《实验室方法全集》word版.doc

实验室方法全集实验室方法全集11Western Blot Protocol22RT-PCR 的实验过程73细胞的冻存、复苏、传代和计数94外周血中提取DNA125组织中提取DNA136小鼠髓源性树突状细胞的提取和培养147细胞组织样品158原代培养人HSCs的表型确定189ELISA操作步骤：1810鼠尾胶原制备方法1911QIAEX II 试剂盒提取琼脂糖凝胶电泳DNA方法2012Ltn重组腺病毒扩增、纯化、滴度测定及鉴定2013狭缝印迹杂交2314细胞核蛋白提取步骤：2715EC were treated with IFN-(1000u/ml) for 72h to induce MHC class II.291 Western Blot Protocol1) 样品处理1培养细胞： 去培养液后用温的PBS冲洗23遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 胰蛋白酶消化细胞，PBS漂洗23次。 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上3060min。 12000g离心，4，2min。 取少量上清进行定量。 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer（终浓度为1）后，100，510min变性，低温储存，-70一个月，-20一周，4 12天。2组织： 匀浆 对于心肝脾肾等组织可每50100mg加1ml裂解液，肺100200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 12000g离心，4，2min。 取少量上清进行定量。将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer（终浓度为1）后，100，510min变性，低温储存，-70一个月，-20一周，4 12天。裂解液配方： Tris-Cl (pH7.4) 20 mMEDTA 1 mMNaCl 150 mMTriton X-100 1%(v/v)去氧胆酸钠 0.5cocktail 25ug/ml提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4及NaF各 1mM。4loading buffer配方： 甘油 40% TrisCl (pH6.8) 200mM 溴酚蓝 0.4SDS 8%DTT 200mmol/LBuffer可配成25，注意SDS终浓度勿超过10%。2) 配胶1 注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。2 各种不同浓度的胶配方见下表：分离胶(10ml)8胶12%胶15%胶积层胶(5ml)5胶H2O4.6 ml3.32.3H2O3.430%丙烯酰胺2.7 ml4.05.030%丙烯酰胺0.831.5M Tris (pH8.8)2.5 ml2.52.51.0M Tris (pH6.8)0.6310% SDS0.1 ml0.10.110% SDS0.0510% APS0.1 ml0.10.110% APS0.05TEMED0.006 ml0.0040.004TEMED0.0051.5M Tris (pH8.8): 98ml 水+Tris+2ml盐酸+微调1.0M Tris (pH6.8)：94ml 水+Tris+6ml盐酸+微调10%的APS最好现配现用，如在4存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉。30丙烯酰胺：29g丙烯酰胺亚甲基叉双丙烯酰胺，溶至终体积为100ml。丙烯酰胺浓度（）线性分离范围（kD）1512431016687.536945.0573 封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，一般可用ddH2O，待分离胶凝固后，将ddH2O倒掉。4灌好积层胶后，约3060min后小心拔除梳子、以免上样孔变形。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。3) 电泳1上样前将胶板下的气泡赶走。2所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1loading buffer上样，Marker也用1loading buffer调整至与样品等体积。2跑积层胶时以100V进行稳压电泳，跑分离胶时改为200V进行稳压电泳。3在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。5电泳液配方：Tris-base 15.1g, glycine94g, 50ml 10% SDS，溶至终体积1000ml。待用时稀释至1。4) 转膜1 浸泡硝酸纤维素膜：将膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。2将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），右下切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧2张滤纸，注意用玻棒逐出气泡。3转膜：湿转：转膜槽用去离子水淋洗晾干，加入1000ml转膜液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。将电泳槽置于冰水混合物中冷却。恒流200mA13h（不同大小蛋白转膜时间不同）。1转膜液配方： Tris-base 5.8g, glycine 2.9g, 0.37g SDS，200ml 甲醇，溶至终体积1000ml5) 封闭及杂交1封闭：将膜从转膜槽中取出， TBS-T稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡12h。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TBS-T将丽春红洗脱后封闭。2结合一抗： 抗体液制备：10mlTBS-T5脱脂奶粉（用于单抗）或胎牛白蛋白（用于多抗）0.02叠氮钠抗体（1：1000稀释）3洗涤：一抗孵育结束后，用TBS-T漂洗膜洗三次，每次5-10min。4结合二抗：根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:10001:10000），室温轻摇一小时。5洗涤：二抗孵育结束后，用TBS-T漂洗膜后再浸洗三次，每次510min。TBS-T：Tris-HCl 20mM, pH 7.4 (25) NaCl 150mMTween-20 0.05%封闭液: 5%脱脂奶粉(用于单抗)或胎牛白蛋白（用于多抗）的TBS-T一抗液： 0.2% 叠氮钠10ml封闭液一抗原液（一般按1：1000稀释）一抗溶液中加入0.2% 叠氮钠后4可长时间存放（至少2月）（六）发光鉴定一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。1HRP-ECL发光法：将A、B发光液按1：1稀释混合5min，将膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，滴加混合液于膜上，3min后用滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内（压膜过程中勿产生气泡），固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，曝光520min不等。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时间长达半小时，出现背景是正常的。6) 增强敏感性若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：1 用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。2 将膜在TBS-T中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。3 封闭4060min4 一抗杂交，室温1h。37 1h 会更强，但可能增加非特异条带。5 TBS-T洗膜20min，期间换2次液。6 二抗杂交，37 1h。7 TBS-T洗膜20min，期间换2次液。8 发光鉴定。9 若条带仍未出现或很淡，可以再用TBS-T洗涤膜20min，期间换2次液。10三抗杂交，室温1h。37 1h 会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。11TBS-T洗涤膜20min，期间换2次液。12发光鉴定。7) 再标记一张膜上可以同时标记很多抗体,但要注意，一般在两个目的蛋白相差在5KD以上的，最好先后两个抗体是不同的二抗。在两个目的片段相差小于5KD时，就需要经过处理,再标记了(Re-Blot)，有些公司有再标记的现成试剂，不过比较贵，最简单的方法是：ddH2O洗5分钟，0.2M NaOH5分钟，再用ddH2O，5分钟3次，然后可以再标记了。要做多个抗体的膜的选择,最好用PVDF或教坚固的，推荐用Amsham的Hybond-P，Hybond-Extra。有人最多在一张膜上做个10个不同的抗体。2 RT-PCR 的实验过程1) 组织提取总RNA（Trizol法）：1、 取50100mg 组织，加入1ml Trizol液研磨成粉末2、 研磨液室温放置5min，加入0.2ml氯仿,盖紧离心管，剧烈振荡离心管，冰上静置5分钟， 4下,12000g离心15min.3、 取上层水相约400ul于一新的离心管，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，-200C放置20min，4下12000g离心10min 。4、 弃上清，加入1ml的75%的乙醇，涡旋混匀，4 7500g或9000g离心5min。5、 弃上清，室温或真空干燥510min，然后将RNA溶于20-30l水中。若不用，可置于-80的冰箱中。6、 测浓度和RNA的质量：取2l的RNA加入98l的水中，测浓度和OD260/OD280。2) 细胞提取总RNA7、 收取6孔板悬浮及贴壁细胞，PBS漂洗2次，加入0.5ml Trizol液。8、 室温放置5min，加入0.1ml氯仿，盖紧离心管，剧烈振荡离心管，冰上静置5分钟， 4下，12000g离心15min。9、 取上层水相于一新的离心管，加入0.3ml异丙醇，颠倒混匀，-200C放置20min，4下12000g离心10min 。10、 弃上清，加入1ml的75%的乙醇，涡旋混匀，4 7500g或9000g离心5min。11、 弃上清，室温或真空干燥510min，然后将RNA溶于20-30l水中。若不用，可置于-80的冰箱中。12、 测浓度和RNA的质量：取2l的RNA加入98l的水中，测浓度和OD260/OD280。3) 逆转录过程13、 取一新的离心管,依次加入以下溶液：总RNA 0.15g（一般为2ug）随机引物 3ldd H2O 加至12l14、 70孵育5min后，冰上振荡2min15、 在冰上依次加入下列试剂：5reaction buffer 5l10mM dNTP混合物 2l逆转录酶 1l16、 42处理6090min17、 70处理10min，停止反应,放置冰上18、 逆转录后的cDNA，可继续作PCR反应或保存于-20。4) PCR反应在冰上按下列顺序依次加入：ddH2O 13.2lMgcl2 2ul10buffer 2.5ldNTP混合物 1l上游引物 1l下游引物 1l内参 up 1l内参 down 1lcDNA 2l Taq 聚合酶 0.3l最终反应体系总体积为 25l5) 温度循环 step1 94 4min step2 94 45sec step3 57 45sec (摸条件) step4 72 1min step5 重复step2 4，3035循环（摸条件） step6 72 10min step7 hold 4 enter end6) 琼脂糖凝胶电泳:19、 配制5TBE电泳缓冲液,其配制如下：一升溶液中含54 g Tris碱27.5g 硼酸20ml 0.5M EDTA (pH 8.0)20、 配制12%的琼脂糖凝胶:称重12g琼脂糖加入0.5TBE 100ml，微波炉加热1.5min，等温度稍低时加入溴化乙锭，使终浓度为0.5ug/ml。21、 将融化的琼脂糖凝胶放入电泳槽中，制成凝胶电泳板。22、 依次加入maker，混合标记物的扩增的PCR产物。在电压为100V的条件下电泳30min。23、 摄影:取出电泳后的凝胶，放于紫外线看有无PCR扩增产物的条带，最后在Kodak Digital 系统成像。3 细胞的冻存、复苏、传代和计数1) 细胞的冻存冻存细胞的原则是“慢冻”，细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻时，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列的不良反应，引起细胞死亡。减少冰晶的形成是减少细胞损伤的关键，目前多采用甘油或二甲亚砜（DMSO）作为保护剂。操作步骤： 选用对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存复苏后存活率极低，在冻存前一天最好换一次培养液。 用胰蛋白酶把细胞消化下来，悬浮生长的细胞不需要此处理。然后将细胞收集于无菌离心管中，1000rpm/min，5min离心。 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存液（含10DMSO或甘油、10血清的培养基），用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装于无菌冻存管，每管加11.5ml。 旋紧冻存管确保密封，用封口膜保护，标明细胞名称、冻存时间等信息。 标准的冻存程序为降温速率12/min，当温度达25以下时，可增至510/min，到100以下时，可迅速浸入液氮中。实际操作一般为：4冰箱内30min，20冰箱2h，80冰箱内过夜或数天，然后迅速浸入液氮中冻存。 液氮数量要定期检查，如发现液氮挥发一半时要及时补充。2) 细胞的复苏复苏细胞的原则是：“快融”，这样可以保证细胞外结晶在很短时间内立即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内再结晶对细胞造成损害。操作步骤： 从液氮容器中小心取出冻存细胞，用镊子夹住，立即放入37水浴中，轻轻晃动使其内容尽快融化。 从37水浴中取出冻存管，在超净台内用酒精消毒后开启，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管中并滴加10倍以上培养液，混合后1200rpm/min，5min离心，除去上清液，再用培养液洗、离心一次。 用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放入培养箱，次日换培养液一次，继续培养，如培养瓶内未贴壁细胞较多，则每天换液，直至无明显未贴壁细胞。3) 细胞的传代贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长但贴附不牢的细胞可用吹打法传代；悬浮生长的细胞可以直接吹打或离心沉淀后再分离传代。操作步骤：（1） 贴壁细胞的消化法传代： 倒掉瓶内的旧培养液。 以25cm2培养瓶为例，向瓶内加入1ml消化液，摇动培养瓶使之流遍所有细胞表面，然后倒掉消化液后再加入1ml新的消化液。 消化最好在37或25下进行，消化25min后把培养瓶置于显微镜下观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，立即倒掉消化液，终止消化。（如消化液中含EDTA，则加入PBS或Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶后倒掉液体，以洗去多余的EDTA。） 用弯头吸管，吸取培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打动作要轻柔，尽可能不产生泡沫，细胞脱离瓶壁后即成细胞悬液，吸取约一半分种至另一培养瓶或弃去。 往培养瓶中加入新鲜培养基，使终体积约为4ml，放入培养箱培养。（2）悬浮细胞的传代：将细胞连同培养液一并移至离心管内，8001000rpm/min，5min离心后弃去上清，加入新的培养基至离心管内，吹打成细胞悬液，然后传代接种。4) 细胞的计数（血球计数板计数法）操作步骤： 准备计数板：用无水乙醇或95乙醇清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布拭干。 制备单细胞悬液：务求细胞分散良好，本法要求细胞密度不低于104/ml，若细胞数很少，应离心后重悬。 加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，吸取少许，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，加样时不要溢出盖玻片也不能溢入两侧的玻璃槽内，否则应重新加样。 计数：计数方法见图，其原则为“计上不计下，计左不计右”。遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，入细胞团占10以上，说明消化不充分。 计算：细胞数/ml原液（4大格细胞数之和/4）104大 格大格大 格大格5) 细胞培养常用液体细胞培养常用的平衡盐溶液（g/L）PBSDulbeccoHanksD-HanksNaCl8.008.008.008.00KCl0.200.200.400.40CaCl20.100.14MgCl2.6H2O0.10MgSO4.7H2O0.20Na2HPO4.H2O1.560.060.06Na2HPO4.2H2O1.42KH2PO40.200.200.060.06NaHCO30.350.35葡萄糖1.00酚红0.020.020.02配制步骤：（以Hanks液为例） 按表中Hanks液各成分的含量准确称量 先将CaCl2溶解于100ml水中。 依次将其他成分逐个溶解于800ml水中。溶解时必须待一种试剂完全溶解后，再加入下一种试剂，直至所有试剂溶解后混匀。 酚红用数滴5.6NaHCO3将之溶解。 缓慢将100CaCl2液倒入于中，搅动，防止沉淀。 将酚红液加入到中。 补加水至1000ml混匀。 将混匀的Hanks液分装于盐水瓶内，120，20min，高压蒸汽灭菌，4冰箱内保存备用。 用水配制7.4NaHCO3溶液，过滤除菌，分装备用。 用无菌NaHCO3溶液调节Hanks液pH值至7.27.4。6) 培养基配制步骤： 将干粉型培养基溶于欲配制液体总量2/3的三蒸水中，冲洗包装袋两次倒入培养基中，加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌，以确保培养基干粉充分溶解。 按照产品包装说明的要求和实验需要补加NaHCO3。 调整培养液pH值：用预先配制的HCl溶液或NaOH溶液调整pH值至7.0左右（低于预定pH的0.20.3）。 补加三蒸水至最终体积。 将上述溶液用过滤法消毒除菌，所用滤器采用0.22um孔径。 将经过过滤除菌的培养基分装于贴有标签的无菌储液瓶中，盖紧瓶塞，并用封口膜保护，20冰箱保存备用。 待用培养基加入所需浓度（一般为10）的经56，30min水浴灭活的胎牛（或其他）血清，检菌后使用。7) 消化液 （1） 胰蛋白酶液：常用的胰蛋白酶有1：125和1：250两种，即一份胰蛋白酶可以水解125份和250份酪蛋白。常用胰蛋白酶的浓度为0.25，pH值为7.2左右。配制胰蛋白酶的液体应采用不含Ca+，Mg+和血清，以免降低胰蛋白酶的活力，影响消化效果。 配制方法： 称取所需胰蛋白酶。 加入无Ca+，Mg+平衡盐溶液（D-Hanks或PBS）。 磁力搅拌混匀，使其完全溶解。 过滤除菌、分装、备用。 （2） EDTA液：EDTA是一种化学螯合剂，主要作用在于螯合Ca+、Mg+，使细胞分离，对细胞毒性小，常用浓度为0.02，采用无Ca+，Mg+平衡盐溶液（D-Hanks或PBS）配制，高压灭菌后使用。 （3）胰蛋白酶和EDTA联合使用可提高消化效率，其浓度分别为0.25和0.02，但需注意的是EDTA不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。4 外周血中提取DNA1. 外周血分离提取PBMCs。2. 将细胞重悬于660ul STE溶液中，加入20mg/ml的蛋白酶K 15ul（终反应浓度为400ug/ml）和10%SDS 75ul（终浓度为1%），轻轻搅拌使溶液呈粘稠状，终反应体积为750ul。3. 50下水浴保温过夜，使充分裂解细胞，消化蛋白。4. 冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿混合溶液（酚和氯仿各375ul），温和地上下转动离心管混匀两相，反复10分钟，直至水相酚相混匀呈乳状。5. 4，12000g下离心10min，小心吸取上层粘稠水相移至另一干净离心管。如果样本溶解不好，再加1倍体积的STE溶液充分溶解，并重复离心。如果界面上有较多的白色物质，将上层水相转移至另一新管中，重新抽提。6. 加入等体积异丙醇，室温下摇动混匀，可见到白色丝状物，即为DNA沉淀。4，12000g下离心10min，弃上清。7. 立即加入适量70%乙醇中漂洗，4，12000g下离心10min，小心弃去上清。漂洗2次后在室温下挥发乙醇，不要使DNA完全干燥，（或EP管上覆盖一层滤纸，37烤箱放置1-3小时挥发水分和乙醇）8. 视DNA量加入20-50ul TE溶液（pH 8.0）或水重新溶解DNA。沉淀少时可加入1/10体积的3M乙酸钠溶液（pH5.2）。9. 取2ul样本加入98ul水，用比色杯测定DNA样本在260nm和280nm的OD值，判断DNA纯度和计算DNA浓度。 DNA纯度 OD260/OD280 （范围1.6-2.0为佳） DNA浓度 OD260*2500 （ng/ul）10. 根据各样本DNA浓度，将其定成统一浓度。 所需液体 STE液： 0.1mol/l NaCl, 10mmol/l Tris-Cl (pH 8.0), 1mmol/l EDTA (pH 8.0) TE液： 10mmol/l Tris-Cl (pH 8.0), 1mmol/l EDTA (pH 8.0) 10% SDS 20mg/ml蛋白酶K 70%乙醇3M乙酸钠溶液（pH5.2）异丙醇酚三氯甲烷5 组织中提取DNA1取冻存组织20mg置于碾钵中，加入适量液氮后，将其碾成粉末状。2用660ul STE溶解粉末，并移至一干净EP管，加入20mg/ml的蛋白酶K 15ul（终反应浓度为400ug/ml）和10%SDS 75ul（终浓度为1%），轻轻搅拌使溶液呈粘稠状，终反应体积为750ul。3 50下水浴保温过夜，使充分裂解细胞，消化蛋白。4 冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿混合溶液（酚和氯仿各375ul），温和地上下转动离心管混匀两相，反复10分钟，直至水相酚相混匀呈乳状。5 4，12000g下离心10min，小心吸取上层粘稠水相移至另一干净离心管。如果样本溶解不好，再加1倍体积的STE溶液充分溶解，并重复离心。如果界面上有较多的白色物质，将上层水相转移至另一新管中，重新抽提。6 加入等体积异丙醇（750ul），室温下摇动混匀，可见到白色丝状物，即为DNA沉淀。4，12000g下离心10min，弃上清。7 立即加入适量70%乙醇中漂洗，4，12000g下离心10min，小心弃去上清。漂洗2次后在室温下挥发乙醇，不要使DNA完全干燥，（或EP管上覆盖一层滤纸，37烤箱放置1-3小时挥发水分和乙醇）8 视DNA量加入20-50ul TE溶液（pH 8.0）或水重新溶解DNA。沉淀少时可加入1/10体积的3M乙酸钠溶液（pH5.2）。9 取2ul样本加入98ul水，用比色杯测定DNA样本在260nm和280nm的OD值，判断DNA纯度和计算DNA浓度。 DNA纯度 OD260/OD280 （范围1.6-2.0为佳） DNA浓度 OD260*2500 （ng/ul）10根据各样本DNA浓度，将其定成统一浓度。所需液体 STE液： 0.1mol/l NaCl, 10mmol/l Tris-Cl (pH 8.0), 1mmol/l EDTA (pH 8.0) TE液： 10mmol/l Tris-Cl (pH 8.0), 1mmol/l EDTA (pH 8.0) 10% SDS 20mg/ml蛋白酶K 70%乙醇3M乙酸钠溶液（pH5.2）异丙醇酚三氯甲烷 6 小鼠髓源性树突状细胞的提取和培养1. 68周龄小鼠1只，脱颈椎处死，酒精浸泡。2. 小鼠腹部朝上，镊子夹起大腿根部剪开皮肤后，剥下大腿皮肤至足踝处，完整取下大腿。剪皮和断骨注意更换剪刀和镊子。3. 将大腿放入碘伏中浸泡5分钟后冲洗干净。4. 将股骨和胫骨连接处的肌腱剪断，剪去两骨的骨骺端，暴露骨髓腔。注意既要开放骨髓腔便于下一步的骨髓腔的冲洗，又要使骨骺端的骨质尽量剪的少一些，因为骨髓细胞主要集中在骨骺端。5. 将开放了骨髓腔的骨头泡在1640内，以保持细胞活性。6. 使用l注射器冲洗骨髓腔，冲洗液可用1640、PBS或0.9的生理盐水。从骨头的两端分别冲洗，反复多次，直至骨头发白为止。7. 冲洗完全的液体呈淡粉红色，混浊，可见许多细胞团块。8. 收集液体，用滴管将细胞打散。9. 1800转离心5分钟。10. 弃上清，加入35ml红细胞裂解液，去除骨髓细胞中的红细胞，注意混匀。11. 1800转离心5分钟。12. 弃上清，加35ml冲洗液洗去红细胞裂解液。13. 1800转离心5分钟。14. 弃上清。15. 加入有10胎牛血清的1640适量。注意充分吹打细胞，制成细胞悬液，避免铺板时细胞分布不均匀。16. 一般一只小鼠的骨髓细胞铺一个6孔板。每个孔内约11.5ml细胞悬液。17. 37二氧化碳孵箱孵育2小时。18. 轻轻摇晃6孔板，吸去未贴壁细胞和板内液体。重新加入1640，显微镜下观察，若漂浮的团块状细胞已经洗尽，则不需要再次洗板，若仍有较多团块状细胞，可重复洗板1次。注意洗板次数12次即可，避免损失细胞。19. 洗板后，每孔加入含10胎牛血清的1640 1.5ml，GM-CSF 4-5ng/ml，IL-4 2-3ng/ml。37二氧化碳孵箱孵育。细胞培养第0天。20. 因孵箱中水分蒸发，可隔天补液一次，即在第2天，每孔补加200ul 1640培养基，保持每孔液体在1.5ml左右。同时半量补加GM-CSF（2-2.5ng/ml）和IL-4（1-1.5ng/ml）。21. 若要获得不成熟树突状细胞，可在细胞培养第4天收集细胞。若要得到成熟树突状细胞，可在第3天加LPS，LPS刺激24小时后，第4天获得成熟树突状细胞。一般本培养方法在细胞培养第4天，树突状细胞生长达高峰，第5天细胞开始减少，巨噬细胞明显增多。7 细胞组织样品1. 肝细胞的分离和培养分离方法：1. 肝组织展液的制备 将肝组织放在前灌流液(含EDTA 0.019，pH 74，一定浓度的抗菌素)中带回实验室，剪去外露明显的血管和胆管组织。前灌流液(预先在37水浴箱中浴热)用BRAUNULE穿刺针从管腔残端灌入，约35次，每次20 m1，尽量冲净肝组织中残存的血细胞，见肝组织呈谈红色或淡黄色，后用005的胶原酶IV型水溶液15m120 m1，缓慢灌入34次，每次约5min8min，胶原酶IV型可以重复使用，每次使用前均应在37水浴箱中浴热以保持酶活力。待肝组织韧性消失，压迫不易恢复，肝包膜下有时呈粒状时，放入平皿中、用眼科镊剪去除被膜及肝组织内肉眼可见的管道系统，然后连同灌注流出的胶原配溶液放入锥形瓶中，在37水浴箱中振荡消化10min。用培养液终止反应制成混合肝细胞悬液。2. 分离培养肝细胞 取混合肝细胞悬液用200目尼龙布过滤，50g离心3min。留下上清液作分离肝窦状间隙的内皮细胞用。用1640培养液反复离心3次，每次50g离心3min，以清洗残存的胶原酶和纯化肝细胞，在显微镜下观察肝细胞形态及纯化状态；用0.4锥兰染色判断细胞活率，血细胞计数板计数细胞浓度。以1640合成培养基(含10AB型人血清)细胞混悬液稀释至2l0E5m1后分别接种在培养瓶和六孔培养板上。在37、5CO2条件下先培养l 8h20 h，换液去除残存血细胞，再用同样培养基培养7d一10d。2. 间质细胞的分离和培养a.肝寨间隙内皮细胞分离、培养： 取分离肝细胞后的上清液，用50g离心3min和500g离心5min交替离心35次，去除残存的肝细胞，同时用1640培养液清洗残存的胶原酶。分出的细胞主要为肝内皮细胞和枯否氏细施的混合悬液。用0.4锥兰染色判断细胞活率后，接种在培养瓶中。3h4h后，将合有未贴壁的细胞及培养液接种在6孔培养板上。先培养20 h，换液去除残存的血细胞后，再用M199合成培养基(含10AB型人血清)继续培养7d10d。肝窦内皮细胞位于肝窦，将肝窦腔与窦周间隙（或称Disse间隙）分隔开来，SEC 细胞边界清楚，沿窦壁呈扁平状，细胞膜不连续，具有窗孔化结构，细胞体向窦腔内轻度突起，细胞质内有丰富的大小、形状不一的小泡，可见线粒体、扁平状的粗面内质网和发达的高尔基复合体，远腔面还可见微管，无W-P 小体。SEC具有重要的功能，它参与造血干细胞在肝小叶! 区的选择性种植；在体外可吞噬大量内源性和外源性的物质；在正常状态下可清除直径230nm的胞体物质，并且这种吞噬功能不随年龄而变化；SEC 对修饰的低密度脂蛋白（LDL）、乙酰化LDL及许多脂蛋白; 有高度亲和性。此外，SEC 具有脂酶受体，能分解循环内脂蛋白，控制胆固醇及其他成分的释放等。b.肝脏星形细胞的功能：有两方面的功能，一是储存脂肪及维生素A，另一是产生胶原纤维，在肝的病理性损害中，可增生并转变为成纤维细胞，与肝硬化有关。分离、培养：将前灌流液、胶原酶溶液(0.05)预热于37度水浴，取肝脏标本置于玻璃乎皿中，以D-Hanks液清洗表面残存血液，用止血钳持双面刀片修整肝脏表面，暴露门静脉血管，按血管直径大小选用适当塑料插管针，以前灌流液进行灌流，直至肝组织呈灰白色，肉服观察流出的液体透明已无明显血的颜色时，改用胶原酶溶液灌流，直至肝组织完全软化：将灌流的胶原酶及肝组织置于平皿中，以镊子撕碎肝组织，并剔除门脉结缔组织及肝包膜，用玻璃吸管吹打，使肝组织完全分散，再转人三角烧瓶中，于37度振荡消化10min，将细胞悬液通过三层纱布过滤人2只50ml离心管、4度下500*g离心5min，吸弃上清，每管加入DMEM充分悬浮细胞后，50*g离心90s，取上清，如此50*g离心洗涤3次，合并3次离心之上清，50*g离心收集细胞，用DMEM悬浮后再次50*g离心90s，取上清收集细胞，将细胞悬浮在含10小牛血清的DMEM内，调整细胞浓度为1*10E6个ml后接种于玻璃培养瓶或含盖玻片的培养扳中，12h后第1次换液，24h后第2次换液，以后每23d换坡1次，待细胞铺满时，以0.25胰蛋白药消化35min，收集消化细胞，以DMEM充分悬浮细胞，50*g离心2min，收集上清中的细胞，以2*10E5个ml接种传代。c.Kupffer细胞的功能：由血液内的单核细胞转变而来，具有很强的吞噬功能，能吞噬和清除来自肠道和血液中的异物及细菌等有害物质，还能破坏衰老的红细胞，分解血红蛋白，形成胆红素。kc是体内最大的固定型巨噬细胞群，它在多种因素所致的肝损伤(包括肝移植)及其继发病变中起着至关重要的作用：研究表明，Kc通过自身或与肝细胞、贮脂细胞的相互作用，释放细胞因子(如TNF、白介素)、No等，参与急、慢性肝损伤和肝纤维化的调控。因此，建立稳定、简便、经济、可靠的Kc的方法，对于研究各种因素所致的肝急、慢性损伤的发生、发展及调控义有重要的现实意义。分离和培养： 大鼠分离 1.常规3的戊巴比妥钠腹腔麻醉、开腹后，经门静脉注入肝素(125Uml)5ml。2.取下肝脏，以无Ca、Mg而含EDTA的灌注液沿肝脏断面血管灌注，同时剪断下腔静脉放血，直至肝脏变白后，以005的IV型胶原酶按同样方法灌注，37度消化1520 min，待肝脏变软后小心剥离肝包膜并制成细胞悬液。150目网筛过滤。3.将以上滤液用50*g(500 rmin)x 2min离心4次(每次用50ml的Hanks液洗细胞)，取前3次上清。4.将以上清液以500*g(1500rmin)*3min离心，弃沉淀。5.加20ml洗液，混匀后50*g*2min离心2次。6.重复4和5。7.500*g*3min离心2次，弃上演。8.加适量含20新生小牛血清的DMEM，台盼蓝染色判断细胞产率和存活率。培养 细胞按35Xl06d接种于培养瓶内，培养基为DMEM，其中含20小牛血清、15mmol/LHEPES、0. 05Uml胰岛素、15mmol/ml L-谷氨酞胺、l00Uml青霉素和100ug/ml的链霉素：置5CO2、95空气培养箱中37度培养，4h后换液，以后每2448h换液1次。鉴定 光镜下新分离的Kc在倒置显微镜下呈圆球形，折光性强，直径约20um，悬浮于培养基中，4h后见大部分已贴壁，呈扁圆形，极少量细胞已开始伸突，24h见大量细胞伸展生长，48h时细胞已完全展开，细胞体积明显增大，外形不规则，细胞呈现典型的星形或多角形，边界不清楚，胞浆透明，有时可见吞噬颗粒，胞核呈肾形。SP免疫组化染色显示，原代培养2d的Kc细胞的lysozyme阳性率在90左右，而desmin、factorVIII相关抗原未见明显阳性。相差显微镜下见Kc细胞胞浆内有大量吞噬的latex beads颗粒。透射电镜观察见kc表面有发达的微绒毛和伪足胞浆内含有大量的溶酶体和吞噬的latex beads颗粒的吞噬溶酶体。 d.肝脏淋巴细胞的分离：小鼠 常规取小鼠肝脏，充分剪碎肝脏组织，置100目尼龙网上轻轻研磨，同时用3040ml含2小牛血清的HBSS液冲洗，滤液转入50ml试管中冰上静置5min，将上清置另一试管中44度800r/min,离心10min，细胞沉淀用40percol1淋巴细胞分离液悬起并混匀,室温2000r/min离心20min，小心吸去上层肝脏实质碎片及上清，细胞沉淀用HBSS液洗涤2次后，加入红细胞裂解液置冰浴上5min，加入9倍体积的HBSS液终止反应，离心后再用HBSS液洗涤2次，台酚蓝染色后观察细胞活力。为了减小机械研磨对肝脏淋巴细胞活性的影响，改用酶消化法制备肝脏单细胞悬液，消化液为含0.05胶原蛋白酶IV和0.001DNA酶I的1640培养液,肝脏剪碎成1mm3，37度水浴振荡消化30min，后续步骤相同。 e. 肝内胆管上皮细胞的分离和培养：大鼠经巴比妥钠(每公斤50mgm1皮下注射)麻醉后按无菌操作开腹常规门静脉插管胶原酶灌流充分消化。取整个消化肝脏，仔细剥离肝脏表面的被膜，切碎后加MEM培养液稀释。经0.5mm直径不锈钢网过滤后，取残留于不锈钢网上的组织碎片，置于培养皿中加入MEM培养液后振荡游离肝实质细胞，分离出呈白色的肝内胆管。将肝内胆管置于含0.25胰蛋白酶及0.1胶原酶的消化液中37振荡50分钟至1小时。振荡后500g离心离心所得沉淀物用MEM稀释后，置于50与30Percoll非连续密度梯度上1800 g离心30分钟。取50与30Percoll二层密度梯度间的细胞，MEM培养液洗净后500 g离心5分钟。取沉淀细胞于WE培养液中台盼蓝染色判定细胞存活率。取细胞存活串95、谷氨酰转肽酶染色阳性细胞70的分离细胞，调节细胞数至0.510E5个m1接种培养。接种细胞于胶原被覆35mm塑料培养基上，WE培养液培养。培养液中含10FBS及0.25ugml胰岛素、100 Uml青霉素、100Um1链霉素及地塞米松。5CO2、40O2环境下培养24小时后，应用无血清WE培养液多次清洗，然后加入含10ugm1SLPS WE培养液37培养15分钟。WE培养液清洗后进行免疫荧光染色。末加入sLPS WE培养液的培养细胞为空白对照。接种细胞于胶原被覆玻片培养板上，上述相同条件下培养24小时。培养后应用无血清WE培养液多次清洗，然后加入含10ugm1SLPS WE培养液37培养，培养3小时、6小时、9小时后进行荧光原位杂交，显示细胞TNFmRNA表达。3. 肝脏细胞器的分离a. 肝细胞线粒体的分离：大鼠 所有操作过程均在4条件下进行。将肝组织用生理盐水洗净，滤纸吸净水分，去除脂肪及结缔组织剪碎后，放入组织匀浆器中，加入适量0.25mol/L蔗糖1mmol/L EDTA溶液，pH7.6，匀浆直至把组织全部匀浆。合并匀浆液，1000g离心lO min，留上清去沉淀。取上清7000g离心l5min，去上清留沉淀沉淀即为线粒体粗制品。再向沉淀中加入适量0.25mol/L蔗糖1mmol/L EDTA溶液，pH7.6匀浆化后再以7000g离心l5min重复3次即得黄褐色线粒体颗粒。沿试管壁用吸管缓慢加入25Tris磷酸戊二醛溶液2m1，静置2h后，线检体即被固定。常规漂白脱水，用环氧塑脂包埋48h后，制超薄切片，醋酸铅铀双重染色，透射电镜下观察。功能：线粒体是肝细胞中的动力部分，可长生大量ATP，线粒体内含有丰富的酶和辅酶（70种以上）、维生素，包括三羧酸循环中的各种呼吸酶、细胞色素氧化酶、细胞色素还原酶、转氨基酶、脂肪酸氧化酶等各种酶。它的功能与蛋白质、脂肪和糖的需氧代谢有密切关系，并且还能将单酰乙酸转变为脂肪酸及脂肪，也可合成糖。此外，尚有运送细胞质内代谢产物。b. 人肝微粒体的制备 用超速离心法，新鲜人肝，称重，于3倍量体积的TrisHcl缓冲液中，用搅碎机绞碎；然后用匀浆机匀浆。上述操作均在4度以下冰浴中操作。匀浆液于9000*g离心20min，取上悬液于10000*g离心30min，弃去上清液，沉淀为人肝微粒体。在0.25mol/L蔗糖溶液中制成悬浮液，液氯中保存。c. 成功分离培养人HSCs的基础上3，Zhu YH, Hu DR, Xie Q, Nie QH, Liu GD, Tan ZX, Wang YL. Isolation, culture and identification of hepatic stellate cells from normal human liver. Xibao Shengwuxue Zazhi, 1999;21:insert8 原代培养人HSCs的表型确定8.1 形态学观察 刚分离接种的HSCs在倒置显微镜下为折光性很强的圆球，远小于肝细胞，原代培养12h后，细胞即贴壁，少量开始伸展，48h后细胞大多数伸展，一部分细胞出现多角突起，呈现星状外形，胞质中脂滴明显. 培养至d10时，细胞接近铺满，胞质中脂滴不明显. 细胞面积明显增大，此时细胞呈现典型的成纤维细胞样形态，传代后细胞保持典型的成纤维细胞形态不变. 8.2 PCNA、型前胶原及-SMA免疫细胞化学染色 正常人HSCs在原代培养24h后即可见极微弱的PCNA表达，型前胶原及-SMA表达阴性，原代培养d10时，PCNA、型前胶原及-SMA表达明显阳性(图14)，传代后染色特点与原代培养d10无明显区别.HSCs又称为储脂细胞、Ito细胞、窦周脂肪细胞及储存维生素A细胞等4，该细胞是肝脏的一种非实质细胞. 正常肝脏中，HSCs处于静息状态，其增殖活性很低，仅合成少量细胞外基质(ECM)成分，其主要生理功能为摄取并储存维生素A等1. 病理情况下，HSCs被激活，其表型由静息型转变为激活型. 目前普遍认为，激活的HSCs为肝纤维化时产生各种ECM成分的主要细胞群1，2，同时也是调节肝脏中ECM降解的关键细胞群5. 此外，激活的HSCs在门静脉高压的形成中也可能发挥重要作用6. HSCs激活后呈现出一些显著的生物学特点：典型的成纤维细胞