJ722527 Geobacillus stearothermophilus KJ095002.1同源率最高，相似性高达100%，即该实验分离出的菌株3hao为嗜热脂肪芽胞杆菌。2.2.4嗜热脂肪芽胞杆菌的验证实验图43hao菌株的验证试验Figure 4 the Verification test of 3hao bacteria将获得的纯种菌株在以乳糖为唯一碳源，x-gal作为显色剂的培养基中进行生长，由图可知，菌体产生了蓝色的菌落，这说明该菌株能产生耐高温的-半乳糖苷酶，即证明该菌株是嗜热脂肪芽胞杆菌。3 讨论3.1 细菌菌株的鉴定本实验先用传统的方法：菌落形态观察，革兰氏染色，在以乳糖为唯一碳源，x-gal作为显色剂的培养基中进行生长验证等一系列生化实验，但这并不能准确得出该菌种属；然后提取该菌株的全基因组DNA，再以细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，采用国际上常用的16SrDNA直接测序法，通过与国际上收录的序列做同源比对，系统进化树分析，可准确且快速地得出该菌与嗜热脂肪芽胞杆菌具有最高同源性。结合这两种方法，可确定该菌为嗜热脂肪芽胞杆菌。3.2细菌菌株的验证从16S rRNA的系统进化分析可准确地鉴定出，菌5-1为嗜热脂肪芽胞杆菌属，是典型的该属菌种，但为了进一步提供充足的证据，对该菌又进行了一定的生理验证试验。在以乳糖为唯一碳源，x-gal作为显色剂的培养基中进行生长，该菌株能产生蓝色的菌落，即可得出该菌能产生耐高温的-半乳糖苷酶，从而确定该菌是嗜热脂肪芽胞杆菌。33高温菌的研究意义本实验建立了分离和鉴定嗜热高温菌的方法，筛选出嗜热脂肪芽胞杆菌，这为进一步开发利用高温嗜热菌的耐热酶等宝贵资源，奠定了良好的基础。同时本试验筛选出的嗜热脂肪芽胞杆菌具有很好的应用前景，该菌株能够产生耐高温的-半乳糖苷酶。-半乳糖苷酶,又称乳糖酶,主要催化水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖。它可用于生产低乳糖食品,改善乳制品的风味和营养,解除乳糖不耐受患者因食用乳制品而引起的腹泻、腹胀等多种不良反应,除了具有水解能力外,该酶在水解糖过程中还会发生转糖苷反应,生成具有多种生理功能的低聚半乳糖(GOS)。 因而,近年来有关-半乳糖苷酶的研究与开发受到广泛的重视因而本试验为进一步有关-半乳糖苷酶的研究提供了优良的菌种资源。4 结论通过该实验所建的16SrRNA进化树可知：菌3分离株与Geobacillus stearothermophilus在同一个分支上，为嗜热脂肪芽胞杆属与Geobacillus stearothermophilusKJ722527 和Geobacillus stearothermophilus KJ095002.1同源率最高，相似性高达100%。结合传统方法及16SrRNA进化树的分析，可准确的得出，该菌为嗜热脂肪芽胞杆菌。该菌在以乳糖为唯一碳源，x-gal作为显色剂的培养基中进行生长时，能产生蓝色的菌落，进而说明该菌株能产生耐高温的-半乳糖苷酶，因而为该菌种属的鉴定