[医药]急性粒细胞白血病病人TAT、vWF、DD的检测及临床意义.doc

急性粒细胞白血病病人TAT、vWF、DD的检测及临床意义王红 姚宁河南省职工医院 河南 郑州，450000 通讯作者：姚宁 河南省职工医院血液内科 硕士研究生 邮箱：摘要 目的 检测不同类型急性粒细胞白血病病人不同发展阶段凝血酶-抗凝血酶复合物（thrombin antithrombin complex, TAT）、血管性血友病因子（von willebrand factor, vWF）、D-二聚体（d-dimer, DD）含量的变化，以探讨这些活性物质的检测在急性粒细胞白血病病人中的临床意义。方法 用ELISA及血液分析仪测定了急性粒细胞白血病病人和正常人血浆TAT、vWF、DD的含量，并对不同类型急性粒细胞白血病病人进行了不同出血程度、不同阶段的动态监测。 结果 急性粒细胞白血病病人初诊时血浆TAT、vWF、DD含量明显升高；急性粒细胞白血病病人治疗中vWF含量较治疗前显著升高；一个疗程的治疗后，达到完全缓解时，TAT在急性粒细胞白血病病人血浆中仍维持较高水平；急性早幼粒细胞白血病病人血浆TAT、vWF、DD含量在治疗前均高于其他类型急性粒白血病病人，应用维甲酸（ATRA）治疗第7天后与治疗前比较TAT、vWF、DD含量降低，DD水平在治疗第21天已降至正常水平，而TAT在达完全缓解时仍未降至正常。 结论 急性粒细胞白血病病人治疗前体内存在凝血，纤溶系统的同时激活及内皮细胞的损伤；不同出血程度的病人的出凝血机制不同，重度出血病人以体内纤溶系统的激活为主，轻度出血的病人体内以高凝为主，因此治疗上对于止血方案的选择应该有所侧重；急性粒细胞白血病病人化疗药物的应用在内皮细胞的损伤上起关键作用，治疗上应予以重视；疗程结束后，急性粒细胞白血病病人虽然骨髓已显示完全缓解，仍应该注意高凝状态的防治。关键词 急性粒细胞白血病；凝血酶-抗凝血酶复合物； 血管性血友病因子；D-二聚体Abstract Objective To measure the levels of plasma thrombin antithrombin complex(TAT), von willebrand factor(VWF), D-dimer(DD) in different phrases of patients with acute myeloid leukemia, and to explore their significance in the diagnosis and clinical therapy of Acute myeloid leukemia Methods acute myeloid leukemia patients and health adult were selected into the study. The levels of plasma thrombin antithrombin complex, von willebrand factor and d-dimer were measured by enzyme linked immunosorbent assay and blood analysis mechine. Results Compared with normal control group, plasma levels of TAT, vWF and DD were elevated before treatment in acute myeloid leukemia patients; During the treatment , plasma levels of vWF were much higher in patients than that before treatment; After complete remission, TAT remained high in Acute myeloid Leukemia; Compared with other AL patients, plasma levels of TAT, VWF and DD increased in APL patients before treatment. After treating the APL patients by ATRA for 7 days, we find TAT, vWF and DD content were lower than before, the difference is significant, The plasma levels of DD decreased into normal levels after treatment for 21 days, but the levels of TAT was not recovery. Conclusions Activation of the injury of vascular endothelium, coagulation and fibrinolysis existed in Acute myeloid Leukemia patients, Patient with severe hemorrhage should be treated with antifibrinolysis drugs, the prevention of hypercoagulability after treatment should be kept in mind.Keywords Acute myeloid Leukemia； TAT； vWF； DD急性粒细胞白血病病人存在不同程度的出血倾向，本研究通过检测出凝血因子在急性粒细胞白血病病人不同发展阶段及不同类型白血病病人中血浆含量的变化，初步探讨其辅助诊断及治疗的临床意义。病例和方法1. 研究对象1.1正常对照组：选择门诊健康体检者30例，其中男15例，女15例，年龄19-81岁，中位数年龄39岁，均无血液系统异常，无肿瘤、感染性、自身免疫性疾病及心、肺、肝、肾等重要脏器疾患，肝、肾功能及血糖均正常，近一个月无任何服药史。1.2患者组：急性粒细胞白血病病人50例，均为河南省职工医院2006年8月2012年1月住院病人：其中男29例，女21例，年龄13-74岁，中位数年龄36岁，根据临床表现、血像、骨髓细胞形态学及骨髓免疫学分型检查全部确诊为急性粒细胞白血病病例。选取的急性粒细胞白血病病人均为初诊病例，按天津会议制订的标准1进行分类：其中急性髓细胞白血病（AML）50例，包括M15例，M218例，M314例，M45例，M54例，M74例。确诊后，AML病人除APL外均使用HA（高三尖酯碱，阿糖胞苷）或DA（柔红霉素，阿糖胞苷）方案进行诱导缓解治疗；APL病人使用全反式维甲酸（ATRA）及柔红霉素的治疗方案；另外，将出血病人出血程度分为3级：0级为无出血症状；1级为皮肤瘀点，轻度牙龈或鼻腔出血，尿镜检红细胞阳性，粪隐血试验阳性；2级为皮肤大片瘀斑及注射部位出血，牙龈或鼻腔出血不止，肉眼血尿，黑便，眼底出血，颅内出血2。2. 检测方法2.1标本采集：所有病人均于清晨空腹采集肘静脉空腹血2ml，129mmol/l枸橼酸钠9：1抗凝，3000r/min,离心10min，分离血浆，放置于-80冰箱冻存待测；检测时置于37水浴箱内冻融，所有病例均同时检测血浆TAT、vWF、DD二聚体。2.2 采集时间：急性粒细胞白血病（除APL外）分别采集治疗前，治疗中第2天及化疗后骨髓达到完全缓解后血标本；急性早幼粒细胞白血病病人分别采集治疗前，治疗中第7、14、21天及化疗后骨髓达到完全缓解后血标本。2.3指标的检测：vWF、DD测定均采用美国自动血液凝固分析仪（型号Acl advance）进行检测；TAT测定采用ELISA方法。TAT含量测定ELISA试剂盒购自美国ADL试剂公司，VWF试剂购自美国Instrumentation laboratory公司，DD试剂购自上海太阳生物试剂公司。3.统计学处理采用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析，所有数据均以S表示，计量资料采用样本t检验或方差分析，检验水准=0.05。结果1 急性粒细胞白血病（AL）初诊病人治疗前血浆TAT、vWF、DD水平(结果见表1) 初诊的50例急性粒细胞白血病病人血浆TAT、vWF、DD水平明显提高，与正常对照组相比差异有统计学意义（P0.01）表1 急性粒细胞白血病初诊病人与对照组血浆TAT、vWF、DD水平(S)组别nTAT(ng/ml)vWF(%)DD(ng/ml)对照组302.441.3756.2819.2658.963.57初诊组5046.267.42*204.9322.87*542.75377.14*与对照组比较*P0.012 不同出血程度AML初诊病人血浆TAT、vWF、DD及PLT水平(结果见表2) 病例组中，2级出血组病人血浆TAT、vWF、DD水平较0级出血组明显增高（P0.01），血小板计数水平较0级出血组明显降低，2级出血组DD水平与1级出血组之间的差异具有统计学意义（P0.01）表2 急性粒细胞白血病不同程度出血病人TAT、vWF、DD、PLT水平 (S)组别nTAT(ng/ml)vWF(%)DD(ng/ml)PLT（109/l）0级出血组2533.956.50173.9422.08209.1167.8689.6523.201级出血组1575.575.89#210.8710.11#794.33147.87#37.7212.93#2级出血组1097.628.16*214.0080.69*&1101.53184.80*&7.012.56*&2级出血组与0级比较*P0.01，1级出血组与0级比较#P0.01，2级与1级比较&P0.013 治疗前急性粒细胞白血病病人不同类型间血浆TAT、vWF、DD水平(结果见表3) 治疗前急性早幼粒细胞白血病（APL）病人较其它类型急性粒细胞白血病（AL）病人的血浆TAT、vWF、DD水平增高，差异具有统计学意义（P0.01）表3 治疗前急性粒细胞白血病病人不同类型间血浆TAT、vWF、DD水平(S)组别nTAT(ng/ml)VWF(%)DD(ng/ml)APL组1480.620.59*#222.006.59*#1211.53194.01*#AML组(M3除外)3645.7713.62176.8630.20347.73289.42APL组与AML组比较*P0.01 4 急性髓细胞白血病（除APL）病人治疗前、中、后血浆TAT、vWF、DD水平并与正常对照组比较(结果见表4) 急性髓细胞白血病病人治疗第2天较治疗前vWF水平升高，差异有统计学意义（P0.01），疗程结束后，除TAT较正常组仍高外(P0.05)。表4 AML病人治疗中血浆TAT、vWF和DD水平(S)组别nTAT(ng/ml)vWF(%)DD(ng/ml)AML治疗前5045.7712.57184.8630.20389.53267.41AML治疗中5045.0913.07283.1630.23#388.59266.96AML治疗后5023.886.42*49.1141.6431.439.64正常对照组302.750.7767.2819.6541.966.57治疗中与治疗前比较#；治疗后与正常组比较* P0.015 急性早幼粒细胞白血病（APL）病人治疗前、中、后血浆TAT、vWF、DD水平并与正常对照组比较。（结果见表5） 急性早幼粒细胞白血病病人治疗第7天TAT、vWF、DD水平已明显下降，与治疗前比较差异有统计学意义(P0.01)； 治疗中第14天，TAT、vWF、DD水平均明显下降，较治疗前比较有显著性差异(P0.01)，但尚未降至正常水平，与对照组比较有显著性差异(P0.05)； 疗程结束后，病人TAT水平仍未降至正常水平，与正常组比较有显著性差异(P0.01)表5 急性早幼粒细胞白血病病人治疗中血浆TAT、vWF和DD水平(S)组别nTAT(ng/ml)VWF(%)DD(ng/ml)治疗前1480.628.20231.7969.801101.53184.80第7天1462.197.41*238.3724.77*481.75155.04*第14天1457.419.21166.6127.33117.8023.97第21天1434.605.66168.1122.5245.046.50&达CR时1422.314.00#68.5917.88#33.289.90#正常对照组303.56.750.7667.2818.6541.966.57治疗第7天与治疗前比较* P0.001；达CR时与治疗前比较比较#P0.05；达CR时与正常组比较 P0.01讨论急性粒细胞白血病是造血组织的原发恶性血液病，其特点是在骨髓及其他造血组织中有广泛的白血病细胞的异常增生，浸润其他组织器官，导致正常造血功能受抑制。近年来，随着环境的日益恶化，急性白血病发病率日益上升，在儿童和35岁以下人群恶性肿瘤死亡率中占第一位。在白血病病程中约1/2的病人有不同程度的出血倾向，已知弥散性血管内凝血（Disseminated Intravascular Coagulation, DIC）是急性白血病严重并发症之一，病死率高，发生率达6.8%-68%，其中急性早幼粒细胞白血病（Acute Promyeloblastic Leukemia, APL）的DIC发生率75%，病死率20%-40%3。急性白血病病人出血发生的原因很多，血小板量及功能改变、凝血功能障碍及纤溶系统亢进等都是其发病原因。研究表明4，白血病病人的出血、凝血功能障碍是普遍存在的病理生理变化，高凝状态是白血病病人并发血栓或出血的重要发病机制之一。急性白血病病人凝血障碍的主要问题是出血倾向，可能表现为高凝状态或血栓形成，发生率约在10%-40%5，多出现于疾病的早期，化疗或合并感染之后，临床上无明显的症状及体征，且常规的凝血指标也很难检测这种高凝状态。近几年的研究表明6，通过检测凝血激活的某些微量的分子标志物可反映体内高凝状态或血栓形成等情况。凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex, TAT)，是凝血酶与AT-结合后产生的灭活的蛋白酶/蛋白酶抑制物聚合体。在一般病理情况下凝血酶原转变为凝血酶，很快为抗凝血酶所中和，故直接检测凝血酶原含量困难较大，相比之下TAT可监测很小程度的酶原转化，且TAT能灵敏反映体内凝血情况，因此对DIC的早期诊断很有价值，此外，临床上通过对比观察TAT前后测定结果可监测体内抗凝及溶栓疗效，因此TAT已广泛应用于各临床科室对凝血和纤溶病理生理过程的诊断和监测。本实验结果显示，急性粒细胞白血病病人治疗前TAT水平明显高于正常对照组。提示急性粒细胞白血病病人治疗前体内存在一种高凝状态，可能是病人出血症状出现前的早期病理改变，其发生的原因可能为：（1）白血病细胞胞质颗粒的异常释放，这些颗粒可直接激活因子，进一步激活凝血酶原转变为凝血酶，致TAT含量升高。（2）白血病细胞侵犯血管壁，暴露受损的血管内皮细胞，激活凝血因子，不断产生凝血酶，引起血中TAT的含量增高。（3）凝血因子异常：Priest等于1982年发现在18例有血栓并发症的白血病病人中，其血浆纤维蛋白原、因子、含量明显增加。（4）白血病病人由于免疫力低下，常常合并感染，此时内毒素、炎症因子和激活的补体可通过直接或间接方式促进血管内皮细胞和单核细胞表达组织因子（Tissue Factor, TF），在血小板第因子存在下，激活外源性凝血途径，导致TAT的大量产生。另外结果提示：治疗后的急性髓细胞白血病病人的TAT水平虽有所下降，但是仍未能降至正常范围内，该结果与吴方等7的研究结果相符，认为急性髓细胞白血病病人在经过治疗达完全缓解后体内仍存在高凝状态，因此还需要注意此类病人化疗后的凝血状态的监测。血管内皮细胞简称内皮细胞，是附于全身血管内腔表面的单细胞层。目前已认识到血管内皮是个重要的代谢及内分泌器官，内皮损伤在急性白血病病人的凝血系统激活中起重要作用，可在血管损伤处介导血小板的黏附、聚集和血栓的形成7。vWF是血管内皮细胞合成、分泌的一种糖基化蛋白质，是血管内皮激惹和损伤的标志物之一，同时是因子的载体8,9。本实验结果显示：（1）急性粒细胞性白血病病人治疗前vWF水平明显高于正常对照组，其含量变化可能由于白血病细胞侵犯血管壁损伤内皮细胞，导致vWF合成增加并大量释放至血液中，同时肝脏网状内皮系统清除vWF能力下降。当vWF升高时可与活化血小板在暴露的内皮下层形成早期血栓，因此vWF可同时反映血管内皮受损及凝血激活状态。（2）急性粒细胞性白血病病人治疗早期vWF较治疗前升高明显，原因可能是疾病早期随着化疗药物的应用，大量白血病细胞破坏溶解释放至血液循环损伤内皮细胞，导致vWF的大量释放，提示病人在化疗期间，内皮细胞损伤严重，同时激活体内凝血系统并相互作用，导致病人出血机率增加，因此临床上对于急性粒细胞性白血病病人化疗方案及剂量疗程的选择上应慎重，尽量规范化疗的剂量及疗程，摸索更合理的用药方法和途径以减轻药物引起的血管损伤，必要时可加用保护血管内皮及抗血小板的药物。（3）另外，结果显示急性粒细胞性白血病病人经过一个或几个疗程的化学治疗后，随着骨髓的完全缓解，病人的vWF水平恢复正常，提示早期血管内皮的损伤已随着骨髓的缓解逐渐好转，由此可见化疗也是改善急性白血病病人出血状况的一项重要措施，因此临床上化疗药物的早期应用对病人的出凝血状态的改善也起到了间接作用。导致急性粒细胞性白血病病人出血的另外一个重要因素是纤溶系统的激活。其原因可能为：（1）白血病细胞释放组织因子（TF），癌性物质（CP）等促凝物质，激活凝血系统，导致血管内血栓形成，诱发DIC，继发纤溶。（2）白血病细胞分泌的弹性蛋白酶可降低纤溶系统的抑制物10。 D-dimer为纤维蛋白单体经活化因子交联后，再经纤溶酶水解产生的特异性降解产物，可作为体内高凝状态和继发性纤溶亢进的分子标志物之一11,12。本研究结果显示：急性粒细胞性白血病病人治疗前DD水平明显增高且重度出血组的DD水平较轻度出血组高，提示在急性粒细胞性白血病病人发病初期体内不仅处于高凝状态，尚有纤溶系统的激活，而通过比较轻度出血组与重度出血组各项分子标志物的变化，可知轻度出血病人出血机制以高凝占主要地位，而重度出血病人出血机制以纤溶系统的激活占主要地位。因此，提示我们在临床上对轻度出血病人应以补充纤维蛋白原，防治高凝为主；而在出血严重病人还应该联合使用抗纤溶药物。血小板数量及功能的异常也是导致病人出血的一个重要原因。Heddle等13亦在研究了血小板计数与临床出血危险率的关系后指出：当血小板计数在04109范围内时，出血危险率增加8倍；当血小板计数在510914109范围内时，出血危险率较当血小板计数2010929109 范围内时增加2倍。同时认为如果高凝状态及纤溶系统的激活未得到改善，尽管已使用血小板输注治疗，但病人出血危险率仍在成倍增加。在本课题中可看出重度出血组血小板数量较轻度出血组明显降低，提示出血的严重程度与血小板的数量及功能亦有重要联系。因此，临床上对于重度出血的病人，仅仅单方面的抗出血治疗是不够的，应注意综合多个方面的治疗，包括防治高凝状态、抗纤溶及血小板的输注治疗。急性早幼粒细胞白血病是一种特殊类型的急性髓细胞白血病，以15号染色体上急性早幼粒细胞白血病基因（PML）与17号染色体上维甲酸受体（RAR）基因所形成的融合基因是其分子学标志。出血是导致病人死亡的主要原因之一，且APL的出血发生率较其他类型白血病高14，据报道在并发DIC的病人中出血发生率约占60%，并发DIC的病人几乎每例都有出血倾向，APL早期出血死亡率达10%-20%，另外威胁生命的出血还可因细胞毒药物化疗而加重，在诱导化疗期间死亡率达10%-20%15,16。因此，选择合适的止凝血指标进行监测，防治止凝血功能紊乱是取得缓解的关键之一。本实验发现，治疗前APL病人TAT、vWF、DD水平较其它类型急性白血病高，说明APL病人出凝血机制较其它类型白血病有很大差别，在APL病人体内发现至少有三种肿瘤细胞促凝物质：（1）组织因子（tissue factor, TF），它是血液中主要的促凝物质，通过因子（F）形成复合物激活因子和，使凝血酶原转变成凝血酶，再形成纤维蛋白血栓。组织因子增多在DIC发病人中起重要作用，它是正常及恶性组织的促凝物质，在正常组织中主要表达在单核细胞和巨噬细胞中，在成熟的粒细胞中不表达，所以组织因子的表达部分依赖于细胞的分化程度17，已发现白血病细胞含有组织因子。一些研究17显示具有t（15;17）染色体易位的早幼粒细胞是NB4的TF抗原高表达，在APL的凝血异常中起重要作用。（2）癌性促凝物质（CP）：一种不依赖于因子F而直接激活因子的半胱氨酸蛋白酶，已在急性髓细胞白血病各亚型的原始细胞中发现，研究发现APL细胞中CP含量较其他白血病高10-80倍11,18。（3）APL病人中的细胞因子如TNF、IL-1等是间接的促凝物质通过活化其他组织细胞释放组织因子始动凝血。大量的促凝物质释放入血，激活因子，促进凝血酶的生成，激活凝血系统，继之激活纤溶系统，生成纤溶酶，后者降解纤维蛋白原，导致TAT、DD水平的异常增高19。近年来随着维甲酸（ATRA）的广泛应用，使APL病人的临床诱导缓解率得到很大的提高，大大减少了病人在化疗期间出血死亡率。其主要的止血 机制还是以抗凝为主，研究表明ATRA能够下调APL细胞肿瘤促凝物（CP）及组织因子（TF）的表达，增加APL细胞纤溶酶原激活物及其抑制物的活性，保持纤溶的平衡状态。总之，机体内凝血、抗凝及纤溶系统相互联系，互相影响，ATRA发挥抗凝作用的同时，部分地纠正了纤溶亢进。本研究发现：血浆中TAT、vWF及DD水平在APL病人治疗第7天时已明显下降；14天各标志物水平均下降，但未降至正常水平；治疗第21天时DD已降至正常水平，出血症状也基本缓解，早于骨髓达到完全缓解时。骨髓达到完全缓解时，除TAT外各项指标均恢复至正常水平。因此，急性早幼粒细胞白血病病人宜及早使用ATRA，抗纤溶治疗及小剂量应用肝素治疗，同时应加强血小板输注等支持治疗。 目前随着医药科技的发展，急性粒细胞性白血病的临床缓解率得到很大的提高，病人的生存质量也大大改善，如何降低病人出血死亡率成为众多学者关心的问题，通过检测病人血栓前状态标志物的血浆含量变化，可以更早期准确反映病人出、凝血状态，为临床诊断治疗提供至关重要的理论依据。机体内凝血、抗凝及纤溶系统是相互联系，互相影响的过程。 凝血、抗凝及纤溶系统间的动态平衡，直接影响急性白血病病人的出、凝血状态。因此，在监测过程中，应同时检测多个指标，不仅要考虑它们的单独作用，更要考虑它们的联合作用，这样才能较全面的揭示急性白血病病人的出、凝血状态，进而指导临床用药，最大程度的减少病人的出血和血栓形成，减少死亡率，改善病人的预后，提高生活质量。我们相信，随着病人血栓前状态标志物研究的进一步深入，将会在预测急性白血病病人的出、凝血状态方面起重要作用，而且也会对急性白血病的治疗提供帮助。参考文献1 张之南, 沈悌. 血液病诊断及疗效标准. 第二版. 天津科学技术出版社, 1998, 168-194.2 吴方, 徐志红, 杜萱, 等. 急性白血病并发出凝血特点及其预后的关系. 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